引用本文： 吉九威, 宋衛東, 趙海平. 雷帕霉素對胰性腦組織損害保護作用的機制研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(7): 869-874. doi: 10.7507/1007-9424.202109088 復制
胰性腦組織損害（pancreatic brain tissues injury，PBTI），以往稱之為胰性腦病（pancreatic encephalopathy，PE），是重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）并發的一種腦組織病變，由Rothermich 等[1] 于1941年首次提出，因為研究者們對于PE發病機制認識不足，且沒有明確的診斷標準，所以現多數學者稱之為PBTI[2-3]。PBTI主要表現為定向力障礙、意識模糊、煩躁、幻覺、撲翼樣震顫等精神神經障礙[4]。PBTI的發病機制尚不完全清楚，認為是多種因素共同參與的結果[5]，僅有幾種學說解釋了該病的發病機理，如胰酶激活學說、維生素B1缺乏、代謝障礙學說和炎性介質與信號通路學說[6-7]，但具有維持蛋白合成、細胞存活、生長、凋亡、調節炎癥反應等作用的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路對PBTI的影響目前仍未見國內外學者報道[8]。本研究選擇mTOR信號通路的特異性抑制劑雷帕霉素（rapamycin，RAPA）作為干預藥物，探索RAPA對實驗大鼠PBTI是否具有保護作用及其可能的保護機制。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要材料和儀器
清潔級雄性SD大鼠90只，290～320 g，7～8 周齡，購自遼寧長生生物技術股份有限公司；動物手術器械、動物手術臺、5%牛磺膽酸鈉（購自北京索萊寶科技有限公司）、亞甲藍注射液、0.9%生理鹽水、盧卡斯快藍（Luxol fast blue）染色液（購自北京雷根生物技術有限公司）、RAPA、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和蛋白印跡（Western blot） 相關試劑（美國Sigma公司）。
1.2 方法
1.2.1 實驗動物分組
所有實驗大鼠術前適應性喂養1周，按拆信封法隨機分成3組：假手術組（sham operation，SO ）組、SAP組和RAPA組，每組 30 只大鼠；每組大鼠再按隨機數字表法分為 24 h、36 h 和 48 h 亞組，各亞組 10 只大鼠。
1.2.2 SD大鼠SAP模型的制備
實驗大鼠術前12 h禁食，不禁水，參照吉九威等[9]SAP大鼠模型制備法建模。
1.2.3 3 組大鼠的處理
SAP組大鼠注射5%牛磺膽酸鈉（2 mL/kg）與亞甲藍（0.1 mL）的混合液，SO組大鼠與SAP 組大鼠的手術處理方法相同，不同點是SO組大鼠將注射的藥物替換為0.9%生理鹽水（2 mL/kg）與亞甲藍（0.1 mL）的混合液，RAPA 組大鼠的處理方法和注射藥物與SAP組相同，只是在麻醉前30 min經腹腔注射RAPA（1 mg/kg）。
1.2.4 腦組織中磷酸化mTOR（phosphorylated mTOR，p-mTOR） 和磷酸化核糖體40S小亞基S6蛋白激酶（phosphorylated ribosomal 40S small subunit S6 protein kinase，p-S6K1） 表達水平的檢測
SAP組、SO組及RAPA組中的各時點亞組大鼠分別于術后24 h、36 h及48 h給予腹腔注射10%的水合氯醛溶液（3.3 mL/kg），完全麻醉后行開胸手術，直視下采用右心房穿刺放血法處死相應亞組存活的全部大鼠，處死后立即完整切取相應腦組織，標本分為兩部分備用，一部分行HE染色和Luxol fast blue染色；另一部分采用Western blot法檢測腦組織中p-mTOR（其相對分子量為289×103）和p-S6K1（其相對分子量為59×103）的相對表達水平（操作按試劑盒說明書進行），利用近紅外激光成像系統掃描并對條帶進行分析，以目的條帶與內參條帶吸光度的相對值作為結果進行分析。同時切取相應大鼠胰頭部位的胰腺組織，用10%中性甲醛溶液固定保存，行HE染色以明確SAP大鼠是否建模成功。
1.2.5 腦組織及胰腺組織的HE染色
參照吉九威等[10]的方法行常規HE染色，觀察腦組織中神經元、膠質細胞及腦血管的病理學變化并對腦組織損害程度進行評分；同時觀察胰腺組織是否出現腺泡出血、壞死等病理改變以明確SAP大鼠是否建模成功。
1.2.6 腦組織的Luxol fast blue 染色
將石蠟包埋好的腦組織蠟塊置于切片機上，以5～8 μm厚的標準連續切片，每個蠟塊切5張片，取其一行Luxol fast blue染色。具體步驟如下：① 石蠟切片5～8 μm厚，脫蠟至水；② 隨后放入95%乙醇稍洗；③ 放入Luxol fast blue染色液，室溫染色12～20 h；④ 放入95%乙醇液洗去多余的染色液；⑤ 用蒸餾水沖洗；⑥ 放入Luxol分化液分色15 s；⑦ 放入70%乙醇液分色30 s至灰白質清晰；⑧ 用蒸餾水沖洗（如果分色不足，可重復5～6步驟）；⑨ 入伊紅染色液，復染1～5 min，水洗；⑩ 常規脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固，備檢。
1.2.7 腦組織光鏡下病理學評分
根據腦組織HE染色及Luxol fast blue染色結果，采用盲法由病理科醫師光鏡下閱片，每張切片隨機選擇10個高倍視野（200倍），觀察腦組織的病理學改變，參照孔雷等[11]光鏡下評分法對腦組織的病理學改變進行評分（表1），計算SO組、SAP組及RAPA組內各亞組存活大鼠的平均分，結果以均數±標準差表示。
表1
光鏡下腦組織損傷的評分標準
1.3 統計學方法
采用SPSS 23.0統計軟件進行統計分析。計量資料行W檢驗符合正態分布時用均數±標準差（
±s）表示；采用Levene法進行方差齊性檢驗，多個樣本均數比較采用完全隨機設計資料的方差分析；多因素多水平間比較采用3×3析因設計資料的方差分析，兩因素間或兩水平間進一步比較采用LSD-t檢驗；相關關系分析采用線性相關性分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SAP建模結果
SO組各時點亞組大鼠全部存活，總體存活率為100%；SAP組24 h亞組存活8只，36 h亞組存活6只，48 h亞組存活4只，總體存活率為60%；RAPA組24 h亞組存活9只，36 h亞組存活8只，48 h亞組存活7只，總體存活率為80%。SAP組和RAPA組大鼠均建模成功，建模情況見圖1。
圖1
示SAP建模情況及SAP胰腺組織病理學改變
a：逆行胰膽管注射法建模；b：注射藥液成功；c：縫合十二指腸穿刺口；d：完整切取的大鼠腦組織；e：SAP組24 h胰腺組織散在出血；f：SAP組48 h 胰腺組織廣泛片狀壞死
2.2 腦組織中p-mTOR和p-S6K1相對表達水平檢測結果
2.2.1 腦組織中p-mTOR的相對表達水平
在24 h、36 h及48 h 時點，3組大鼠腦組織的p-mTOR相對表達水平順序均為 SO組<RAPA組<SAP組（P<0.05）；SO組內的3個時相間的差異均無統計學意義（P>0.05）；在SAP組和RAPA組內，3個時相間比較均是24 h<36 h<48 h（P<0.05）。見圖2a和2b。
圖2
示腦組織中 p-mTOR 和 p-S6K1相對表達水平的檢測結果
a：腦組織中p-mTOR表達的電泳圖；b：3組腦組織中p-mTOR的相對表達水平；c：腦組織中p-S6K1表達的電泳圖； d：3組腦組織中p-S6K1的相對表達水平。同時點與SO組比較，*
2.2.2 腦組織中 p-S6K1 的相對表達水平
在24 h、36 h及48 h 時點，3組大鼠腦組織的p-S6K1相對表達水平順序均為 SO組<RAPA組<SAP組（P<0.05）；SO組內的3個時相間的差異均無統計學意義（P>0.05）；在SAP組和RAPA組內，3個時相間比較均是24 h<36 h<48 h（P<0.05）。見圖2c和2d。
2.3 腦組織的病理學改變及其病理學評分結果
3組大鼠的總體腦組織病理學評分差異有統計學意義（F=844.5，P<0.05），且滿足SAP組>RAPA組>SO組（P<0.05）；3個時點大鼠的總體腦組織病理學評分差異有統計學意義（F=292.0，P<0.05），且SAP組和RAPA組滿足48 h組>36 h組>24 h組（P<0.05）。具體見表2及圖3a～3i。組別和時間這兩個因素間存在交互作用（F=85.9，P<0.05），且在SAP組48 h時點大鼠腦組織的病理學評分最高，即腦損傷最嚴重（圖4a）。
表2
3組大鼠腦組織病理學評分結果 (
，分)
圖3
示3組各時點腦組織病理學改變
a～c：SO組，24 h 腦組織病理表現，正常（a，HE ×100），36 h 腦組織病理表現，基本正常（b，HE ×200），48 h 髓鞘形態正常，結構較完整（c，Luxol fast blue染色 ×100）； d～f：SAP組，24 h毛細血管充血、擴張（d，HE ×100），36 h 神經元水腫，神經纖維網結構疏松、破壞（e，HE ×200），48 h 髓鞘染色變淺，髓鞘膨脹、曲折、斷裂，局部出現脫髓鞘改變（f，Luxol fast blue染色 ×100）； g～i：RAPA組，24 h 毛細血管稍充血、腫脹，神經元及膠質細胞形態正常，神經纖維排列正常（g，HE ×100），36 h 腦組彌漫性充血，神經纖維排列稍紊亂（h，HE ×200），48 h 髓鞘染色稍淺，髓鞘膨脹，未見明顯斷裂及脫髓鞘改變（i，Luxol fast blue染色 ×100）
圖4
示組別與時間兩因素的交互作用結果（a）以及腦組織中p-mTOR（b）和p-S6K1（c）的相對表達水平與腦組織病理學評分的相關性分析結果
2.4 腦組織中 p-mTOR和p-S6K1 的相對表達水平與腦組織病理學評分的相關性分析結果
腦組織中 p-mTOR 和 p-S6K1 的相對表達水平與腦組織的病理學評分均呈正相關關系（r=0.99，P<0.01；r=0.97，P<0.01），見圖4b和4c （根據3組大鼠3 個時點p-mTOR 和p-S6K1相對表達水平的均值與腦組織病理評分的均值繪制，即根據表2及圖2b和2d的數據繪制）。
3 討論
SAP是臨床常見的腹部急癥之一，發病迅速，呈惡性發展趨勢，治療極為復雜，病理改變主要以胰腺大面積出血壞死為特點，晚期多合并全身炎癥反應綜合，引起廣泛的器官組織損傷，最終發展為多器官功能障礙綜合征[12]。SAP常并發肝、肺、腎、腦等重要臟器損傷及功能障礙，其中對SAP并發肝、肺、腎三大臟器的損傷機制較為清楚，并在預防和治療方面取得令人滿意的效果[13-14]。但目前SAP并發腦組織損害的機制尚不完全清楚，同時SAP并發腦組織損害無特異性的臨床表現且缺乏敏感的檢查方法，在臨床診斷及治療方面十分棘手，病死率高達67.0%～100%，嚴重危害患者的生命健康[15-16]。
PBTI是以定向力障礙、意識模糊、煩躁、抑郁、躁狂等神經精神障礙為主要表現的一類綜合征。Butt等[17]研究發現，在SAP患者出現再喂養綜合征時會誘發PBTI的發生；Yang等[18]研究表明，腫瘤壞死因子-α抗體可以預防實驗大鼠PBTI的發生；有研究[19]證實雪蓮注射液及維生素B對PBTI有較好的治療效果；也有研究[20]表明，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）在轉錄水平通過激活哺乳動物核轉錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）進而產生促炎細胞因子在PBTI中發揮促炎作用；Engelmann等[21]研究表明， NF-κB信號通路參與中樞神經系統損傷的發生發展；鄂偉國等[22]曾報道p38MAPK的特異性抑制劑 sb203580 可通過調控白介素（interleukin，IL）-6、IL-10等細胞因子表達水平延緩PBTI的進展。
本研究結果顯示，在不同時點，SAP組和RAPA組大鼠腦組織中p-mTOR 和 p-S6K1的相對表達水平均明顯高于SO組。 p-mTOR和 p-S6K1作為 mTOR 信號通路中下游的關鍵蛋白分子，其磷酸化水平反映了該通路的激活情況[23]，這就提示在PBTI時，mTOR 信號通路被廣泛激活并參與PBTI的發生發展。本研究結果顯示：在不同時點，RAPA組腦組織中的p-mTOR 和p-S6K1相對表達水平均明顯低于SAP組，說明RAPA有效抑制了mTOR 信號通的過度激活；另外，在各時點，SAP組腦組織的病理學評分均顯著高于SO組，而RAPA組腦組織的病理學評分卻介于SO組和SAP組之間，說明RAPA可以有效減輕PBTI的腦組織損害程度；最后，相關性分析結果顯示，各亞組腦組織中p-mTOR和p-S6K1的相對表達水平與腦組織病理學評分呈線性正相關關系，且二者的相關系數r 均大于 0.8，故可以認為，在PBTI時，腦組織中p-mTOR和p-S6K1的相對表達水平與腦組織損害程度具有較高的相關性。
綜上所述，在PBTI中，mTOR信號通路被廣泛激活；腦組織中p-mTOR 和 p-S6K1的相對表達水平越高，提示腦損傷越嚴重；RAPA可明顯減輕腦組織損害程度，其機制可能是通過下調腦組織中p-mTOR和p-S6K1的表達水平進而減輕實驗大鼠的腦組織損傷。但p-mTOR和p-S6K1造成并加重PBTI的具體機制尚不清楚，有待進一步研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：趙海平負責研究設計、指導實驗及論文質量控制；吉九威負責實驗實施、論文撰寫；宋衛東負責數據收集和統計分析。
倫理聲明：本研究通過了內蒙古醫科大學醫學倫理委員會的審批（批文編號：Y K D2017142）。
胰性腦組織損害（pancreatic brain tissues injury，PBTI），以往稱之為胰性腦病（pancreatic encephalopathy，PE），是重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）并發的一種腦組織病變，由Rothermich 等[1] 于1941年首次提出，因為研究者們對于PE發病機制認識不足，且沒有明確的診斷標準，所以現多數學者稱之為PBTI[2-3]。PBTI主要表現為定向力障礙、意識模糊、煩躁、幻覺、撲翼樣震顫等精神神經障礙[4]。PBTI的發病機制尚不完全清楚，認為是多種因素共同參與的結果[5]，僅有幾種學說解釋了該病的發病機理，如胰酶激活學說、維生素B1缺乏、代謝障礙學說和炎性介質與信號通路學說[6-7]，但具有維持蛋白合成、細胞存活、生長、凋亡、調節炎癥反應等作用的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路對PBTI的影響目前仍未見國內外學者報道[8]。本研究選擇mTOR信號通路的特異性抑制劑雷帕霉素（rapamycin，RAPA）作為干預藥物，探索RAPA對實驗大鼠PBTI是否具有保護作用及其可能的保護機制。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要材料和儀器
清潔級雄性SD大鼠90只，290～320 g，7～8 周齡，購自遼寧長生生物技術股份有限公司；動物手術器械、動物手術臺、5%牛磺膽酸鈉（購自北京索萊寶科技有限公司）、亞甲藍注射液、0.9%生理鹽水、盧卡斯快藍（Luxol fast blue）染色液（購自北京雷根生物技術有限公司）、RAPA、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和蛋白印跡（Western blot） 相關試劑（美國Sigma公司）。
1.2 方法
1.2.1 實驗動物分組
所有實驗大鼠術前適應性喂養1周，按拆信封法隨機分成3組：假手術組（sham operation，SO ）組、SAP組和RAPA組，每組 30 只大鼠；每組大鼠再按隨機數字表法分為 24 h、36 h 和 48 h 亞組，各亞組 10 只大鼠。
1.2.2 SD大鼠SAP模型的制備
實驗大鼠術前12 h禁食，不禁水，參照吉九威等[9]SAP大鼠模型制備法建模。
1.2.3 3 組大鼠的處理
SAP組大鼠注射5%牛磺膽酸鈉（2 mL/kg）與亞甲藍（0.1 mL）的混合液，SO組大鼠與SAP 組大鼠的手術處理方法相同，不同點是SO組大鼠將注射的藥物替換為0.9%生理鹽水（2 mL/kg）與亞甲藍（0.1 mL）的混合液，RAPA 組大鼠的處理方法和注射藥物與SAP組相同，只是在麻醉前30 min經腹腔注射RAPA（1 mg/kg）。
1.2.4 腦組織中磷酸化mTOR（phosphorylated mTOR，p-mTOR） 和磷酸化核糖體40S小亞基S6蛋白激酶（phosphorylated ribosomal 40S small subunit S6 protein kinase，p-S6K1） 表達水平的檢測
SAP組、SO組及RAPA組中的各時點亞組大鼠分別于術后24 h、36 h及48 h給予腹腔注射10%的水合氯醛溶液（3.3 mL/kg），完全麻醉后行開胸手術，直視下采用右心房穿刺放血法處死相應亞組存活的全部大鼠，處死后立即完整切取相應腦組織，標本分為兩部分備用，一部分行HE染色和Luxol fast blue染色；另一部分采用Western blot法檢測腦組織中p-mTOR（其相對分子量為289×103）和p-S6K1（其相對分子量為59×103）的相對表達水平（操作按試劑盒說明書進行），利用近紅外激光成像系統掃描并對條帶進行分析，以目的條帶與內參條帶吸光度的相對值作為結果進行分析。同時切取相應大鼠胰頭部位的胰腺組織，用10%中性甲醛溶液固定保存，行HE染色以明確SAP大鼠是否建模成功。
1.2.5 腦組織及胰腺組織的HE染色
參照吉九威等[10]的方法行常規HE染色，觀察腦組織中神經元、膠質細胞及腦血管的病理學變化并對腦組織損害程度進行評分；同時觀察胰腺組織是否出現腺泡出血、壞死等病理改變以明確SAP大鼠是否建模成功。
1.2.6 腦組織的Luxol fast blue 染色
將石蠟包埋好的腦組織蠟塊置于切片機上，以5～8 μm厚的標準連續切片，每個蠟塊切5張片，取其一行Luxol fast blue染色。具體步驟如下：① 石蠟切片5～8 μm厚，脫蠟至水；② 隨后放入95%乙醇稍洗；③ 放入Luxol fast blue染色液，室溫染色12～20 h；④ 放入95%乙醇液洗去多余的染色液；⑤ 用蒸餾水沖洗；⑥ 放入Luxol分化液分色15 s；⑦ 放入70%乙醇液分色30 s至灰白質清晰；⑧ 用蒸餾水沖洗（如果分色不足，可重復5～6步驟）；⑨ 入伊紅染色液，復染1～5 min，水洗；⑩ 常規脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固，備檢。
1.2.7 腦組織光鏡下病理學評分
根據腦組織HE染色及Luxol fast blue染色結果，采用盲法由病理科醫師光鏡下閱片，每張切片隨機選擇10個高倍視野（200倍），觀察腦組織的病理學改變，參照孔雷等[11]光鏡下評分法對腦組織的病理學改變進行評分（表1），計算SO組、SAP組及RAPA組內各亞組存活大鼠的平均分，結果以均數±標準差表示。
表1
光鏡下腦組織損傷的評分標準
1.3 統計學方法
采用SPSS 23.0統計軟件進行統計分析。計量資料行W檢驗符合正態分布時用均數±標準差（±s）表示；采用Levene法進行方差齊性檢驗，多個樣本均數比較采用完全隨機設計資料的方差分析；多因素多水平間比較采用3×3析因設計資料的方差分析，兩因素間或兩水平間進一步比較采用LSD-t檢驗；相關關系分析采用線性相關性分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SAP建模結果
SO組各時點亞組大鼠全部存活，總體存活率為100%；SAP組24 h亞組存活8只，36 h亞組存活6只，48 h亞組存活4只，總體存活率為60%；RAPA組24 h亞組存活9只，36 h亞組存活8只，48 h亞組存活7只，總體存活率為80%。SAP組和RAPA組大鼠均建模成功，建模情況見圖1。
圖1
示SAP建模情況及SAP胰腺組織病理學改變
a：逆行胰膽管注射法建模；b：注射藥液成功；c：縫合十二指腸穿刺口；d：完整切取的大鼠腦組織；e：SAP組24 h胰腺組織散在出血；f：SAP組48 h 胰腺組織廣泛片狀壞死
2.2 腦組織中p-mTOR和p-S6K1相對表達水平檢測結果
2.2.1 腦組織中p-mTOR的相對表達水平
在24 h、36 h及48 h 時點，3組大鼠腦組織的p-mTOR相對表達水平順序均為 SO組<RAPA組<SAP組（P<0.05）；SO組內的3個時相間的差異均無統計學意義（P>0.05）；在SAP組和RAPA組內，3個時相間比較均是24 h<36 h<48 h（P<0.05）。見圖2a和2b。
圖2
示腦組織中 p-mTOR 和 p-S6K1相對表達水平的檢測結果
a：腦組織中p-mTOR表達的電泳圖；b：3組腦組織中p-mTOR的相對表達水平；c：腦組織中p-S6K1表達的電泳圖； d：3組腦組織中p-S6K1的相對表達水平。同時點與SO組比較，*
2.2.2 腦組織中 p-S6K1 的相對表達水平
在24 h、36 h及48 h 時點，3組大鼠腦組織的p-S6K1相對表達水平順序均為 SO組<RAPA組<SAP組（P<0.05）；SO組內的3個時相間的差異均無統計學意義（P>0.05）；在SAP組和RAPA組內，3個時相間比較均是24 h<36 h<48 h（P<0.05）。見圖2c和2d。
2.3 腦組織的病理學改變及其病理學評分結果
3組大鼠的總體腦組織病理學評分差異有統計學意義（F=844.5，P<0.05），且滿足SAP組>RAPA組>SO組（P<0.05）；3個時點大鼠的總體腦組織病理學評分差異有統計學意義（F=292.0，P<0.05），且SAP組和RAPA組滿足48 h組>36 h組>24 h組（P<0.05）。具體見表2及圖3a～3i。組別和時間這兩個因素間存在交互作用（F=85.9，P<0.05），且在SAP組48 h時點大鼠腦組織的病理學評分最高，即腦損傷最嚴重（圖4a）。
表2
3組大鼠腦組織病理學評分結果 (，分)
圖3
示3組各時點腦組織病理學改變
a～c：SO組，24 h 腦組織病理表現，正常（a，HE ×100），36 h 腦組織病理表現，基本正常（b，HE ×200），48 h 髓鞘形態正常，結構較完整（c，Luxol fast blue染色 ×100）； d～f：SAP組，24 h毛細血管充血、擴張（d，HE ×100），36 h 神經元水腫，神經纖維網結構疏松、破壞（e，HE ×200），48 h 髓鞘染色變淺，髓鞘膨脹、曲折、斷裂，局部出現脫髓鞘改變（f，Luxol fast blue染色 ×100）； g～i：RAPA組，24 h 毛細血管稍充血、腫脹，神經元及膠質細胞形態正常，神經纖維排列正常（g，HE ×100），36 h 腦組彌漫性充血，神經纖維排列稍紊亂（h，HE ×200），48 h 髓鞘染色稍淺，髓鞘膨脹，未見明顯斷裂及脫髓鞘改變（i，Luxol fast blue染色 ×100）
圖4
示組別與時間兩因素的交互作用結果（a）以及腦組織中p-mTOR（b）和p-S6K1（c）的相對表達水平與腦組織病理學評分的相關性分析結果
2.4 腦組織中 p-mTOR和p-S6K1 的相對表達水平與腦組織病理學評分的相關性分析結果
腦組織中 p-mTOR 和 p-S6K1 的相對表達水平與腦組織的病理學評分均呈正相關關系（r=0.99，P<0.01；r=0.97，P<0.01），見圖4b和4c （根據3組大鼠3 個時點p-mTOR 和p-S6K1相對表達水平的均值與腦組織病理評分的均值繪制，即根據表2及圖2b和2d的數據繪制）。
3 討論
SAP是臨床常見的腹部急癥之一，發病迅速，呈惡性發展趨勢，治療極為復雜，病理改變主要以胰腺大面積出血壞死為特點，晚期多合并全身炎癥反應綜合，引起廣泛的器官組織損傷，最終發展為多器官功能障礙綜合征[12]。SAP常并發肝、肺、腎、腦等重要臟器損傷及功能障礙，其中對SAP并發肝、肺、腎三大臟器的損傷機制較為清楚，并在預防和治療方面取得令人滿意的效果[13-14]。但目前SAP并發腦組織損害的機制尚不完全清楚，同時SAP并發腦組織損害無特異性的臨床表現且缺乏敏感的檢查方法，在臨床診斷及治療方面十分棘手，病死率高達67.0%～100%，嚴重危害患者的生命健康[15-16]。
PBTI是以定向力障礙、意識模糊、煩躁、抑郁、躁狂等神經精神障礙為主要表現的一類綜合征。Butt等[17]研究發現，在SAP患者出現再喂養綜合征時會誘發PBTI的發生；Yang等[18]研究表明，腫瘤壞死因子-α抗體可以預防實驗大鼠PBTI的發生；有研究[19]證實雪蓮注射液及維生素B對PBTI有較好的治療效果；也有研究[20]表明，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）在轉錄水平通過激活哺乳動物核轉錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）進而產生促炎細胞因子在PBTI中發揮促炎作用；Engelmann等[21]研究表明， NF-κB信號通路參與中樞神經系統損傷的發生發展；鄂偉國等[22]曾報道p38MAPK的特異性抑制劑 sb203580 可通過調控白介素（interleukin，IL）-6、IL-10等細胞因子表達水平延緩PBTI的進展。
本研究結果顯示，在不同時點，SAP組和RAPA組大鼠腦組織中p-mTOR 和 p-S6K1的相對表達水平均明顯高于SO組。 p-mTOR和 p-S6K1作為 mTOR 信號通路中下游的關鍵蛋白分子，其磷酸化水平反映了該通路的激活情況[23]，這就提示在PBTI時，mTOR 信號通路被廣泛激活并參與PBTI的發生發展。本研究結果顯示：在不同時點，RAPA組腦組織中的p-mTOR 和p-S6K1相對表達水平均明顯低于SAP組，說明RAPA有效抑制了mTOR 信號通的過度激活；另外，在各時點，SAP組腦組織的病理學評分均顯著高于SO組，而RAPA組腦組織的病理學評分卻介于SO組和SAP組之間，說明RAPA可以有效減輕PBTI的腦組織損害程度；最后，相關性分析結果顯示，各亞組腦組織中p-mTOR和p-S6K1的相對表達水平與腦組織病理學評分呈線性正相關關系，且二者的相關系數r 均大于 0.8，故可以認為，在PBTI時，腦組織中p-mTOR和p-S6K1的相對表達水平與腦組織損害程度具有較高的相關性。
綜上所述，在PBTI中，mTOR信號通路被廣泛激活；腦組織中p-mTOR 和 p-S6K1的相對表達水平越高，提示腦損傷越嚴重；RAPA可明顯減輕腦組織損害程度，其機制可能是通過下調腦組織中p-mTOR和p-S6K1的表達水平進而減輕實驗大鼠的腦組織損傷。但p-mTOR和p-S6K1造成并加重PBTI的具體機制尚不清楚，有待進一步研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：趙海平負責研究設計、指導實驗及論文質量控制；吉九威負責實驗實施、論文撰寫；宋衛東負責數據收集和統計分析。
倫理聲明：本研究通過了內蒙古醫科大學醫學倫理委員會的審批（批文編號：Y K D2017142）。
