引用本文： 彭磊, 朱克祥. 類器官模型在胰腺癌中的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(7): 863-869. doi: 10.7507/1007-9424.202302021 復制
胰腺癌是最具侵襲性的惡性腫瘤之一，具有早期診斷困難、惡性程度高、侵襲性強、缺乏有效治療方法等特點[1]。盡管近年來胰腺癌治療，特別是免疫治療和輔助化學藥物治療（簡稱“化療” ）已取得了較大進展，但胰腺癌患者的5年生存率仍然只有10%左右[2]。2017年的統計數據[3]顯示，胰腺癌是美國第3大癌癥死亡原因；預計到2030年胰腺癌將成為繼肺癌之后的第2大癌癥死亡原因[4]。2022年我國估計新發胰腺癌病例數約為75 178例（約占中國癌癥病例數的2.9%），死亡病例數約為72 680例（占中國癌癥死亡病例數的3.8%）[5]。因此，亟需可用于臨床研究的患者模型和用于早期診斷的生物標志物，以尋求對患者最有效的治療方法和治療藥物。
近年來，類器官（organoid）技術已成為一種強大的體外工具，可用于重建胰腺癌的發病和進展的復雜病理生理學模型，有望成為發現胰腺癌生物標志物、測試藥物敏感性及制定個體化胰腺癌治療方案的新型平臺[6-9]。胰腺癌類器官實質上就是生長在培養皿中的微小器官，保留了患者原發腫瘤細胞的生理特性和機能，應用此技術可以直接使用患者來源的組織發現潛在的生物標志物和進行個體化藥物篩選、藥物敏感性測試，以用于胰腺癌的早期診斷和個體化治療，從而延長患者的生存時間和提高生存質量[10-11]。為此，現就胰腺癌類器官模型的構建并用于潛在生物標志物的發現，以及個體化藥物篩選和藥物敏感性測試中的研究現狀及其潛在的臨床前景進行綜述。
1 胰腺癌類器官模型的構建
胰腺癌類器官模型的構建可以通過手術切除的癌組織、細針穿刺抽吸活檢（fine-needle aspiration，FNA）獲得的癌組織或者人多能干細胞（human pluripotent stem cell，hPSC）衍生的上皮細胞構建，其原理類似于發育生物學研究中的器官培養，其出現使局限性、晚期和轉移性患者的研究成為可能。胰腺癌類器官模型的構建過程一般包括機械和化學消化、洗滌、培養、傳代等步驟。與二維培養的細胞系相比，類器官模型可以更為有效地建立細胞系，并與患者原發腫瘤細胞的異質性保持一致[12]。
1.1 利用手術切除組織構建胰腺癌類器官
在利用手術切除胰腺癌組織構建胰腺癌類器官的初步研究[13]中，Clevers和Tuveson實驗室的類器官培養成功率分別為75%和83%。在近來的一項利用手術切除胰腺癌組織構建類器官模型的研究[14]中發現，胰腺癌類器官在優化的無血清培養基中的培養成功率超過90%。Watanabe等[15]使用手術切除胰腺癌標本構建胰腺癌類器官的培養成功率為42%（8/19），并對成功構建的8個胰腺癌類器官的基因組區域進行了測序，這8個胰腺癌類器官涵蓋了50個癌癥相關基因的突變熱點，顯示了胰腺癌中KRAS、TP53、SMAD4和CDKN2A基因的典型突變[16]。
手術切除來源組織構建的類器官的優點：從患者標本中建立，表明了起源組織的特征如基因組和轉錄組特征，而且還可以維持原發腫瘤的表型反應。這種類器官移植到免疫缺陷小鼠體內，可以形成類似于原始腫瘤的異種移植瘤，并且可以在移植前進行修飾，如通過基因擾動、基因過表達基因修飾或熒光蛋白標記[17]。
手術切除來源組織構建的類器官也有不足：這種操作方式涉及腫瘤組織的機械或酶消化，并且通常源自單細胞類型（腫瘤細胞），缺乏特征性的腫瘤纖維化間質以及腫瘤相關成纖維細胞和血管，這是一個關鍵的藥物傳遞障礙[18]，因此其預測臨床治療反應的能力有待提高；其次是正常（非腫瘤）細胞污染的風險，由于胰腺癌通常表現為彌漫性腫瘤，在利用手術切除組織構建胰腺癌類器官時，正常細胞的污染是一個較為突出的問題[19]，因此含有更高百分比的（腫瘤）上皮細胞的手術切除組織有更高的機會形成有效的類器官生長[20]；此外，組織的儲存也會影響成功率，獲得的組織材料應盡快儲存在培養基中，并保持在4 ℃直至處理，以增加類器官生長的機會和頻率[21]，這樣才能更好地構建有效的類器官模型并用于臨床研究，然而事實上，由于手術困難，腫瘤取樣和組織提取之間的時間間隔為0.5～2 h，以及目前沒有標準的培養基組成，導致手術切除胰腺癌組織構建胰腺癌類器官的成功率在不同實驗室的結果不盡相同。
1.2 FNA獲得的癌組織構建的胰腺癌類器官
近年來，使用FNA獲得的癌組織構建胰腺癌類器官作為一種新型的類器官構建方法，可以在較短的時間范圍內（甚至在治療之前）對胰腺癌患者進行分子表征的研究。通過FNA的標本，構建胰腺癌類器官模型具有較高的成功率，尤其是在活檢組織非常有限的胰腺癌患者中進行早期診斷和藥物敏感性測試方面具有巨大的潛力，未來有望利用這一技術在胰腺癌個體化治療過程中提供幫助。
在一項通過FNA獲得的癌組織構建初級胰腺癌類器官培養的研究[22]結果顯示，初始成功率為87%，隨后由于各種未知原因的損耗，導致最終超過5次傳代的胰腺癌類器官成功率為66%。這是一項相當重要的研究，在此之前胰腺癌類器官主要是從包含更多細胞的手術切除標本中構建的。在 Sepp?l?等[23]的一項研究中，手術切除樣本的初始培養成功率只有77%，而FNA 樣本成功率為78%。Dantes 團隊[24]在利用超聲內鏡引導下FNA獲取的癌組織構建胰腺癌類器官的過程中，為了提高成功率進行了額外的一次穿刺（該研究所有患者均根據慕尼黑工業大學IRB項目編號207/15和1946/07以及德累斯頓EK451122014招募、登記并簽署知情同意書；所有動物實驗和護理均按照機構委員會的指導方針進行，并經當地權威機構Regierung von Oberbayern批準，項目編號55.2-1-54-2532.0-54-2016。 ），以便在活檢后30 min內開始處理癌組織，構建的胰腺癌類器官可傳代超過5次，并經受至少1個凍融周期。
相比于手術切除組織構建類器官，FNA獲得的癌組織構建的胰腺癌類器官具有以下優勢：① 可以直接利用從床旁的患者或從獲得的腫瘤組織（包括小至2 mm3的活檢組織）分離培養腫瘤類器官，同時保留用于診斷的生長結構[25]。② 該技術可與超聲結合或在計算機斷層掃描引導下進行，從而精確地靶向病變部位，最大程度減少患者不適感[26]。③ 此種方法無需經過組織消化或細胞簇的胰蛋白酶消化，因此能夠保留腫瘤組織的重要三維架構和細胞的高活力[27]。④ FNA可以產生完整的上皮細胞聚集體且避免了非腫瘤細胞的污染。
利用FNA獲得的癌組織構建胰腺癌類器官也有不足：用于構建類器官的額外穿刺可能會增加不良事件的風險，包括出血和腫瘤播散，如Yane等[28]報道了3.4%的病例發生腫瘤播散，因此應減少穿刺次數，尤其是在可切除的胰腺癌患者中；此外，如果使用等分的組織樣本來構建類器官，則可能會減少剩余樣本的數量而對病理和基因診斷產生負面影響[29]。
1.3 hPSC構建胰腺癌類器官
hPSC具有持續的自我更新能力和高分化能力，因此可轉化為幾乎每個成人人體組織的各種細胞類型。利用源自hPSC的類器官，能夠研究胰腺發育和胰腺癌類器官發病的過程和機制[30]。
與患者衍生的類器官相比，基于hPSC構建的胰腺癌類器官具有獨特的優勢：① 及時無限制地獲取生物樣本，即使是在單細胞水平上也能成功構建[31]；② 可由研究者制造特定的遺傳環境；③ 使用hPSC具有通過體細胞制造、非侵入性收集的能力等優勢[32]；④ 形態學上，患者來源的胰腺癌類器官只包含一個上皮層，沒有間充質成分，而hPSC衍生的胰腺癌類器官包含多個上皮層和間充質，這有助于后續研究，因為不同細胞之間會發生一種稱為串擾的現象，也就是不同細胞之間的通信；由于hPSC衍生的胰腺癌類器官具有基質間室，因此可以觀察和調節細胞內的交叉信號，以發現胰腺癌發生的一些潛在機制和（或）更好地使用癌癥靶向治療（如化療）[33]；⑤ 近年來使用hPSC衍生的胰腺癌類器官來研究腫瘤微環境，因為它具有顯示上皮-間充質相互作用的能力，通過改變胰腺癌類器官的微環境，可以研究觸發特定的基因突變以及治療反應的潛在變化[34-35]。⑥ 未來，可以通過hPSC衍生的胰腺癌類器官研究特定基因突變對胰腺癌腫瘤微環境的影響。⑦ 利用最先進的基因編輯和體細胞重編程技術，可以直接提供具有可誘導癌基因和（或）敲除腫瘤抑制基因的hPSC，從而揭示細胞類型特異性模式以響應特定人類環境中的致癌壓力，有助于驗證胰腺癌類器官的發病機制[36-37]。
與患者來源的胰腺癌類器官相比，hPSC衍生的胰腺癌類器官的不足：需要更長的時間才能成熟，患者組織來源的上皮胰腺癌類器官可以在不到2周的時間內快速生成，而hPSC來源的胰腺癌類器官需要4～5周才能建立；此外，hPSC衍生的胰腺癌類器官的成熟過程更復雜，培養過程需要更加頻繁地關注[38]。
2 胰腺癌類器官模型用于生物標志物的篩選
由于缺乏早期診斷的生物學標志物及早期癥狀不明顯，大部分胰腺癌患者到了疾病晚期才被檢查出來，使得胰腺癌患者手術切除率低于20%，這也是導致胰腺癌5年生存率一直無法得到明顯提高的重要原因之一[39]。胰腺癌類器官保留了原發腫瘤的組織學、結構異質性等特點，可以利用胰腺癌類器官來進行胰腺癌生物學標志物的篩選。目前研究較多的胰腺癌生物學標志物主要有細胞外囊泡中的微小RNA（microRNA，miRNA）、glypican-1（GPC1）、膜聯蛋白A6（annexin A6，ANXA6）以及蛋白質生物學標志物細胞角蛋白（cytokeratin，CK）7、CK20、細胞腫瘤抗原p53、Claudin-4、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）等。
2.1 胰腺癌類器官與細胞外囊泡
細胞外囊泡是具有生物活性分子的膜包圍結構，它們能將某些生物活性分子如miRNA、蛋白質、脂質以分泌物形式轉移到靶細胞；可以通過基質細胞增加生長因子、細胞因子和血管生成因子的分泌[40]；此外，腫瘤衍生的細胞外囊泡會誘導上皮-間充質轉化，降解基質，并上調內皮細胞黏附因子。這些效應可以直接或間接影響免疫細胞，通過激活巨噬細胞干擾內皮細胞，從而支持癌細胞的擴散和增殖，以進行微轉移[41]。因此，細胞外囊泡被認為是癌診斷和預后的有價值的生物學標志物，可作為腫瘤治療方法的靶標[42]。
三維類器官技術維持了體內組織的細胞和遺傳異質性，并已被證明是迄今為止人類癌癥的最佳離體模型[43]。類器官能夠將細胞外囊泡釋放到其周圍的基質中，而這些囊泡是功能性的，它們經常負載有生物活性分子。例如，由胰腺癌衍生的類器官分泌的細胞外囊泡可以激活p38絲裂原活化蛋白激酶并控制肌管中F-box蛋白32和N-端規則泛素E3連接酶UBR2的表達[44]。一項關于直腸癌類器官的研究[45]顯示，直腸癌患者衍生的類器官的培養上清液中可以檢測到腫瘤衍生的攜帶蛋白質和miRNA的細胞外囊泡，并隨著Apc突變和膠原蛋白沉積而觀察到細胞外囊泡釋放的增加，提示Apc突變是直腸癌起始和進展中的關鍵因素。此外，有研究[46]顯示，由hPSC衍生的三維視網膜類器官釋放的細胞外囊泡包含許多小的非編碼RNA，包括miRNA、轉運RNA和Piwi蛋白相互作用的RNA，可作為翻譯后修飾的新調節劑和視網膜發育和疾病的生物標志物。Ze?ld等[47]團隊在比較源自不同胰腺癌患者胰腺癌類器官的細胞外囊泡時，發現只有一小部分miRNA重疊，表示不同胰腺癌患者之間的個體差異很大，而且所有類器官中常見的細胞外囊泡miRNA也存在于胰腺癌患者來源的血液細胞外囊泡中，與對照組相比，在胰腺癌患者血漿細胞外囊泡樣品中miRNA-21和miRNA-195表達量更高，并且在胰腺癌類器官中顯示了與循環細胞外囊泡的miRNA生物活性因子之間的重疊現象。
目前正在研究用于診斷目的的細胞外囊泡相關胰腺癌生物學標志物，包括表面標志物如GPC1[48]和ANXA6[49]，以及細胞外囊泡攜帶突變的遺傳物質如突變體Kras+ DNA[50]和miRNA[51]。用細胞外囊泡進行胰腺癌篩查，將顯著提高早期檢出胰腺癌的敏感度和特異度。
2.2 胰腺癌類器官和人源化異種移植（patient-derived xenografts，PDX）與相應的原發性腫瘤具有相同蛋白質表達特征
Romero-Calvo等[30]使用免疫組織化學標志確定了胰腺癌類器官和PDX的相關蛋白質表達譜，選擇CK7和CK20以及細胞腫瘤抗原p53、Claudin-4和CA19-9來評估胰腺上皮分化，因為它們在腫瘤性胰腺導管上皮中頻繁表達[52-53]。將這些蛋白質表達模式與正常胰腺組織和胰腺癌組織進行比較，與現有的研究結果一致，CK7和CK20的蛋白質表達譜在胰腺癌類器官中得以維持[54]；正常胰腺上皮顯示出低水平的p53表達，而在原發性腫瘤和相應的PDX和胰腺癌類器官模型中p53表達升高[55]；常在胰腺癌中過表達的Claudin-4在PDX和胰腺癌類器官模型中均升高[56]；所有研究的原發性腫瘤均表達CA19-9，并且PDX和胰腺癌類器官模型的CA19-9也呈陽性[57]。
為了研究PDX和類器官模型是否保留了其相應腫瘤的基因組和轉錄組特征，Romero-Calvo等[58]研究團隊從原發腫瘤、外周血、PDX、類器官和二維細胞系中提取了7例患者的DNA，并對由已知的癌癥相關基因組成的1 213個基因組進行了靶向測序，與先前的報道[59-60]一致，所有患者的原發性腫瘤均具有Kras和TP53突變，并在PDX、類器官和二維細胞系中復制。此外，個別患者的特異性突變如CDKN2A、NALCN、ZBTB16和PARP1也存在于相應的腫瘤模型中。為了進一步研究RNA表達譜，對腫瘤、PDX和二維細胞系RNAseq數據進行了途徑分析，發現癌癥相關的基因表達途徑包括p53信號傳導和細胞周期調控，在所有樣本類型中都有類似的上調或下調，值得注意的是，上調的p53信號與觀察到的TP53蛋白水平的增加一致；然后通過比較腫瘤、二維細胞系、類器官和PDX的維恩圖顯示，大多數差異表達的基因（1 815個基因）在3個模型和腫瘤樣品之間重疊[30]。
總之，用于胰腺癌分析的常用蛋白質生物標志物在胰腺癌類器官和PDX模型與原發性腫瘤之間的表達具有較強的一致性。
3 胰腺癌個體化藥物篩選和敏感性測試
近年來，得益于新輔助治療和輔助治療在內的綜合治療手段的應用，胰腺癌的5年生存率從5%提高到了10%左右[2]。有證據[61]表明，有效的化療可使胰腺癌長期存活患者增加1倍。但在多數情況下，不符合手術條件的患者仍主要接受標準化的“一刀切”的非個體化、非特異性的綜合化療，化學藥物的選擇籠統而沒有個體化。胰腺癌類器官可反映原發腫瘤的體內特性，并可在體外進行任意化學藥物的測試，可針對不同胰腺癌患者特征制定個體化治療方案，有望從根本上改善患者的預后[62]。
3.1 胰腺癌類器官模型預測藥物反應及藥物篩選
目前，治療胰腺癌的有效手段主要依賴于原發腫瘤的完全手術切除和有效的全身化療的使用，選擇合適的化療藥物對于患者預后極其重要。在一項前瞻性研究[63]中，從16例胰腺癌患者中生成了胰腺癌類器官，并通過使用標準化療藥物進行系統藥物篩選，對于從未接受過治療患者的預測藥物反應準確率為90%，對于接受過治療的患者預測藥物反應準確率為80%。胰腺癌類器官預測藥物反應和藥物篩選對患者的預后有明顯影響，如納米白蛋白結合型紫杉醇/吉西他濱或FOLFIRINOX（亞葉酸、氟尿嘧啶、伊立替康、奧沙利鉑）治療晚期胰腺癌患者。然而當使用胰腺癌類器官預測結果作為臨床支持時必須考慮諸如實際患者需要立即治療時，類器官相對較長的培養時間或在藥物分型過程中獲得親本腫瘤的耐藥性等限制。近年來，隨著3D打印以芯片格式生成微流體系統技術的進步，實現了大規模標準化藥物篩選，并在多個胰腺癌類器官線上并行自動讀出[64]。由此可見，胰腺癌類器官可為臨床預測藥物反應和藥物篩選提供指導。
3.2 利用胰腺癌類器官模型進行藥物敏感性測試
類器官作為個體化的臨床前模型，可以對每例患者進行藥物敏感性測試，準確反映每個患者對于不同化療藥物的敏感性。Romero-Calvo等[30]將胰腺癌一線化療藥物吉西他濱用于2例不同胰腺癌患者的類器官，結果顯示，2例患者之間存在明顯的藥物敏感性差異；進一步將聯合化療FOLFIRINOX方案及吉西他濱聯合白蛋白紫杉醇方案分別用于同一患者的類器官及PDX，結果顯示，腫瘤在體內與體外表現出的藥物敏感性一致，并與患者臨床實際情況相符合。有研究[65]在12例胰腺癌患者的類器官中測試了對吉西他濱、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康的活性代謝物SN-38、紫杉醇和其他藥物的敏感性，在此基礎上計算了49個劑量-反應曲線下的獨立面積并標準化，通過在每個胰腺癌類器官上測試的每種藥物的獨立受試者操作特征曲線下面積評估進行比較，為每例患者制定出個體化治療的排名，結果發現，胰腺癌患者的臨床結果與胰腺癌類器官藥物敏感性數據之間有高度相關性，強烈表明胰腺癌類器官模型中的藥物敏感性具有預測臨床反應的能力。Huang等[66]團隊在5例胰腺癌患者的類器官中進行表觀遺傳調控因子組蛋白-賴氨酸N-甲基轉移酶抑制劑UNC1999的敏感性試驗，結果顯示，在5例胰腺癌患者的類器官中，有3例對UNC1999敏感，并且對應的原腫瘤組織中呈組蛋白H3乙酰化賴氨酸27三甲基化陽性，而不敏感的2例均為組蛋白H3乙酰化賴氨酸27三甲基化陰性，結果提示，類器官模型能夠維持原腫瘤組織的特性，可以進行表觀遺傳學小分子化合物的篩選。
從類器官模型能夠維持原腫瘤組織特性的研究結果及胰腺癌類器官藥物敏感性數據與胰腺癌患者的臨床結果之間存在高度相關性的結果提示，未來可參照胰腺癌類器官藥物敏感性的數據，以避免無效化療，以提高治療應答率和減輕化療毒性，也可用胰腺癌類器官模型中化療的受試者操作特征曲線下面積合理選擇胰腺癌患者的個體化治療方案，延長患者生存時間和提高患者生存質量。
4 總結與展望
胰腺癌類器官為胰腺癌患者尋求新的潛在診斷生物標志物成為可能。胰腺癌類器官作為藥物敏感性和耐藥性檢測平臺，在胰腺癌的藥物治療研究中具有潛在的價值，可對患者樣本進行離體藥物測試，可用于臨床治療決策個體化藥物選擇。尤其隨著基因編輯技術的發展，有望將該技術與類器官技術相結合，從而發現控制治療敏感性的關鍵分子節點，并探索新的治療方法或彌補現有治療方法的缺陷，同時要加強基礎研究向臨床研究與治療的轉化，通過對原發性腫瘤和（或）轉移性腫瘤進行活檢，從無法切除的患者身上獲取新鮮的腫瘤組織以構建類器官模型或利用基因編輯進行類器官模型重編輯與修飾，再應用于胰腺癌的發病機制研究，從而為胰腺癌患者提供個體化的治療。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：彭磊負責查閱文獻、起草并撰寫文章；朱克祥修訂論文格式、文章結構及文章重要論點，給予指導性意見并對最終文稿內容進行審閱。
胰腺癌是最具侵襲性的惡性腫瘤之一，具有早期診斷困難、惡性程度高、侵襲性強、缺乏有效治療方法等特點[1]。盡管近年來胰腺癌治療，特別是免疫治療和輔助化學藥物治療（簡稱“化療” ）已取得了較大進展，但胰腺癌患者的5年生存率仍然只有10%左右[2]。2017年的統計數據[3]顯示，胰腺癌是美國第3大癌癥死亡原因；預計到2030年胰腺癌將成為繼肺癌之后的第2大癌癥死亡原因[4]。2022年我國估計新發胰腺癌病例數約為75 178例（約占中國癌癥病例數的2.9%），死亡病例數約為72 680例（占中國癌癥死亡病例數的3.8%）[5]。因此，亟需可用于臨床研究的患者模型和用于早期診斷的生物標志物，以尋求對患者最有效的治療方法和治療藥物。
近年來，類器官（organoid）技術已成為一種強大的體外工具，可用于重建胰腺癌的發病和進展的復雜病理生理學模型，有望成為發現胰腺癌生物標志物、測試藥物敏感性及制定個體化胰腺癌治療方案的新型平臺[6-9]。胰腺癌類器官實質上就是生長在培養皿中的微小器官，保留了患者原發腫瘤細胞的生理特性和機能，應用此技術可以直接使用患者來源的組織發現潛在的生物標志物和進行個體化藥物篩選、藥物敏感性測試，以用于胰腺癌的早期診斷和個體化治療，從而延長患者的生存時間和提高生存質量[10-11]。為此，現就胰腺癌類器官模型的構建并用于潛在生物標志物的發現，以及個體化藥物篩選和藥物敏感性測試中的研究現狀及其潛在的臨床前景進行綜述。
1 胰腺癌類器官模型的構建
胰腺癌類器官模型的構建可以通過手術切除的癌組織、細針穿刺抽吸活檢（fine-needle aspiration，FNA）獲得的癌組織或者人多能干細胞（human pluripotent stem cell，hPSC）衍生的上皮細胞構建，其原理類似于發育生物學研究中的器官培養，其出現使局限性、晚期和轉移性患者的研究成為可能。胰腺癌類器官模型的構建過程一般包括機械和化學消化、洗滌、培養、傳代等步驟。與二維培養的細胞系相比，類器官模型可以更為有效地建立細胞系，并與患者原發腫瘤細胞的異質性保持一致[12]。
1.1 利用手術切除組織構建胰腺癌類器官
在利用手術切除胰腺癌組織構建胰腺癌類器官的初步研究[13]中，Clevers和Tuveson實驗室的類器官培養成功率分別為75%和83%。在近來的一項利用手術切除胰腺癌組織構建類器官模型的研究[14]中發現，胰腺癌類器官在優化的無血清培養基中的培養成功率超過90%。Watanabe等[15]使用手術切除胰腺癌標本構建胰腺癌類器官的培養成功率為42%（8/19），并對成功構建的8個胰腺癌類器官的基因組區域進行了測序，這8個胰腺癌類器官涵蓋了50個癌癥相關基因的突變熱點，顯示了胰腺癌中KRAS、TP53、SMAD4和CDKN2A基因的典型突變[16]。
手術切除來源組織構建的類器官的優點：從患者標本中建立，表明了起源組織的特征如基因組和轉錄組特征，而且還可以維持原發腫瘤的表型反應。這種類器官移植到免疫缺陷小鼠體內，可以形成類似于原始腫瘤的異種移植瘤，并且可以在移植前進行修飾，如通過基因擾動、基因過表達基因修飾或熒光蛋白標記[17]。
手術切除來源組織構建的類器官也有不足：這種操作方式涉及腫瘤組織的機械或酶消化，并且通常源自單細胞類型（腫瘤細胞），缺乏特征性的腫瘤纖維化間質以及腫瘤相關成纖維細胞和血管，這是一個關鍵的藥物傳遞障礙[18]，因此其預測臨床治療反應的能力有待提高；其次是正常（非腫瘤）細胞污染的風險，由于胰腺癌通常表現為彌漫性腫瘤，在利用手術切除組織構建胰腺癌類器官時，正常細胞的污染是一個較為突出的問題[19]，因此含有更高百分比的（腫瘤）上皮細胞的手術切除組織有更高的機會形成有效的類器官生長[20]；此外，組織的儲存也會影響成功率，獲得的組織材料應盡快儲存在培養基中，并保持在4 ℃直至處理，以增加類器官生長的機會和頻率[21]，這樣才能更好地構建有效的類器官模型并用于臨床研究，然而事實上，由于手術困難，腫瘤取樣和組織提取之間的時間間隔為0.5～2 h，以及目前沒有標準的培養基組成，導致手術切除胰腺癌組織構建胰腺癌類器官的成功率在不同實驗室的結果不盡相同。
1.2 FNA獲得的癌組織構建的胰腺癌類器官
近年來，使用FNA獲得的癌組織構建胰腺癌類器官作為一種新型的類器官構建方法，可以在較短的時間范圍內（甚至在治療之前）對胰腺癌患者進行分子表征的研究。通過FNA的標本，構建胰腺癌類器官模型具有較高的成功率，尤其是在活檢組織非常有限的胰腺癌患者中進行早期診斷和藥物敏感性測試方面具有巨大的潛力，未來有望利用這一技術在胰腺癌個體化治療過程中提供幫助。
在一項通過FNA獲得的癌組織構建初級胰腺癌類器官培養的研究[22]結果顯示，初始成功率為87%，隨后由于各種未知原因的損耗，導致最終超過5次傳代的胰腺癌類器官成功率為66%。這是一項相當重要的研究，在此之前胰腺癌類器官主要是從包含更多細胞的手術切除標本中構建的。在 Sepp?l?等[23]的一項研究中，手術切除樣本的初始培養成功率只有77%，而FNA 樣本成功率為78%。Dantes 團隊[24]在利用超聲內鏡引導下FNA獲取的癌組織構建胰腺癌類器官的過程中，為了提高成功率進行了額外的一次穿刺（該研究所有患者均根據慕尼黑工業大學IRB項目編號207/15和1946/07以及德累斯頓EK451122014招募、登記并簽署知情同意書；所有動物實驗和護理均按照機構委員會的指導方針進行，并經當地權威機構Regierung von Oberbayern批準，項目編號55.2-1-54-2532.0-54-2016。 ），以便在活檢后30 min內開始處理癌組織，構建的胰腺癌類器官可傳代超過5次，并經受至少1個凍融周期。
相比于手術切除組織構建類器官，FNA獲得的癌組織構建的胰腺癌類器官具有以下優勢：① 可以直接利用從床旁的患者或從獲得的腫瘤組織（包括小至2 mm3的活檢組織）分離培養腫瘤類器官，同時保留用于診斷的生長結構[25]。② 該技術可與超聲結合或在計算機斷層掃描引導下進行，從而精確地靶向病變部位，最大程度減少患者不適感[26]。③ 此種方法無需經過組織消化或細胞簇的胰蛋白酶消化，因此能夠保留腫瘤組織的重要三維架構和細胞的高活力[27]。④ FNA可以產生完整的上皮細胞聚集體且避免了非腫瘤細胞的污染。
利用FNA獲得的癌組織構建胰腺癌類器官也有不足：用于構建類器官的額外穿刺可能會增加不良事件的風險，包括出血和腫瘤播散，如Yane等[28]報道了3.4%的病例發生腫瘤播散，因此應減少穿刺次數，尤其是在可切除的胰腺癌患者中；此外，如果使用等分的組織樣本來構建類器官，則可能會減少剩余樣本的數量而對病理和基因診斷產生負面影響[29]。
1.3 hPSC構建胰腺癌類器官
hPSC具有持續的自我更新能力和高分化能力，因此可轉化為幾乎每個成人人體組織的各種細胞類型。利用源自hPSC的類器官，能夠研究胰腺發育和胰腺癌類器官發病的過程和機制[30]。
與患者衍生的類器官相比，基于hPSC構建的胰腺癌類器官具有獨特的優勢：① 及時無限制地獲取生物樣本，即使是在單細胞水平上也能成功構建[31]；② 可由研究者制造特定的遺傳環境；③ 使用hPSC具有通過體細胞制造、非侵入性收集的能力等優勢[32]；④ 形態學上，患者來源的胰腺癌類器官只包含一個上皮層，沒有間充質成分，而hPSC衍生的胰腺癌類器官包含多個上皮層和間充質，這有助于后續研究，因為不同細胞之間會發生一種稱為串擾的現象，也就是不同細胞之間的通信；由于hPSC衍生的胰腺癌類器官具有基質間室，因此可以觀察和調節細胞內的交叉信號，以發現胰腺癌發生的一些潛在機制和（或）更好地使用癌癥靶向治療（如化療）[33]；⑤ 近年來使用hPSC衍生的胰腺癌類器官來研究腫瘤微環境，因為它具有顯示上皮-間充質相互作用的能力，通過改變胰腺癌類器官的微環境，可以研究觸發特定的基因突變以及治療反應的潛在變化[34-35]。⑥ 未來，可以通過hPSC衍生的胰腺癌類器官研究特定基因突變對胰腺癌腫瘤微環境的影響。⑦ 利用最先進的基因編輯和體細胞重編程技術，可以直接提供具有可誘導癌基因和（或）敲除腫瘤抑制基因的hPSC，從而揭示細胞類型特異性模式以響應特定人類環境中的致癌壓力，有助于驗證胰腺癌類器官的發病機制[36-37]。
與患者來源的胰腺癌類器官相比，hPSC衍生的胰腺癌類器官的不足：需要更長的時間才能成熟，患者組織來源的上皮胰腺癌類器官可以在不到2周的時間內快速生成，而hPSC來源的胰腺癌類器官需要4～5周才能建立；此外，hPSC衍生的胰腺癌類器官的成熟過程更復雜，培養過程需要更加頻繁地關注[38]。
2 胰腺癌類器官模型用于生物標志物的篩選
由于缺乏早期診斷的生物學標志物及早期癥狀不明顯，大部分胰腺癌患者到了疾病晚期才被檢查出來，使得胰腺癌患者手術切除率低于20%，這也是導致胰腺癌5年生存率一直無法得到明顯提高的重要原因之一[39]。胰腺癌類器官保留了原發腫瘤的組織學、結構異質性等特點，可以利用胰腺癌類器官來進行胰腺癌生物學標志物的篩選。目前研究較多的胰腺癌生物學標志物主要有細胞外囊泡中的微小RNA（microRNA，miRNA）、glypican-1（GPC1）、膜聯蛋白A6（annexin A6，ANXA6）以及蛋白質生物學標志物細胞角蛋白（cytokeratin，CK）7、CK20、細胞腫瘤抗原p53、Claudin-4、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）等。
2.1 胰腺癌類器官與細胞外囊泡
細胞外囊泡是具有生物活性分子的膜包圍結構，它們能將某些生物活性分子如miRNA、蛋白質、脂質以分泌物形式轉移到靶細胞；可以通過基質細胞增加生長因子、細胞因子和血管生成因子的分泌[40]；此外，腫瘤衍生的細胞外囊泡會誘導上皮-間充質轉化，降解基質，并上調內皮細胞黏附因子。這些效應可以直接或間接影響免疫細胞，通過激活巨噬細胞干擾內皮細胞，從而支持癌細胞的擴散和增殖，以進行微轉移[41]。因此，細胞外囊泡被認為是癌診斷和預后的有價值的生物學標志物，可作為腫瘤治療方法的靶標[42]。
三維類器官技術維持了體內組織的細胞和遺傳異質性，并已被證明是迄今為止人類癌癥的最佳離體模型[43]。類器官能夠將細胞外囊泡釋放到其周圍的基質中，而這些囊泡是功能性的，它們經常負載有生物活性分子。例如，由胰腺癌衍生的類器官分泌的細胞外囊泡可以激活p38絲裂原活化蛋白激酶并控制肌管中F-box蛋白32和N-端規則泛素E3連接酶UBR2的表達[44]。一項關于直腸癌類器官的研究[45]顯示，直腸癌患者衍生的類器官的培養上清液中可以檢測到腫瘤衍生的攜帶蛋白質和miRNA的細胞外囊泡，并隨著Apc突變和膠原蛋白沉積而觀察到細胞外囊泡釋放的增加，提示Apc突變是直腸癌起始和進展中的關鍵因素。此外，有研究[46]顯示，由hPSC衍生的三維視網膜類器官釋放的細胞外囊泡包含許多小的非編碼RNA，包括miRNA、轉運RNA和Piwi蛋白相互作用的RNA，可作為翻譯后修飾的新調節劑和視網膜發育和疾病的生物標志物。Ze?ld等[47]團隊在比較源自不同胰腺癌患者胰腺癌類器官的細胞外囊泡時，發現只有一小部分miRNA重疊，表示不同胰腺癌患者之間的個體差異很大，而且所有類器官中常見的細胞外囊泡miRNA也存在于胰腺癌患者來源的血液細胞外囊泡中，與對照組相比，在胰腺癌患者血漿細胞外囊泡樣品中miRNA-21和miRNA-195表達量更高，并且在胰腺癌類器官中顯示了與循環細胞外囊泡的miRNA生物活性因子之間的重疊現象。
目前正在研究用于診斷目的的細胞外囊泡相關胰腺癌生物學標志物，包括表面標志物如GPC1[48]和ANXA6[49]，以及細胞外囊泡攜帶突變的遺傳物質如突變體Kras+ DNA[50]和miRNA[51]。用細胞外囊泡進行胰腺癌篩查，將顯著提高早期檢出胰腺癌的敏感度和特異度。
2.2 胰腺癌類器官和人源化異種移植（patient-derived xenografts，PDX）與相應的原發性腫瘤具有相同蛋白質表達特征
Romero-Calvo等[30]使用免疫組織化學標志確定了胰腺癌類器官和PDX的相關蛋白質表達譜，選擇CK7和CK20以及細胞腫瘤抗原p53、Claudin-4和CA19-9來評估胰腺上皮分化，因為它們在腫瘤性胰腺導管上皮中頻繁表達[52-53]。將這些蛋白質表達模式與正常胰腺組織和胰腺癌組織進行比較，與現有的研究結果一致，CK7和CK20的蛋白質表達譜在胰腺癌類器官中得以維持[54]；正常胰腺上皮顯示出低水平的p53表達，而在原發性腫瘤和相應的PDX和胰腺癌類器官模型中p53表達升高[55]；常在胰腺癌中過表達的Claudin-4在PDX和胰腺癌類器官模型中均升高[56]；所有研究的原發性腫瘤均表達CA19-9，并且PDX和胰腺癌類器官模型的CA19-9也呈陽性[57]。
為了研究PDX和類器官模型是否保留了其相應腫瘤的基因組和轉錄組特征，Romero-Calvo等[58]研究團隊從原發腫瘤、外周血、PDX、類器官和二維細胞系中提取了7例患者的DNA，并對由已知的癌癥相關基因組成的1 213個基因組進行了靶向測序，與先前的報道[59-60]一致，所有患者的原發性腫瘤均具有Kras和TP53突變，并在PDX、類器官和二維細胞系中復制。此外，個別患者的特異性突變如CDKN2A、NALCN、ZBTB16和PARP1也存在于相應的腫瘤模型中。為了進一步研究RNA表達譜，對腫瘤、PDX和二維細胞系RNAseq數據進行了途徑分析，發現癌癥相關的基因表達途徑包括p53信號傳導和細胞周期調控，在所有樣本類型中都有類似的上調或下調，值得注意的是，上調的p53信號與觀察到的TP53蛋白水平的增加一致；然后通過比較腫瘤、二維細胞系、類器官和PDX的維恩圖顯示，大多數差異表達的基因（1 815個基因）在3個模型和腫瘤樣品之間重疊[30]。
總之，用于胰腺癌分析的常用蛋白質生物標志物在胰腺癌類器官和PDX模型與原發性腫瘤之間的表達具有較強的一致性。
3 胰腺癌個體化藥物篩選和敏感性測試
近年來，得益于新輔助治療和輔助治療在內的綜合治療手段的應用，胰腺癌的5年生存率從5%提高到了10%左右[2]。有證據[61]表明，有效的化療可使胰腺癌長期存活患者增加1倍。但在多數情況下，不符合手術條件的患者仍主要接受標準化的“一刀切”的非個體化、非特異性的綜合化療，化學藥物的選擇籠統而沒有個體化。胰腺癌類器官可反映原發腫瘤的體內特性，并可在體外進行任意化學藥物的測試，可針對不同胰腺癌患者特征制定個體化治療方案，有望從根本上改善患者的預后[62]。
3.1 胰腺癌類器官模型預測藥物反應及藥物篩選
目前，治療胰腺癌的有效手段主要依賴于原發腫瘤的完全手術切除和有效的全身化療的使用，選擇合適的化療藥物對于患者預后極其重要。在一項前瞻性研究[63]中，從16例胰腺癌患者中生成了胰腺癌類器官，并通過使用標準化療藥物進行系統藥物篩選，對于從未接受過治療患者的預測藥物反應準確率為90%，對于接受過治療的患者預測藥物反應準確率為80%。胰腺癌類器官預測藥物反應和藥物篩選對患者的預后有明顯影響，如納米白蛋白結合型紫杉醇/吉西他濱或FOLFIRINOX（亞葉酸、氟尿嘧啶、伊立替康、奧沙利鉑）治療晚期胰腺癌患者。然而當使用胰腺癌類器官預測結果作為臨床支持時必須考慮諸如實際患者需要立即治療時，類器官相對較長的培養時間或在藥物分型過程中獲得親本腫瘤的耐藥性等限制。近年來，隨著3D打印以芯片格式生成微流體系統技術的進步，實現了大規模標準化藥物篩選，并在多個胰腺癌類器官線上并行自動讀出[64]。由此可見，胰腺癌類器官可為臨床預測藥物反應和藥物篩選提供指導。
3.2 利用胰腺癌類器官模型進行藥物敏感性測試
類器官作為個體化的臨床前模型，可以對每例患者進行藥物敏感性測試，準確反映每個患者對于不同化療藥物的敏感性。Romero-Calvo等[30]將胰腺癌一線化療藥物吉西他濱用于2例不同胰腺癌患者的類器官，結果顯示，2例患者之間存在明顯的藥物敏感性差異；進一步將聯合化療FOLFIRINOX方案及吉西他濱聯合白蛋白紫杉醇方案分別用于同一患者的類器官及PDX，結果顯示，腫瘤在體內與體外表現出的藥物敏感性一致，并與患者臨床實際情況相符合。有研究[65]在12例胰腺癌患者的類器官中測試了對吉西他濱、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康的活性代謝物SN-38、紫杉醇和其他藥物的敏感性，在此基礎上計算了49個劑量-反應曲線下的獨立面積并標準化，通過在每個胰腺癌類器官上測試的每種藥物的獨立受試者操作特征曲線下面積評估進行比較，為每例患者制定出個體化治療的排名，結果發現，胰腺癌患者的臨床結果與胰腺癌類器官藥物敏感性數據之間有高度相關性，強烈表明胰腺癌類器官模型中的藥物敏感性具有預測臨床反應的能力。Huang等[66]團隊在5例胰腺癌患者的類器官中進行表觀遺傳調控因子組蛋白-賴氨酸N-甲基轉移酶抑制劑UNC1999的敏感性試驗，結果顯示，在5例胰腺癌患者的類器官中，有3例對UNC1999敏感，并且對應的原腫瘤組織中呈組蛋白H3乙酰化賴氨酸27三甲基化陽性，而不敏感的2例均為組蛋白H3乙酰化賴氨酸27三甲基化陰性，結果提示，類器官模型能夠維持原腫瘤組織的特性，可以進行表觀遺傳學小分子化合物的篩選。
從類器官模型能夠維持原腫瘤組織特性的研究結果及胰腺癌類器官藥物敏感性數據與胰腺癌患者的臨床結果之間存在高度相關性的結果提示，未來可參照胰腺癌類器官藥物敏感性的數據，以避免無效化療，以提高治療應答率和減輕化療毒性，也可用胰腺癌類器官模型中化療的受試者操作特征曲線下面積合理選擇胰腺癌患者的個體化治療方案，延長患者生存時間和提高患者生存質量。
4 總結與展望
胰腺癌類器官為胰腺癌患者尋求新的潛在診斷生物標志物成為可能。胰腺癌類器官作為藥物敏感性和耐藥性檢測平臺，在胰腺癌的藥物治療研究中具有潛在的價值，可對患者樣本進行離體藥物測試，可用于臨床治療決策個體化藥物選擇。尤其隨著基因編輯技術的發展，有望將該技術與類器官技術相結合，從而發現控制治療敏感性的關鍵分子節點，并探索新的治療方法或彌補現有治療方法的缺陷，同時要加強基礎研究向臨床研究與治療的轉化，通過對原發性腫瘤和（或）轉移性腫瘤進行活檢，從無法切除的患者身上獲取新鮮的腫瘤組織以構建類器官模型或利用基因編輯進行類器官模型重編輯與修飾，再應用于胰腺癌的發病機制研究，從而為胰腺癌患者提供個體化的治療。
重要聲明
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