引用本文： 邢娟, 張偉, 張震環, 劉瑋, 王謙. 泛素對人臍靜脈內皮細胞和巨噬細胞的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(2): 173-177. doi: 10.7507/1671-6205.2015044 復制
泛素是由76個氨基酸組成的多肽，普遍存在于所有真核細胞中。其在細胞內主要通過蛋白質的泛素化發揮多種生理及病理作用，如三磷酸腺苷(ATP)依賴的選擇性蛋白質降解路徑，即泛素-蛋白酶體路徑 [1]。細胞外的泛素則被看作是一種熱休克蛋白，近年來的研究認為其具有類似免疫調理的作用，主要表現為抑制炎癥反應、減輕炎癥損傷、抑制免疫排斥反應以及影響細胞凋亡這幾個方面[2-3]。在不同種類的細胞研究中，其作用略有差別，例如泛素可以抑制人造血祖細胞、髓系和淋巴細胞系造血細胞的生長，誘導細胞凋亡，卻能顯著地減少大鼠心肌細胞的凋亡[4-5]；外源性泛素上調脂多糖(LPS)刺激的小鼠巨噬細胞腫瘤壞死因子α(TNF-α) mRNA的合成，卻下調LPS刺激的人外周血單核細胞TNF-α mRNA的合成[6-7]。由于在既往的多個動物實驗中，外源性給予泛素可明顯減輕腦、肺組織損傷水腫，降低內皮源性炎癥因子的生成[8-12]，因此我們推測血管內皮細胞可能是外源性泛素在體內的靶器官之一，外源性給予泛素可以減輕病理條件下血管內皮細胞的損傷，這種作用應是與泛素劑量密切相關，并不是越高越好；此外，泛素對體內對不同功能的細胞作用可能并不一致，如對組織細胞和炎癥細胞的作用可能不一樣。本次研究以體外培養的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)和人巨噬細胞為對象，觀察研究外源性泛素對正常狀態的內皮細胞和巨噬細胞的影響，以及泛素是否對LPS誘導的HUVECs損傷具有保護作用。
材料與方法
一 材料
HUVECs和人巨噬細胞由南京明基醫院胸腔醫學中心實驗室提供，泛素(U6523)和LPS(L2508)購自Sigma公司，胎牛血清和DMEM 培養液購自Gibco公司，人TNF-α和血管細胞粘附分子1(VCAM-1)ELISA試劑盒(EK0525&EK0537) 購自武漢博士德公司，鼠抗人核因子κB(NF-κB)抗體(ab55560)購自Abcam公司，羊抗大鼠二抗(IgG-HRP，B2112)購自Santa Cruz公司。
二 方法
1．細胞培養：細胞復蘇后加10%胎牛血清DMEM培養液置于37 ℃ 5%CO2細胞培養箱內培養，培養液中加入100 U/mL青霉素鏈霉素雙抗。傳代后即使用5%胎牛血清DMEM培養液培養，使用第3、4代細胞進行實驗。
2．實驗設計與分組：首先，用濃度為0.1、1、10和50 μg/mL的泛素干預體外培養的HUVECs，干預后24 h在顯微鏡下觀察細胞形態的變化。根據觀察結果，選擇4個泛素濃度作為下一步的實驗濃度。將體外培養的HUVECs和人巨噬細胞分為5組：泛素0.01 μg/mL組、0.1 μg/mL組、1 μg/mL組、10 μg/mL組，以及空白對照組。分別于泛素干預后8、16和24 h收集各組細胞上清測定TNF-α和VCAM-1水平，干預后24 h收集細胞測定NF-κB蛋白水平。選擇4個泛素濃度組中對HUVECs影響較為明顯的一組的泛素濃度干預10 μg/mL LPS誘導的HUVECs，分別于干預后8、16和24 h收集細胞上清測定TNF-α和VCAM-1水平。
3．ELISA測定TNF-α和VCAM-1水平：取細胞培養的上清4 ℃ 1000 r/min離心5 min取上清，－20 ℃分管凍存。ELISA的操作按說明書進行。
4．Western blot測定NF-κB蛋白水平：收獲細胞后加適量細胞裂解液冰上裂解30 min，每隔10 min振蕩1次，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min后取上清－80 ℃分管凍存。測定時，首先BCA法測定樣品蛋白濃度，取等量蛋白40 μg加上樣緩沖液、PBS至20 μL，沸水浴5 min，上樣；10%SDS-PAGE分離膠、5%濃縮膠電泳，切膠后300 mA濕轉100 min左右，5%脫脂牛奶TBST室溫封閉1 h，TBST洗膜后一抗4 ℃過夜，TBST洗膜，二抗37 ℃孵育90 min，TBST洗膜后顯影拍照，以β-actin為內參照。
三 統計學處理
采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析。多組比較采用單因素方差分析(Oneway ANOVA)。P<0.05為差異有統計學意義。
結果
一 泛素干預24 h對HUVECs的影響
1．HUVECs的形態學變化：泛素濃度在10 μg/mL 以下時，細胞形態未發生明顯變化。但當泛素濃度達到50 μg/mL時，細胞開始呈氣球樣變并大量死亡。結果見圖 1。
圖1
泛素對HUVECs的影響的形態學觀察(×200) a．泛素50 μg/mL干預24 h；b．空白對照組
2．細胞上清TNF-α和VCAM-1水平：泛素干預24 h后，各泛素干預組的細胞上清TNF-α和VCAM-1 水平兩者變化趨勢基本一致，均為泛素0.01μg/mL組TNF-α和VCAM-1水平最高，泛素0.1 μg/mL組開始回落，至泛素10 μg/mL組TNF-α和VCAM-1水平已與空白對照組相似。總體上，細胞上清VCAM-1水平遠較TNF-α水平高，故組間的變化趨勢更為明顯，其中泛素0.01 μg/mL組、泛素1 μg/mL組與空白對照組結果比較差異有統計學意義。結果見圖 2。
圖2
不同濃度泛素干預24 h后HUVECs細胞上清TNF-α和VCAM-1水平
與空白對照組比較，*
3．細胞NF-κ B水平：泛素0.01 μg/mL組的NF-κB水平與空白對照組相似，略有減低的趨勢；泛素0.1 μg/mL組和泛素1 μg/mL組NF-κB水平較空白對照組明顯增高，泛素10 μg/mL組較低，較空白對照組亦明顯減低。結果見圖 3。
圖3
不同濃度泛素干預HUVECs 24 h后NF-κB水平
二 泛素對人巨噬細胞的影響
1．細胞上清TNF-α和VCAM-1水平：泛素干預24 h后，空白對照組及4個泛素干預組的細胞上清TNF-α水平總體在一個較低的水平，而細胞上清VCAM-1水平較TNF-α高，但兩者的變化趨勢相似，即隨著干預濃度的增加，各泛素組的TNF-α和VCAM-1水平呈現逐步上升的趨勢，泛素10 μg/mL組最高。其中，泛素10 μg/mL組VCAM-1水平與空白對照組和泛素0.01 μg/mL組差異有顯著的統計學意義。結果見圖 4。
圖4
不同濃度泛素干預人巨噬細胞24 h后細胞上清TNF-α和VCAM-1水平
與空白對照組比較，*
2．細胞NF-κB水平：泛素0.1 μg/mL組和泛素1 μg/mL組NF-κB水平較高，泛素0.01 μg/mL組和泛素10 μg/mL組的NF-κB水平較空白對照組低，其中泛素0.01 μg/mL組偏低更為明顯。結果見圖 5。
圖5
不同濃度泛素干預人巨噬細胞24 h后NF-κB水平
三 0.1 μg/mL泛素對10 μg/mL LPS的誘導HUVECs細胞上清TNF-α和VCAM-1水平的影響
LPS組8、16、24 h的TNF-α水平呈逐步上升的趨勢，其中8 h與16、24 h的結果差異有統計學意義(P<0.05)。泛素+LPS組TNF-α水平時間點的變化趨勢相同，其中8 h與24 h的結果差異有統計學意義(P<0.05)；但各時間點LPS組和泛素+LPS組的TNF-α水平相似，差異均無統計學意義(P> 0.05)。各時間點LPS組及泛素+LPS組的VCAM-1 水平變化趨勢不明顯，且各時間點間及各組間差異均無統計學意義(P>0.05)。結果見圖 6。
圖6
泛素0.1 μg/mL干預LPS 10 μg/mL誘導的HUVECs細胞上清TNF-α和VCAM-1水平
討論
正常情況下，人血清中泛素的濃度在10~100 ng/mL。一般認為正常的細胞排泌、死亡等過程會釋放泛素，使細胞外的泛素濃度保持在一個較低且恒定的水平[2]。多種病理因素導致的組織細胞破壞和死亡會使釋放的泛素增多，引起組織間液、血清中泛素濃度成倍地升高，如膿毒癥患者的血清泛素濃度是正常狀況下的5~7倍[8, 13-15]。以往的研究主要關注泛素的組織器官保護作用，但從本次研究的結果來看，這一作用是一定濃度范圍之內的泛素才具備的，高濃度的泛素對組織器官有明顯的損傷作用，不論從生物學指標還是形態學上都能得到體現。
隨著泛素干預濃度的升高，HUVECs細胞上清TNF-α和VCAM-1水平是呈先升高后降低的變化趨勢，而人巨噬細胞的TNF-α和VCAM-1水平則是呈逐步升高的趨勢；但兩者NF-κB蛋白水平的變化趨勢卻略相似，即泛素濃度為0.1 μg/mL和1 μg/mL時明顯增高，0.01 μg/mL和10 μg/mL時增高不明顯，甚至有減低的趨勢，其中HUVECs減低的趨勢更為明顯。
0.01 μg/mL和0.1 μg/mL分別是生理狀態下人血清游離泛素濃度的低限和高限，此時HUVECs生成的TNF-α和VCAM-1較高，而1 μg/mL和10 μg/mL時卻較低。這提示在正常情況下，血液中或血管內皮細胞表面存在著抑制泛素作用的成分，一旦抑制的因素去除，生理濃度范圍內的泛素就會損傷血管內皮細胞；而這種損傷可能具有一定“預應激”的作用，可將血管內皮細胞調至適當的應激狀態，從而減輕后續損傷因素的損害作用；但過高濃度的泛素由于其對血管內皮細胞的損害作用過重，所以檢測出的相關細胞因子濃度的增加并不明顯。泛素濃度為0.01 μg/mL時NF-κB蛋白水平未明顯增高，提示此時細胞對細胞因子的轉錄合成并未增加，釋放的主要為細胞內儲備的細胞因子，細胞內部及外圍細胞因子濃度的升高可能會對NF-κB產生一個輕微的抑制作用；而0.1 μg/mL和1 μg/mL時NF-κB蛋白水平明顯增高，反映整個細胞的炎癥損傷反應啟動，炎癥介質和細胞因子開始大量合成；10 μg/mL時NF-κB蛋白水平又回到一個相對低的水平，可能與細胞損傷過重、細胞破壞致NF-κB蛋白檢出減少有關，正如在鏡下所觀察到的，當泛素濃度達到30~50 μg/mL時，HUVECs開始大量的腫脹、崩解，出現明顯的損傷。因此，疾病狀態下血清泛素濃度的過度升高可能是導致血管內皮細胞損傷、血管通透性改變的眾多因素之一。在既往動物實驗中，泛素的作用也是與濃度相關的[12]，但主要表現出來的是減少血管通透性、減輕內皮損傷，故泛素在體內的作用可能是與其他因素協同發揮的，是對機體內不同細胞、組織產生的不同作用相互影響、疊加后的結果，單純泛素對血管內皮細胞的作用應是以刺激、損傷為主。
而巨噬細胞是一種負有保衛責任的免疫炎癥細胞，生理濃度范圍內的泛素對其的損傷(激發炎癥反應)作用較小，只是隨著濃度的增加，損傷作用才逐步顯現。同時，對于高濃度泛素，巨噬細胞較血管內皮細胞有更好的耐受性，在研究的泛素濃度內，沒有出現因損傷過重而導致的細胞因子、NF-κB蛋白水平大幅度降低的情況。
在機體中，各器官組織細胞是機體正常運作的基本組成。而血液細胞則是服務于器官組織細胞，為之提供各種生命要素，帶走代謝廢物，并肩負著保衛和修復器官組織細胞的作用；同時，血液細胞也是整個機體中的各種器官組織細胞相互聯系、影響的媒介和橋梁。這時，細胞外的泛素通過“預應激”式的損傷增加了局部組織細胞的抗損傷能力，但并不刺激對負有保衛職責的血液細胞，這樣就使損害及相應的反應僅限于局部，不出現全身性改變。當然，隨著損害程度的增高，這種抗損害機制不再滿足需要，取而代之的是更為強烈的炎癥反應，機體則會表現出不同程度的疾病征象。這正是當損害并不嚴重時機體所需要的一種內源性免疫調節機制，因此細胞外的泛素又被看成一種損傷相關分子模式(damage-associated molecule pattern，DAMPs)的內源性拮抗劑[2]。但高濃度的泛素為什么會有如此嚴重的破壞性，其機制和生理意義是什么，則需要進一步的研究來解釋。
至于外源性泛素未能對LPS誘導的HUVECs損傷產生保護作用，除可能是因為本次實驗未能考查泛素其他的濃度和干預的時機外，還可能是由于泛素的體內協同因素未能參與。
總之，本研究并未發現泛素對體外培養的HUVECs有明確的保護作用，但對HUVECs和巨噬細胞這兩種細胞的作用是有差別的，而這種差別可能是泛素發揮免疫調理、拮抗損傷作用的基礎。此外，泛素在機體內的作用應是協同其他機制共同發揮的，因此今后的研究應充分考慮到泛素的體內和體外這兩者實驗效應的不同。
泛素是由76個氨基酸組成的多肽，普遍存在于所有真核細胞中。其在細胞內主要通過蛋白質的泛素化發揮多種生理及病理作用，如三磷酸腺苷(ATP)依賴的選擇性蛋白質降解路徑，即泛素-蛋白酶體路徑 [1]。細胞外的泛素則被看作是一種熱休克蛋白，近年來的研究認為其具有類似免疫調理的作用，主要表現為抑制炎癥反應、減輕炎癥損傷、抑制免疫排斥反應以及影響細胞凋亡這幾個方面[2-3]。在不同種類的細胞研究中，其作用略有差別，例如泛素可以抑制人造血祖細胞、髓系和淋巴細胞系造血細胞的生長，誘導細胞凋亡，卻能顯著地減少大鼠心肌細胞的凋亡[4-5]；外源性泛素上調脂多糖(LPS)刺激的小鼠巨噬細胞腫瘤壞死因子α(TNF-α) mRNA的合成，卻下調LPS刺激的人外周血單核細胞TNF-α mRNA的合成[6-7]。由于在既往的多個動物實驗中，外源性給予泛素可明顯減輕腦、肺組織損傷水腫，降低內皮源性炎癥因子的生成[8-12]，因此我們推測血管內皮細胞可能是外源性泛素在體內的靶器官之一，外源性給予泛素可以減輕病理條件下血管內皮細胞的損傷，這種作用應是與泛素劑量密切相關，并不是越高越好；此外，泛素對體內對不同功能的細胞作用可能并不一致，如對組織細胞和炎癥細胞的作用可能不一樣。本次研究以體外培養的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)和人巨噬細胞為對象，觀察研究外源性泛素對正常狀態的內皮細胞和巨噬細胞的影響，以及泛素是否對LPS誘導的HUVECs損傷具有保護作用。
材料與方法
一 材料
HUVECs和人巨噬細胞由南京明基醫院胸腔醫學中心實驗室提供，泛素(U6523)和LPS(L2508)購自Sigma公司，胎牛血清和DMEM 培養液購自Gibco公司，人TNF-α和血管細胞粘附分子1(VCAM-1)ELISA試劑盒(EK0525&EK0537) 購自武漢博士德公司，鼠抗人核因子κB(NF-κB)抗體(ab55560)購自Abcam公司，羊抗大鼠二抗(IgG-HRP，B2112)購自Santa Cruz公司。
二 方法
1．細胞培養：細胞復蘇后加10%胎牛血清DMEM培養液置于37 ℃ 5%CO2細胞培養箱內培養，培養液中加入100 U/mL青霉素鏈霉素雙抗。傳代后即使用5%胎牛血清DMEM培養液培養，使用第3、4代細胞進行實驗。
2．實驗設計與分組：首先，用濃度為0.1、1、10和50 μg/mL的泛素干預體外培養的HUVECs，干預后24 h在顯微鏡下觀察細胞形態的變化。根據觀察結果，選擇4個泛素濃度作為下一步的實驗濃度。將體外培養的HUVECs和人巨噬細胞分為5組：泛素0.01 μg/mL組、0.1 μg/mL組、1 μg/mL組、10 μg/mL組，以及空白對照組。分別于泛素干預后8、16和24 h收集各組細胞上清測定TNF-α和VCAM-1水平，干預后24 h收集細胞測定NF-κB蛋白水平。選擇4個泛素濃度組中對HUVECs影響較為明顯的一組的泛素濃度干預10 μg/mL LPS誘導的HUVECs，分別于干預后8、16和24 h收集細胞上清測定TNF-α和VCAM-1水平。
3．ELISA測定TNF-α和VCAM-1水平：取細胞培養的上清4 ℃ 1000 r/min離心5 min取上清，－20 ℃分管凍存。ELISA的操作按說明書進行。
4．Western blot測定NF-κB蛋白水平：收獲細胞后加適量細胞裂解液冰上裂解30 min，每隔10 min振蕩1次，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min后取上清－80 ℃分管凍存。測定時，首先BCA法測定樣品蛋白濃度，取等量蛋白40 μg加上樣緩沖液、PBS至20 μL，沸水浴5 min，上樣；10%SDS-PAGE分離膠、5%濃縮膠電泳，切膠后300 mA濕轉100 min左右，5%脫脂牛奶TBST室溫封閉1 h，TBST洗膜后一抗4 ℃過夜，TBST洗膜，二抗37 ℃孵育90 min，TBST洗膜后顯影拍照，以β-actin為內參照。
三 統計學處理
采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析。多組比較采用單因素方差分析(Oneway ANOVA)。P<0.05為差異有統計學意義。
結果
一 泛素干預24 h對HUVECs的影響
1．HUVECs的形態學變化：泛素濃度在10 μg/mL 以下時，細胞形態未發生明顯變化。但當泛素濃度達到50 μg/mL時，細胞開始呈氣球樣變并大量死亡。結果見圖 1。
圖1
泛素對HUVECs的影響的形態學觀察(×200) a．泛素50 μg/mL干預24 h；b．空白對照組
2．細胞上清TNF-α和VCAM-1水平：泛素干預24 h后，各泛素干預組的細胞上清TNF-α和VCAM-1 水平兩者變化趨勢基本一致，均為泛素0.01μg/mL組TNF-α和VCAM-1水平最高，泛素0.1 μg/mL組開始回落，至泛素10 μg/mL組TNF-α和VCAM-1水平已與空白對照組相似。總體上，細胞上清VCAM-1水平遠較TNF-α水平高，故組間的變化趨勢更為明顯，其中泛素0.01 μg/mL組、泛素1 μg/mL組與空白對照組結果比較差異有統計學意義。結果見圖 2。
圖2
不同濃度泛素干預24 h后HUVECs細胞上清TNF-α和VCAM-1水平
與空白對照組比較，*
3．細胞NF-κ B水平：泛素0.01 μg/mL組的NF-κB水平與空白對照組相似，略有減低的趨勢；泛素0.1 μg/mL組和泛素1 μg/mL組NF-κB水平較空白對照組明顯增高，泛素10 μg/mL組較低，較空白對照組亦明顯減低。結果見圖 3。
圖3
不同濃度泛素干預HUVECs 24 h后NF-κB水平
二 泛素對人巨噬細胞的影響
1．細胞上清TNF-α和VCAM-1水平：泛素干預24 h后，空白對照組及4個泛素干預組的細胞上清TNF-α水平總體在一個較低的水平，而細胞上清VCAM-1水平較TNF-α高，但兩者的變化趨勢相似，即隨著干預濃度的增加，各泛素組的TNF-α和VCAM-1水平呈現逐步上升的趨勢，泛素10 μg/mL組最高。其中，泛素10 μg/mL組VCAM-1水平與空白對照組和泛素0.01 μg/mL組差異有顯著的統計學意義。結果見圖 4。
圖4
不同濃度泛素干預人巨噬細胞24 h后細胞上清TNF-α和VCAM-1水平
與空白對照組比較，*
2．細胞NF-κB水平：泛素0.1 μg/mL組和泛素1 μg/mL組NF-κB水平較高，泛素0.01 μg/mL組和泛素10 μg/mL組的NF-κB水平較空白對照組低，其中泛素0.01 μg/mL組偏低更為明顯。結果見圖 5。
圖5
不同濃度泛素干預人巨噬細胞24 h后NF-κB水平
三 0.1 μg/mL泛素對10 μg/mL LPS的誘導HUVECs細胞上清TNF-α和VCAM-1水平的影響
LPS組8、16、24 h的TNF-α水平呈逐步上升的趨勢，其中8 h與16、24 h的結果差異有統計學意義(P<0.05)。泛素+LPS組TNF-α水平時間點的變化趨勢相同，其中8 h與24 h的結果差異有統計學意義(P<0.05)；但各時間點LPS組和泛素+LPS組的TNF-α水平相似，差異均無統計學意義(P> 0.05)。各時間點LPS組及泛素+LPS組的VCAM-1 水平變化趨勢不明顯，且各時間點間及各組間差異均無統計學意義(P>0.05)。結果見圖 6。
圖6
泛素0.1 μg/mL干預LPS 10 μg/mL誘導的HUVECs細胞上清TNF-α和VCAM-1水平
討論
正常情況下，人血清中泛素的濃度在10~100 ng/mL。一般認為正常的細胞排泌、死亡等過程會釋放泛素，使細胞外的泛素濃度保持在一個較低且恒定的水平[2]。多種病理因素導致的組織細胞破壞和死亡會使釋放的泛素增多，引起組織間液、血清中泛素濃度成倍地升高，如膿毒癥患者的血清泛素濃度是正常狀況下的5~7倍[8, 13-15]。以往的研究主要關注泛素的組織器官保護作用，但從本次研究的結果來看，這一作用是一定濃度范圍之內的泛素才具備的，高濃度的泛素對組織器官有明顯的損傷作用，不論從生物學指標還是形態學上都能得到體現。
隨著泛素干預濃度的升高，HUVECs細胞上清TNF-α和VCAM-1水平是呈先升高后降低的變化趨勢，而人巨噬細胞的TNF-α和VCAM-1水平則是呈逐步升高的趨勢；但兩者NF-κB蛋白水平的變化趨勢卻略相似，即泛素濃度為0.1 μg/mL和1 μg/mL時明顯增高，0.01 μg/mL和10 μg/mL時增高不明顯，甚至有減低的趨勢，其中HUVECs減低的趨勢更為明顯。
0.01 μg/mL和0.1 μg/mL分別是生理狀態下人血清游離泛素濃度的低限和高限，此時HUVECs生成的TNF-α和VCAM-1較高，而1 μg/mL和10 μg/mL時卻較低。這提示在正常情況下，血液中或血管內皮細胞表面存在著抑制泛素作用的成分，一旦抑制的因素去除，生理濃度范圍內的泛素就會損傷血管內皮細胞；而這種損傷可能具有一定“預應激”的作用，可將血管內皮細胞調至適當的應激狀態，從而減輕后續損傷因素的損害作用；但過高濃度的泛素由于其對血管內皮細胞的損害作用過重，所以檢測出的相關細胞因子濃度的增加并不明顯。泛素濃度為0.01 μg/mL時NF-κB蛋白水平未明顯增高，提示此時細胞對細胞因子的轉錄合成并未增加，釋放的主要為細胞內儲備的細胞因子，細胞內部及外圍細胞因子濃度的升高可能會對NF-κB產生一個輕微的抑制作用；而0.1 μg/mL和1 μg/mL時NF-κB蛋白水平明顯增高，反映整個細胞的炎癥損傷反應啟動，炎癥介質和細胞因子開始大量合成；10 μg/mL時NF-κB蛋白水平又回到一個相對低的水平，可能與細胞損傷過重、細胞破壞致NF-κB蛋白檢出減少有關，正如在鏡下所觀察到的，當泛素濃度達到30~50 μg/mL時，HUVECs開始大量的腫脹、崩解，出現明顯的損傷。因此，疾病狀態下血清泛素濃度的過度升高可能是導致血管內皮細胞損傷、血管通透性改變的眾多因素之一。在既往動物實驗中，泛素的作用也是與濃度相關的[12]，但主要表現出來的是減少血管通透性、減輕內皮損傷，故泛素在體內的作用可能是與其他因素協同發揮的，是對機體內不同細胞、組織產生的不同作用相互影響、疊加后的結果，單純泛素對血管內皮細胞的作用應是以刺激、損傷為主。
而巨噬細胞是一種負有保衛責任的免疫炎癥細胞，生理濃度范圍內的泛素對其的損傷(激發炎癥反應)作用較小，只是隨著濃度的增加，損傷作用才逐步顯現。同時，對于高濃度泛素，巨噬細胞較血管內皮細胞有更好的耐受性，在研究的泛素濃度內，沒有出現因損傷過重而導致的細胞因子、NF-κB蛋白水平大幅度降低的情況。
在機體中，各器官組織細胞是機體正常運作的基本組成。而血液細胞則是服務于器官組織細胞，為之提供各種生命要素，帶走代謝廢物，并肩負著保衛和修復器官組織細胞的作用；同時，血液細胞也是整個機體中的各種器官組織細胞相互聯系、影響的媒介和橋梁。這時，細胞外的泛素通過“預應激”式的損傷增加了局部組織細胞的抗損傷能力，但并不刺激對負有保衛職責的血液細胞，這樣就使損害及相應的反應僅限于局部，不出現全身性改變。當然，隨著損害程度的增高，這種抗損害機制不再滿足需要，取而代之的是更為強烈的炎癥反應，機體則會表現出不同程度的疾病征象。這正是當損害并不嚴重時機體所需要的一種內源性免疫調節機制，因此細胞外的泛素又被看成一種損傷相關分子模式(damage-associated molecule pattern，DAMPs)的內源性拮抗劑[2]。但高濃度的泛素為什么會有如此嚴重的破壞性，其機制和生理意義是什么，則需要進一步的研究來解釋。
至于外源性泛素未能對LPS誘導的HUVECs損傷產生保護作用，除可能是因為本次實驗未能考查泛素其他的濃度和干預的時機外，還可能是由于泛素的體內協同因素未能參與。
總之，本研究并未發現泛素對體外培養的HUVECs有明確的保護作用，但對HUVECs和巨噬細胞這兩種細胞的作用是有差別的，而這種差別可能是泛素發揮免疫調理、拮抗損傷作用的基礎。此外，泛素在機體內的作用應是協同其他機制共同發揮的，因此今后的研究應充分考慮到泛素的體內和體外這兩者實驗效應的不同。
