骨髓間充質干細胞通過抑制髓系抑制細胞預防肺纖維化形成_《中國呼吸與危重監護雜志》

作者：

尹燕鋒 ¹ , 楊柳 ¹ , 于璐 ² , 王翼寅 ¹ , 陳睿 ¹ ,  周開華 ³ ,  蘇曉三 ¹

1. 昆明醫科大學附屬甘美醫院生物醫學實驗中心（云南昆明 650011）;
2. 昆明醫科大學附屬甘美醫院病理科（云南昆明 650011）;
3. 昆明醫科大學附屬甘美醫院呼吸科（云南昆明 650011）;

關鍵詞：

肺纖維化間充質干細胞髓系抑制細胞博來霉素

DOI：

10.7507/1671-6205.201906010

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的探討 Gr-1⁺CD11b⁺髓系抑制細胞（MDSC）在博來霉素（BLM）誘導小鼠肺纖維化形成中的作用以及骨髓間充質干細胞（MSC）對肺纖維化治療作用的可能機制。方法體外分離培養 6 周齡雄性 BALB/c 小鼠間充質干細胞（MSC）。將 104 只雌性 BALB/c 小鼠按隨機數字表法分為 3 組：對照組（32 只）氣管內注入生理鹽水（NS）后經尾靜脈注射 NS；BLM 組（32 只）氣管內注入 BLM 后經尾靜脈注射 NS；MSC 組（40 只）氣管內注入 BLM 后經尾靜脈注射 MSC（細胞總數 1.5×10⁶個）。于造模后第 1、3、5、8、11、14、18、21、25、32 天采集各組小鼠尾靜脈血，流式細胞術檢測外周血單個核細胞（PBMC）中 Gr-1⁺CD11b⁺細胞含量。于造模后第 3、8、18 和 32 天各組均處死 8 只小鼠并摘取小鼠肺臟流式細胞術檢測小鼠肺組織中 Gr-1⁺CD11b⁺細胞含量，同時留取肺組織行 Masson 染色。提取 MSC 組小鼠肺組織的 DNA，通過聚合酶鏈反應（PCR）-瓊脂糖電泳法檢測小鼠的性別決定基因（sry 基因）。結果 MSC 組第 3 和第 8 天時肺泡炎較 BLM 組減輕（分別為 1.32±0.25 和 2.53±0.56；1.06±0.42 和 2.27±0.82，均 P<0.01）；MSC 組第 18 和第 32 天時肺纖維化較 BLM 組減輕（分別為 1.02±0.44 和 1.81±0.74；1.51±0.73 和 2.72±0.54，均 P<0.05）。BLM 組小鼠 PBMC 和肺組織中 Gr-1⁺CD11b⁺細胞較對照組顯著升高；MSC 組小鼠 PBMC 和肺組織中 Gr-1⁺CD11b⁺細胞較 BLM 組明顯降低（P<0.05）。PCR 檢測結果顯示，在 MSC 治療后第 12、24、48、72 和 96 h 小鼠肺組織可以檢測到 sry 基因。結論 MDSC 參與 BLM 誘導的肺纖維化形成，MSC 可以通過抑制 MDSC 預防肺纖維化形成。

引用本文： 尹燕鋒, 楊柳, 于璐, 王翼寅, 陳睿, 周開華, 蘇曉三. 骨髓間充質干細胞通過抑制髓系抑制細胞預防肺纖維化形成. 中國呼吸與危重監護雜志, 2021, 20(5): 339-344. doi: 10.7507/1671-6205.201906010 復制

間充質干細胞（MSC）對博來霉素（BLM）誘導的肺纖維化的小鼠模型^[1]有很好的治療作用^[2-3]，但關于其治療機制的研究相對較少且不全面。本研究觀察應用小鼠骨髓 MSC 干預 BLM 誘導的小鼠肺纖維化進程，通過分析小鼠外周血和肺組織中 Gr-1⁺CD11b⁺髓系抑制細胞（MDSC）的變化，探討 Gr-1⁺CD11b⁺細胞是否參與 BLM 誘導小鼠肺纖維化形成，進一步探討 MSC 是否通過抑制 Gr-1⁺CD11b⁺細胞預防肺纖維化的形成。

1 材料與方法

1.1 材料

取無特定病原體級 BALB/c 小鼠（北京維通利華實驗動物有限公司，SCXK（京）2016-0006），6 周齡，體重 18～22 g，平均體重為 18.5 g。寄養于昆明醫科大學動物實驗中心，中心資質批準號為 SCXK（滇）K2020-0006。所有實驗操作與實驗流程嚴格遵守《實驗動物管理條例》。

1.2 方法

1.2.1 小鼠 MSC 制備

取雄性 BALB/c 小鼠，頸椎脫臼處死，在無菌條件下剝離股骨和脛骨，剪去骨骺端，用注射器以不含血清 α-MEM（美國 Hyclone 公司）沖洗骨髓腔，沖出液用 200 目尼龍網過濾，濾液離心棄上清，用含 10% 胎牛血清（美國 Gibco 公司）的 α-MEM 完全培養基重懸細胞，計數后按 1×10⁶/cm² 接種于 25 cm² 的培養瓶中，置于 37 ℃，飽和濕度，5% CO₂ 濃度的培養箱中培養，每 2～3 天更換新鮮完全培養基。待細胞達到 90% 以上融合時，用 0.25% 胰酶（美國 Hyclone 公司）消化，按 1∶3 的比例傳代，待第 3 代（P₃）MSC 達到 90% 以上融合時，消化并收集細胞備用。

1.2.2 小鼠 MSC 的鑒定

① 流式細胞術鑒定細胞表型：收集 P₃ 代 MSC，采用單色直接免疫熒光標記 MSC（分別進行 CD34、CD44、CD45 和 CD90 染色），并進行流式細胞術分析。② 誘導成脂分化：將 P₃ 代 MSC 接種于 24 孔培養板（每孔 1×10⁴ 個細胞），貼壁生長 48 h 加入成脂誘導劑（地塞米松 1 μmol/L+3-利福定-1-1 甲基黃嘌呤 0.5 μmol/L+吲哚美辛 100 μmol/L）。每 3 天換 1 次液，連續培養。第 14 天進行油紅 O 染色，顯微鏡下觀察、照相。③ 誘導成骨分化：將 P₃ 代 MSC 接種于 24 孔培養板（每孔 1×10⁴ 個細胞），貼壁生長 48 h 加入成骨誘導劑（地塞米松 1 μmol/L+β-磷酸甘油 10 nmol/L+維生素 C 0.05 nmol/L）。每 3 天換 1 次液，連續培養。第 21 天進行茜素紅染色，顯微鏡下觀察、照相。

1.2.3 小鼠肺纖維化模型

將雌性 BALB/c 小鼠 104 只隨機分為 3 組：對照組 32 只，氣管內注射生理鹽水（NS），24 h 后尾靜脈注射 NS；BLM 組 32 只，氣管內注入 BLM（浙江海正藥業股份有限公司），24 h 后尾靜脈注射 NS；干細胞組（MSC 組）40 只，氣管內注入 BLM，24 h 后尾靜脈注射 MSC。分組后小鼠經 1% 戊巴比妥（美國 Sigma 公司）按 50 mg/kg 腹腔注射麻醉，待小鼠麻醉后按 5 mg/kg 向 BLM 組和 MSC 組小鼠氣管一次性注入 BLM，向對照組小鼠氣管內注入相同體積的 NS。注射完畢后立即將小鼠直立、旋轉，使藥物盡量在肺中分布均勻。于造模后的第 1、2 和 3 天，每天向對照組和 BLM 組小鼠尾靜脈注入一次 NS，0.5 mL；MSC 組尾靜脈注射一次 MSC，0.5 mL（含細胞數 0.5×10⁶個）。

1.2.4 小鼠肺組織病理學觀察和形態定量分析

于造模后的第 3、8、18 和 32 天每組分別處死 8 只小鼠，肺組織經 4% 福爾馬林固定 16 h 后取材，常規酒精脫水、石蠟包埋和切片，蘇木精–伊紅和 Masson 染色后光學顯微鏡下觀察病理變化。依據文獻[4]的方法確定肺泡炎和肺纖維化程度。每張切片選取 10 個視野，每只小鼠觀察 3 張切片，取中位數。所有病理切片均隨機排列、標號，每張切片由兩位有經驗的病理醫師獨立進行評分，取其平均值作為最后得分。

1.2.5 流式細胞術檢測 Gr-1⁺CD11b⁺ 細胞的含量

于造模后第 1、3、5、8、11、14、18、21、25、32 天每組采集 8 只小鼠尾靜脈血（100 μL/小鼠），加入 FITC-Gr-1 和 PE-CD11b（美國 BD 公司）后避光孵育 30 min，裂解紅細胞后磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞，流式細胞儀檢測外周血單個核細胞（PBMC）中 Gr-1⁺CD11b⁺ 細胞。于造模后第 3、8、18 和 32 天每組處死 8 只小鼠摘取小鼠肺臟，每只小鼠左右肺各摘取相同位置肺葉 2 片，經組織勻漿后 200 目尼龍網過濾，濾液離心后棄上清，細胞重懸于 PBS，FITC-Gr-1、PE-CD11b 和 PE-CY5-CD45 標記后流式細胞儀檢測肺組織 CD45⁺ 單個核細胞（MNC）中 Gr-1⁺CD11b⁺ 細胞。另外，于造模前（第 0 天）取 5 只雌性 BALB/c 小鼠脫頸處死后取外周血和肺，按上述方法檢測 Gr-1⁺CD11b⁺ 細胞。

1.2.6 聚合酶鏈反應檢測小鼠肺組織中雄小鼠來源 MSC

sry 基因為 Y 染色體上的性別決定基因，僅存在于雄性動物的細胞核中。本實驗以此基因為天然標志物，通過檢測雌性小鼠肺組織內是否存在此基因，來判斷移植的雄性小鼠 MSC 在雌性小鼠體內存活時間。引物由上海生工根據設計合成，用 Primer 5.0 軟件設計小鼠sry基因引物：上游引物 5’-GTCAAGCGCCCCATGAATGCAT-3’，下游引物 5’-AGTTTGGGTATTTCTCTCTGTG-3’，產物長度為 201 bp。MSC 組于最后一次注射 MSC 后第 12 h 及第 1、2、3、4、5、6、7、11、15 和 29 天摘取小鼠肺臟，酚、氯仿法提取肺組織 DNA。聚合酶鏈反應（PCR）擴增反應條件：94 ℃ 預變性 5 min，94 ℃ 變性 30 s，62 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，循環 40 次，72 ℃ 充分延伸 5 min。以 2% 瓊脂糖凝膠電泳（100 V、30 min）分析 PCR 產物，并與雄性和雌性小鼠肺組織提取 DNA 的 PCR 擴增產物的電泳結果相比較。

1.3 統計學方法

采用 SPSS 13.0 統計軟件。數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較行 LSD-t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠 MSC 培養和鑒定

P₃ 代 MSC 經流式細胞儀檢測 CD44、CD90 陽性，CD34、CD45 陰性，符合 MSC 表面特征（圖 1a）；P₃ 代 MSC 分別在相應的誘導培養基中培養，2 周后可以分化為脂肪細胞，3 周后可以分化為成骨細胞（圖 1b、c）。

圖1 P₃ 代 MSC 細胞表型鑒定和定向誘導培養結果　

a. 細胞表型流式細胞術檢測像，高表達 CD44、CD90，低表達 CD34、CD45；b. 成脂誘導培養檢測像（油紅 O×100）；c. 成骨誘導培養檢測像（茜素紅×100）。

圖選項

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2.2 小鼠肺組織病理學觀察

BLM 組經氣管注射 BLM 后第 8 天可見肺泡間隔增寬，部分肺組織重建，肺泡間隔內炎癥細胞增多；第 32 天肺泡結構消失，大量藍色膠原蛋白沉積在增寬的肺泡間隔，提示肺纖維化模型制作成功（圖 2a、g）。對照組小鼠肺泡結構正常，肺泡壁未見增厚，也未見明顯炎性細胞浸潤（圖 2b、h）；MSC 組小鼠肺組織病理變化較 BLM 組明顯減輕，其肺泡炎評分和纖維化程度評分較 BLM 組顯著降低（圖 2c、i，表 1）。

表1 各組小鼠不同時間病理改變評分比較［分，（

）］

表選項

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檢測時間（d）	小鼠數量	肺泡炎		肺纖維化
3	8	0.21±0.14	2.53±0.56	1.32±0.25^b	0.06±0.05	0.37±0.41	0.32±0.23
8	8	0.15±0.08	2.27±0.82	1.06±0.42^b	0.08±0.06	0.62±0.43	0.47±0.33
18	8	0.18±0.11	1.41±0.54	0.84±0.14^a	0.10±0.14	1.81±0.74	1.02±0.44^b
32	8	0.06±0.09	1.07±0.46	0.73±0.28	0.02±0.04	2.72±0.54	1.51±0.73^b
與 BLM 組比較，^a P<0.05，^b P<0.01。

圖2 各組小鼠肺組織病理檢查像（Masson）

BLM 組小鼠第 8 天（a、d）可見肺泡間隔增寬，部分肺組織重建，第 32 天（g、j）肺泡結構消失，肺間質中見大量藍色膠原蛋白沉積；對照組第 8 天（b、e）和第 32 天（h、k）肺泡結構良好，無明顯病理改變；MSC 組第 8 天（c、f）和第 32 天（i、l）小鼠肺組織病理變化較 BLM 組明顯減輕。

圖選項

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2.3 各組小鼠外周血和肺組織中 GR-1⁺CD11b⁺細胞變化

與對照組相比，BLM 組小鼠造模后 PBMC 中 Gr-1⁺CD11b⁺ 細胞迅速升高，于第 3 天時達峰值（P<0.01）；MSC 組小鼠造模后 PBMC 中 Gr-1⁺CD11b⁺ 細胞顯著低于 BLM 組。同時，BLM 組小鼠肺組織 MNC 中 Gr-1⁺CD11b⁺ 細胞于造模后第 3、8、18 和 32 天時較對照組顯著升高；MSC 組小鼠肺組織 MNC 中 Gr-1⁺CD11b⁺ 細胞顯著低于 BLM 組（表 2）。

表2 各組小鼠外周血和肺組織中 Gr-1⁺CD11b⁺ 細胞百分比比較［%，（

）］

表選項

下載CSV

檢測時間（d）	小鼠數量	外周血		肺組織
0	5	7.04±1.04	7.04±1.04	7.04±1.04	4.62±1.53	4.62±1.53	4.62±1.53
1	8	10.26±2.74	19.04±1.27^b	15.11±2.31^c
3	8	10.74±2.74	28.23±6.52 ^b	16.31±4.31^d	5.12±2.74	21.03±8.2 ^b	11.65±4.31^d
5	8	10.08±1.08	20.55±4.55 ^b	13.34±3.34^d
8	8	8.25±1.88	16.49±5.49 ^b	11.05±2.05^d	4.75±2.26	17.93±6.23 ^b	9.89±3.61^d
11	8	6.98±2.98	15.81±4.81 ^b	9.31±3.31^d
14	8	7.45±2.25	10.84±5.84 ^a	7.34±3.34^c
18	8	7.03±2.03	10.26±2.26 ^a	6.13±3.13^c	4.35±1.08	10.1±4.55 ^b	6.07±3.34^c
21	8	7.27±1.27	11.86±4.86^a	7.48±4.48^c
25	8	7.57±3.74	10.91±4.91^a	7.78±3.78 ^c
32	8	7.45±2.35	9.52±3.52 ^a	7.98±3.98 ^c	5.46±1.88	11.47±4.49 ^b	6.87±2.05^c
與對照組比較，^a P<0.05；^b P<0.01；與 BLM 組比較，^c P<0.05；^d P<0.01。

2.4 小鼠肺組織 sry 基因檢測

小鼠肺組織提取的 DNA 經 PCR 擴增后，電泳結果顯示雄性小鼠可見 1 條 201 bp 的條帶，MSC 組雌小鼠于移植 MSC 后第 12、24、48、72 和 96 h 也可見此條帶，但隨時間的延長條帶逐漸變淡，96 h 條帶已經很淡，條帶位置與雄性小鼠相同（圖 3）。

圖3 小鼠肺組織的 sry 基因 PCR 檢測像　

隨時間延長 sry 基因條帶逐漸變淡

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3 討論

特發性肺纖維化是一種特殊類型的原因不明、慢性進展性、纖維化型間質性肺炎^[5]。目前，對特發性肺纖維化的治療缺乏有效藥物且預后不佳。從其發病過程來看，主要是在肺損傷前期機體動員大量炎癥細胞（如單核/巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞）聚集在肺部，并且這些炎癥細胞會分泌大量包括轉化生長因子-β 在內的細胞因子，而這些細胞因子進一步促進了肺纖維化的形成^[6]。MSC 對很多實質器官的纖維化均有一定療效，例如腎、肝、肺等。目前的研究結果顯示 MSC 對肺纖維化的治療機制可能與 MSC 遷移定植分化、旁分泌細胞因子及免疫調節等方面有關^[7]。

MDSC 是一類異質性細胞群體，由不同分化階段的髓系細胞如單核細胞、粒細胞及未成熟的巨噬細胞、樹突狀細胞等組成。最早發現 MDSC 是在小鼠體內，表達粒細胞和單核細胞的標記 Gr-1 和 CD11b^[8]。MDSC 具有高度的可塑性，在適當的培養條件下可以分化為功能和形態完全正常的髓系終末細胞。病理狀態下（如腫瘤、感染及創傷應激），大量的細胞因子產生，影響 MDSC 的分化、發育和成熟，導致大量的 MDSC 在骨髓、血液、脾臟、淋巴結及疾病發生部位聚集并且活化，并發揮免疫調控功能。MDSC 是否參與 BLM 誘導的肺損傷及肺纖維化目前尚無報道。將綠色熒光蛋白轉基因小鼠的骨髓細胞移植到 BLM 所致肺損傷的野生小鼠，結果肺損傷促進移植的骨髓細胞遷移至肺臟，這些細胞在肺臟可以分化為成纖維細胞并產生膠原，提示這種細胞有可能促進肺纖維化的形成^[9]。Ortiz 等^[10]發現吸煙誘發慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）小鼠模型中從骨髓動員并釋放至外周的不成熟髓系細胞雖然表型為 GR-1⁺CD11b⁺ 但其并不具有免疫抑制功能，當慢阻肺小鼠經致癌劑氨基甲酸乙酯誘導成肺癌后 GR-1⁺CD11b⁺ 細胞才獲得了免疫抑制的特性，即真正的 MDSC。該研究提示慢阻肺與肺癌兩種不同疾病過程中 GR-1⁺CD11b⁺ 細胞具有不同的生物學功能。從本研究看，在 BLM 所致的小鼠肺損傷和肺纖維化過程中小鼠外周血和肺組織中 GR-1⁺CD11b⁺ 細胞顯著升高，該結果提示 GR-1⁺CD11b⁺細胞可能參與了上述病理過程。但 BLM 所致肺損傷和肺纖維化形成后小鼠體內 GR-1⁺CD11b⁺ 細胞的生物學特性是否一致尚需進一步研究。

MSC 具有趨化性，可定向遷移至相應的靶器官。Anjos-Afonso 等^[11]從微損傷而非疾病模型的小鼠靜脈注入 MSC，發現輸入后的第 1 天，肺、肝、腎組織及外周血內即可發現標記的 MSC；輸入第 7 天，肌肉、心、腦、脾中也可檢測到 MSC 的分布。在病理條件下，體內植入的 MSC 有向損傷組織遷移定位并分化為相應組織細胞的能力，這也是其能在多種疾病的治療中發揮作用的重要機制之一。但不同的實驗對 MSC 在肺臟轉化方向的描述不完全相同，說明 MSC 的肺臟遷移和定向分化受多方面因素的影響^[3]。崔璦等^[12]及 Ortiz 等^[13]在 BLM 致肺損傷后第 l 天給予 MSC 可顯著抑制大鼠肺纖維化形成，而在第 7 天給予 MSC 不能抑制肺纖維化形成。該研究提示 MSC 可能通過抑制 BLM 誘導肺損傷早期的炎癥反應進而抑制肺纖維化形成。我們課題組前期的研究發現手術應激誘導 MDSC 并促腫瘤肺轉移形成，MSC 可以抑制 MDSC 的生成進而抑制手術后肺轉移^[14]。本研究證實經靜脈回輸至 BLM 誘導肺損傷小鼠體內的 MSC 存活時間僅為 4 d，因此，我們認為 MSC 并非依靠在肺損傷局部定向分化為肺組織細胞來修復肺損傷并抑制肺纖維化的形成，而可能是通過 MSC 抑制肺損傷早期 GR-1⁺CD11b⁺細胞來減輕肺泡炎并最終減輕肺纖維化的程度。

綜上所述，急性肺損傷可刺激 MDSC 活化、增殖并釋放至外周血中，這些 MDSC 在機體抗感染及促進創傷修復過程中起著關鍵作用，但這些 MDSC 也可能直接或間接地參與了肺纖維化的病理進程。本文研究結果提示在肺損傷早期采用 MSC 可以遷移到損傷的肺臟，發揮抑制 MDSC 進而抑制肺泡炎和肺纖維化的作用。我們將對 MDSC 參與肺纖維化形成以及 MSC 抑制 MDSC 的細胞和分子機制進行深入研究。

利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。