引用本文： 陳鴻運, 李曉明, 黃國勝, 楊金華, 喬飛. 沉默 UBE2T 基因表達對 A549 細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲能力的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2021, 20(8): 577-583. doi: 10.7507/1671-6205.202011058 復制
肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占約 85%，早期 NSCLC 隱匿性高，多數患者確診時已為中晚期[1-2]，由于缺乏有效的治療手段，患者一般預后較差。尋找與 NSCLC 發生、發展相關的靶分子，對指導針對 NSCLC 的分子靶向藥物研究具有重要意義。泛素結合酶 E2T（UBE2T）是泛素蛋白酶降解系統成員之一，參與調控細胞周期和信號傳導等細胞過程[3]。UBE2T 基因能夠抑制結直腸癌細胞的凋亡，UBE2T 基因表達可促進鼻咽癌細胞增殖、侵襲及轉移[4]。另有研究利用 GEO 數據集分析發現 UBE2T 在肺癌組織中高表達，且與肺癌的多個臨床病理特征有關[5]。但目前 UBE2T 基因在 NSCLC 發生、發展中的具體作用仍不清楚。本研究通過使用短發夾 RNA（shRNA）沉默 UBE2T 基因表達，并觀察其對肺腺癌來源的 A549 細胞增殖、凋亡、侵襲以及遷移等生物學特性的影響，旨在了解 UBE2T 基因在 NSCLC 發生、發展中的作用機制，以期為 NSCLC 的治療尋找新思路。
1 材料與方法
1.1 主要試劑
A549 細胞株（上海匠萊生物科技有限公司），shRNA-UBE2T 及 shRNA-NC 真核質粒載體（上海吉瑪制藥技術有限公司），蛋白印跡（Western blot）檢測用一抗及辣根過氧化物酶標記的 IgG 二抗（美國 CST 公司），DMEM 培養基、胎牛血清（廣州威佳科技有限公司），Opti-MEM 無血清培養基、SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司），Matrigel 基質膠（美國 BD 公司），脂質體轉染試劑 Lipofectamine 2000（美國 Invitrogen 公司），Annexin V/PI 凋亡檢測試劑盒（美國 BD 公司），Transwell 小室（美國 Corning 公司），RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒（上海康朗生物科技有限公司），500 RT-PCR 系統（美國 Applied Biosystems），熒光顯微鏡（日本 OLYMPUS）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養與轉染
取 A549 細胞接種于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基中，置于 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養，待細胞生長匯合率達 85% 以上傳代培養。取生長良好的 A549 細胞用于轉染和后續試驗。采用脂質體轉染試劑分別將 UBE2T-shRNA1、UBE2T-shRNA1 和 UBE2T-shRNA3、shRNA-NC 質粒載體和空載體轉染 A549 細胞，分別記為 UBE2T-shRNA1 組、UBE2T-shRNA2 組、UBE2T-shRNA3 組、shRNA-NC 組和對照組。其中，UBE2T-shRNA1、UBE2T-shRNA1 和 UBE2T-shRNA3 為靶基因特異性干擾序列，shRNA-NC 組為陰性對照序列，均嚴格按照脂質體轉染操作步驟進行。轉染 6 h 后更換正常培養液，48 h 后收集各組細胞，采用逆轉錄–聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測 UBE2T 的低表達效率。
1.2.2 RT-PCR 檢測 UBE2T mRNA 表達
收集轉染 48 h 后各組細胞，使用 Trizol 試劑提取總 RNA，測定 RNA 濃度和純度后，用反轉錄試劑盒合成 cDNA，用 PCR 儀進行擴增，按照試劑盒操作方法檢測各組細胞 mRNA 表達水平，采用 2－ΔΔCt法計算 mRNA 相對表達量。
1.2.3 克隆形成實驗檢測細胞增殖能力
待轉染后各組 A549 細胞培養至對數生長期，消化后離心、磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，以含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基配成單細胞懸液后以 100 個/孔細胞密度接種于 6 孔板中，放入溫度為 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養，每 2 天更換新鮮培養基，于培養 2 周后培養板中出現肉眼可見克隆時，終止培養。棄去培養基并用 PBS 沖洗 2 次，然后分別經 4% 中性甲醇固定 10 min，0.1% 結晶紫染色 15 min 后拍照并在顯微鏡下計數大于 50 個細胞的克隆數，計算克隆形成率。克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。
1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡
常規消化穩定轉染 UBE2T-shRNA3、shRNA-NC 和空載體的 A549 細胞，接種后培養 48 h，消化后離心、PBS 沖洗，收集（1～5）×105個細胞，100 μL Annexin V 結合緩沖液重懸細胞并加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI，輕輕混勻；室溫避光孵育 15 min 并加入 400 μL 結合緩沖液，使用流式細胞儀檢測各組 A549 細胞凋亡情況。
1.2.5 Transwell 實驗檢測細胞侵襲
Matrigel 基質膠以無血清培養基稀釋（1∶6）后，取 100 μL 至 Transwell 小室上室，37 ℃ 孵育至基質膠為固態。待穩定轉染 UBE2T-shRNA3、shRNA-NC 以及空載體的 A549 細胞培養至對數生長期，常規消化細胞，無血清培養基調節細胞密度為 1×105個/mL。取 200 μL 細胞懸液加入上室，下室加入 500 μL 含 10% 胎牛血清的培養基。培養 48 h 后用無菌棉簽擦去小室內細胞，用結晶紫對侵襲至小室下層的細胞進行染色，每孔隨機選取 5 個視野進行計數統計，每組設置 3 個復孔。
1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移
待轉染后各組 A549 細胞培養至對數生長期，消化后離心、PBS 沖洗，以含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基配成單細胞懸液后接種于 24 孔板，2×105個/孔，待細胞生長至鋪滿培養孔后使用 2 mL 槍頭于培養孔中劃一平直線，使用 PBS 清洗，顯微鏡觀察劃痕區域寬度并拍照。將培養基更換為含 2% 胎牛血清的培養基饑餓培養 24 h，再次使用顯微鏡觀察劃痕區域寬度變化并拍照，Image J 軟件測量劃痕區域寬度，并計算各組細胞劃痕愈合率。
1.2.7 Western blot 檢測蛋白表達
收集轉染后對數期生長各組細胞，PBS 沖洗后使用細胞裂解液冰上充分裂解提取總蛋白。BCA 法定量蛋白樣品后，加入適量上樣緩沖液，取 40 μg 蛋白經 SDS-PAGE 電泳轉印至 PVDF 膜，5% 脫脂牛奶室溫封閉 2 h，加入 Ki67、PCNA、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-3 剪切體（Cleaved caspase-3）、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT 及 GAPDH 一抗 4 ℃ 孵育過夜，TBST 洗膜 3 次；最后加二抗室溫下孵育 2 h，ECL 法顯色。采用 Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計算各蛋白相對表達水平。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 軟件統計分析數據，Graphpad Prism 5 作圖。呈正態分布的計量數據以均數±標準差（
±s）表示，多組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較使用 SNK 法。所有檢驗均采取雙側檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 轉染 shRNA-UBE2T 對 UBE2T 轉錄水平的影響
RT-PCR 結果（圖 1）顯示，與對照組和 shRNA-NC 組比較，UBE2T-shRNA1、UBE2T-shRNA2 和 UBE2T-shRNA3 組 UBE2T mRNA 水平顯著下降（均 P<0.05）；與 UBE2T-shRNA1 和 UBE2T-shRNA2 組比較，UBE2T-shRNA3 組 UBE2T mRNA 水平顯著下降（均 P<0.05）。選擇干擾效果最好的 UBE2T-shRNA3 進行后續功能實驗。
圖1
轉染 shRNA-UBE2T 對 UBE2T 轉錄水平的影響
與對照組比較，*
2.2 沉默 UBE2T 對 A549 細胞增殖能力的影響
克隆形成實驗結果顯示，與對照組和 shRNA-NC 組比較，UBE2T-shRNA3 組克隆形成率顯著降低（均 P<0.05）。Western blot 檢測結果表明，UBE2T-shRNA3 組 Ki67、PCNA 蛋白表達相比對照組和 shRNA-NC 組顯著下調（均 P<0.05）；對照組和 shRNA-NC 組克隆形成率及 Ki67、PCNA 蛋白表達比較，差異無統計學意義（均 P>0.05）。結果見圖 2。
圖2
沉默 UBE2T 對 A549 細胞增殖的影響
a、b. 克隆形成實驗檢測 A549 細胞增殖；c、d、e. Western blot 檢測細胞增殖相關蛋白 Ki67、PCNA 表達。與對照組比較，*
2.3 沉默 UBE2T 對 A549 細胞凋亡的影響
流式細胞術檢測結果顯示，與對照組和 shRNA-NC 組比較，UBE2T-shRNA3 組 A549 細胞凋亡率顯著增加（均 P<0.05），對照組和 shRNA-NC 組細胞凋亡率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。Western blot 檢測細胞凋亡標志物 Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3/Caspase-3 比值在 UBE2T-shRNA3 組顯著增加（P<0.05）。結果見圖 3。
圖3
沉默 UBE2T 對 A549 細胞凋亡的影響
a、b. 流式細胞術檢測細胞凋亡；c、d、e. Western blot 檢測細胞增殖相關蛋白 Bax、Bcl-2、Caspase-3 及 Cleaved caspase-3 表達。與對照組比較，*
2.4 沉默 UBE2T 對 A549 細胞侵襲的影響
Transwell 實驗結果顯示，與對照組和 shRNA-NC 組比較，UBE2T-shRNA 組細胞侵襲數明顯減少（均 P<0.05），對照組和 shRNA-NC 組細胞侵襲數比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖 4。
圖4
沉默 UBE2T 對 A549 細胞侵襲的影響
a. Transwell 實驗檢測 A549 細胞侵襲能力；b. 各組 A549 細胞侵襲數。與對照組比較，*
2.5 沉默 UBE2T 對 A549 細胞遷移的影響
劃痕實驗結果顯示，與對照組和 shRNA-NC 組比較，UBE2T-shRNA 組劃痕愈合率明顯降低（均P<0.05），對照組和 shRNA-NC 組劃痕愈合率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖 5。
圖5
沉默 UBE2T 對 A549 細胞遷移的影響
a. 劃痕法檢測各組 A549 細胞遷移；b. 各組 A549 細胞劃痕愈合率。與對照組比較，*
2.6 沉默 UBE2T 對 A549 細胞 PI3K/AKT 信號通路的影響
Western blot 檢測結果顯示，與對照組和 shRNA-NC 組比較，UBE2T-shRNA 組 p-PI3K/PI3K、 p-AKT/AKT 比值顯著降低（均 P<0.05），對照組和 shRNA-NC 組 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 比值比較，差異無統計學意義（均 P>0.05）。結果見圖 6。
圖6
沉默 UBE2T 對 A549 細胞 PI3K/AKT 信號通路的影響
a. Western blot 檢測 PI3K/AKT 信號通路相關蛋白表達；b、c. 各組 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 比值。與對照組比較，*
3 討論
UBE2T 位于 1q32.1 中，屬于泛素蛋白酶降解系統成員之一。生理條件下，泛素結合酶 UBE2T 通過與特定的 E3 泛素連接酶結合而降解特定底物或對底物進行功能性修飾參與調節細胞周期和信號傳導等多種細胞過程。多項研究證實 UBE2T 在腫瘤組織中異常表達，并被認為在腫瘤發生、發展中發揮作用[6-7]。最近研究表明，UBE2T 表達中斷可通過干擾 DNA 損傷–修復反應，直接導致 Fanconi 貧血以及腫瘤細胞對 DNA 交聯損傷試劑的敏感性升高[8]。此外，UBE2T 的過表達被認為會促進乳腺癌的發生[9]。考慮到 UBE2T 在基因組完整性和癌變中的重要作用，本研究采用 shRNA 沉默 A549 細胞的 UBE2T 基因表達，以觀察下調 UBE2T 表達對 A549 細胞生物學特性的影響。為了防止脫靶效應，本實驗設計了三對 shRNA 序列干擾 UBE2T 表達，轉染后通過 RT-PCR 檢測證實三對 shRNA 干擾序列均能特異、高效地下調了 UBE2T 的表達，并在后續實驗中選擇其中干擾效果最好的 UBE2T-shRNA3 進行相關功能實驗。
腫瘤的發生是涉及多因素、多基因協作的復雜過程，細胞增殖和凋亡異常使腫瘤細胞能無限增殖，同時也為其浸潤和轉移提供了數量基礎[10]。既往研究表明，UBE2T 促進小鼠成纖維細胞系 NIH3T3 細胞的克隆集落形成[11]；體外抑制內源性 UBE2T 能顯著抑制乳腺癌細胞株的增殖[9]。這與本研究中結果相一致，UBE2T 明顯抑制了 A549 細胞的集落形成和增殖能力。本研究中，沉默 UBE2T 表達后，通過流式細胞術檢測細胞凋亡情況，結果提示沉默 UBE2T 表達顯著了 A549 細胞的凋亡。Caspase、Bax、Bcl-2 是重要的凋亡相關蛋白，其中 Bax 為促凋亡蛋白，而 Bcl-2 為抗凋亡蛋白，Bax/Bcl-2 比值決定了細胞凋亡的發生；Caspase 家族同樣在介導細胞凋亡方面也具有重要作用，Caspase-3 被認為是細胞凋亡的酶標物。本研究通過 Western blot 檢測到在沉默 UBE2T 表達后，Cleaved caspase-3 水平和 Bax/Bcl-2 比值顯著升高，認為在 A549 細胞中抑制 UBE2T 表達干擾了細胞凋亡通路。
向正常組織浸潤和侵襲是惡性腫瘤細胞的基本生物學特征，該過程包括腫瘤細胞的脫落、粘附、降解、移動等。隨著腫瘤微環境的惡化，腫瘤細胞首先脫離原發部位，侵入到細胞外基質、基底膜和細胞間質中[12-13]。與此同時，細胞內特定蛋白酶合成系統異常激活，并促進細胞外基質與基底膜的降解，形成局部溶解區域，使得腫瘤細胞易于侵入血管，并穿過血管壁外滲形成繼發性轉移灶。本研究通過 Transwell 實驗和劃痕實驗發現，低表達 UBE2T 的 A549 細胞表現出的侵襲性和遷移能力明顯弱于對照組或 shRNA-NC 組。這些結果提示 UBE2T 通過調控 A549 細胞多種生理過程，在其侵襲和遷移過程中發揮促癌基因作用。
在 UBE2T 發揮促癌作用機制的研究中，研究者發現 UBE2T 直接與 BRCA1/BARD1 相互作用，導致其蛋白酶體降解，促進乳腺癌細胞增殖[9]；Wen 等[14]發現 UBE2T 過表達可充分誘導前列腺癌細胞上皮間質轉化，并與波形蛋白協同促進腫瘤生長和轉移。鑒于 UBE2T 是一種 E2 泛素結合酶，具有多種生物學功能，且其結合底物為非特異性底物，我們推測 UBE2T 在不同類型的腫瘤中具有環境依賴的作用，通過不同的底物和信號通路發揮作用，促進 NSCLC 的發生和發展。研究表明 PI3K/AKT 信號通路與包括 NSCLC 在內的多種惡性腫瘤增殖、凋亡、侵襲級轉移等生物學行為具有密切關系[15-16]。在本研究中，沉默 UBE2T 表達明顯降低了 p-PI3K、p-AKT 的表達水平，PI3K 和 AKT 磷酸化是 PI3K/Akt 信號通路活化的標志之一，這些數據這表明 UBE2T 可能通過激活 PI3K/AKT 信號通路促進 NSCLC 的增殖、侵襲等生物學行為。考慮到 UBE2T 通過這一重要通路調控增殖、凋亡、侵襲和轉移，結合目前臨床試驗中泛素化抑制劑已顯示積極結果[17]，我們認為 UBE2T 可能是 NSCLC 的潛在治療靶點。另外，進一步研究在 NSCLC 中直接與 UBE2T 結合并激活 PI3K/AKT 通路的蛋白，將有助于進一步闡明 UBE2T 發揮促癌基因的作用機制。
綜上所述，體外沉默 UBE2T 表達促進 A549 細胞的凋亡，并抑制其增殖、侵襲和遷移能力，推測 UBE2T 基因作為促癌基因在 NSCLC 的惡性生物學行為中具有重要作用，是 NSCLC 的潛在治療靶點。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占約 85%，早期 NSCLC 隱匿性高，多數患者確診時已為中晚期[1-2]，由于缺乏有效的治療手段，患者一般預后較差。尋找與 NSCLC 發生、發展相關的靶分子，對指導針對 NSCLC 的分子靶向藥物研究具有重要意義。泛素結合酶 E2T（UBE2T）是泛素蛋白酶降解系統成員之一，參與調控細胞周期和信號傳導等細胞過程[3]。UBE2T 基因能夠抑制結直腸癌細胞的凋亡，UBE2T 基因表達可促進鼻咽癌細胞增殖、侵襲及轉移[4]。另有研究利用 GEO 數據集分析發現 UBE2T 在肺癌組織中高表達，且與肺癌的多個臨床病理特征有關[5]。但目前 UBE2T 基因在 NSCLC 發生、發展中的具體作用仍不清楚。本研究通過使用短發夾 RNA（shRNA）沉默 UBE2T 基因表達，并觀察其對肺腺癌來源的 A549 細胞增殖、凋亡、侵襲以及遷移等生物學特性的影響，旨在了解 UBE2T 基因在 NSCLC 發生、發展中的作用機制，以期為 NSCLC 的治療尋找新思路。
1 材料與方法
1.1 主要試劑
A549 細胞株（上海匠萊生物科技有限公司），shRNA-UBE2T 及 shRNA-NC 真核質粒載體（上海吉瑪制藥技術有限公司），蛋白印跡（Western blot）檢測用一抗及辣根過氧化物酶標記的 IgG 二抗（美國 CST 公司），DMEM 培養基、胎牛血清（廣州威佳科技有限公司），Opti-MEM 無血清培養基、SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司），Matrigel 基質膠（美國 BD 公司），脂質體轉染試劑 Lipofectamine 2000（美國 Invitrogen 公司），Annexin V/PI 凋亡檢測試劑盒（美國 BD 公司），Transwell 小室（美國 Corning 公司），RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒（上海康朗生物科技有限公司），500 RT-PCR 系統（美國 Applied Biosystems），熒光顯微鏡（日本 OLYMPUS）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養與轉染
取 A549 細胞接種于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基中，置于 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養，待細胞生長匯合率達 85% 以上傳代培養。取生長良好的 A549 細胞用于轉染和后續試驗。采用脂質體轉染試劑分別將 UBE2T-shRNA1、UBE2T-shRNA1 和 UBE2T-shRNA3、shRNA-NC 質粒載體和空載體轉染 A549 細胞，分別記為 UBE2T-shRNA1 組、UBE2T-shRNA2 組、UBE2T-shRNA3 組、shRNA-NC 組和對照組。其中，UBE2T-shRNA1、UBE2T-shRNA1 和 UBE2T-shRNA3 為靶基因特異性干擾序列，shRNA-NC 組為陰性對照序列，均嚴格按照脂質體轉染操作步驟進行。轉染 6 h 后更換正常培養液，48 h 后收集各組細胞，采用逆轉錄–聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測 UBE2T 的低表達效率。
1.2.2 RT-PCR 檢測 UBE2T mRNA 表達
收集轉染 48 h 后各組細胞，使用 Trizol 試劑提取總 RNA，測定 RNA 濃度和純度后，用反轉錄試劑盒合成 cDNA，用 PCR 儀進行擴增，按照試劑盒操作方法檢測各組細胞 mRNA 表達水平，采用 2－ΔΔCt法計算 mRNA 相對表達量。
1.2.3 克隆形成實驗檢測細胞增殖能力
待轉染后各組 A549 細胞培養至對數生長期，消化后離心、磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，以含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基配成單細胞懸液后以 100 個/孔細胞密度接種于 6 孔板中，放入溫度為 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養，每 2 天更換新鮮培養基，于培養 2 周后培養板中出現肉眼可見克隆時，終止培養。棄去培養基并用 PBS 沖洗 2 次，然后分別經 4% 中性甲醇固定 10 min，0.1% 結晶紫染色 15 min 后拍照并在顯微鏡下計數大于 50 個細胞的克隆數，計算克隆形成率。克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。
1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡
常規消化穩定轉染 UBE2T-shRNA3、shRNA-NC 和空載體的 A549 細胞，接種后培養 48 h，消化后離心、PBS 沖洗，收集（1～5）×105個細胞，100 μL Annexin V 結合緩沖液重懸細胞并加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI，輕輕混勻；室溫避光孵育 15 min 并加入 400 μL 結合緩沖液，使用流式細胞儀檢測各組 A549 細胞凋亡情況。
1.2.5 Transwell 實驗檢測細胞侵襲
Matrigel 基質膠以無血清培養基稀釋（1∶6）后，取 100 μL 至 Transwell 小室上室，37 ℃ 孵育至基質膠為固態。待穩定轉染 UBE2T-shRNA3、shRNA-NC 以及空載體的 A549 細胞培養至對數生長期，常規消化細胞，無血清培養基調節細胞密度為 1×105個/mL。取 200 μL 細胞懸液加入上室，下室加入 500 μL 含 10% 胎牛血清的培養基。培養 48 h 后用無菌棉簽擦去小室內細胞，用結晶紫對侵襲至小室下層的細胞進行染色，每孔隨機選取 5 個視野進行計數統計，每組設置 3 個復孔。
1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移
待轉染后各組 A549 細胞培養至對數生長期，消化后離心、PBS 沖洗，以含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基配成單細胞懸液后接種于 24 孔板，2×105個/孔，待細胞生長至鋪滿培養孔后使用 2 mL 槍頭于培養孔中劃一平直線，使用 PBS 清洗，顯微鏡觀察劃痕區域寬度并拍照。將培養基更換為含 2% 胎牛血清的培養基饑餓培養 24 h，再次使用顯微鏡觀察劃痕區域寬度變化并拍照，Image J 軟件測量劃痕區域寬度，并計算各組細胞劃痕愈合率。
1.2.7 Western blot 檢測蛋白表達
收集轉染后對數期生長各組細胞，PBS 沖洗后使用細胞裂解液冰上充分裂解提取總蛋白。BCA 法定量蛋白樣品后，加入適量上樣緩沖液，取 40 μg 蛋白經 SDS-PAGE 電泳轉印至 PVDF 膜，5% 脫脂牛奶室溫封閉 2 h，加入 Ki67、PCNA、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-3 剪切體（Cleaved caspase-3）、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT 及 GAPDH 一抗 4 ℃ 孵育過夜，TBST 洗膜 3 次；最后加二抗室溫下孵育 2 h，ECL 法顯色。采用 Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計算各蛋白相對表達水平。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 軟件統計分析數據，Graphpad Prism 5 作圖。呈正態分布的計量數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較使用 SNK 法。所有檢驗均采取雙側檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 轉染 shRNA-UBE2T 對 UBE2T 轉錄水平的影響
RT-PCR 結果（圖 1）顯示，與對照組和 shRNA-NC 組比較，UBE2T-shRNA1、UBE2T-shRNA2 和 UBE2T-shRNA3 組 UBE2T mRNA 水平顯著下降（均 P<0.05）；與 UBE2T-shRNA1 和 UBE2T-shRNA2 組比較，UBE2T-shRNA3 組 UBE2T mRNA 水平顯著下降（均 P<0.05）。選擇干擾效果最好的 UBE2T-shRNA3 進行后續功能實驗。
圖1
轉染 shRNA-UBE2T 對 UBE2T 轉錄水平的影響
與對照組比較，*
2.2 沉默 UBE2T 對 A549 細胞增殖能力的影響
克隆形成實驗結果顯示，與對照組和 shRNA-NC 組比較，UBE2T-shRNA3 組克隆形成率顯著降低（均 P<0.05）。Western blot 檢測結果表明，UBE2T-shRNA3 組 Ki67、PCNA 蛋白表達相比對照組和 shRNA-NC 組顯著下調（均 P<0.05）；對照組和 shRNA-NC 組克隆形成率及 Ki67、PCNA 蛋白表達比較，差異無統計學意義（均 P>0.05）。結果見圖 2。
圖2
沉默 UBE2T 對 A549 細胞增殖的影響
a、b. 克隆形成實驗檢測 A549 細胞增殖；c、d、e. Western blot 檢測細胞增殖相關蛋白 Ki67、PCNA 表達。與對照組比較，*
2.3 沉默 UBE2T 對 A549 細胞凋亡的影響
流式細胞術檢測結果顯示，與對照組和 shRNA-NC 組比較，UBE2T-shRNA3 組 A549 細胞凋亡率顯著增加（均 P<0.05），對照組和 shRNA-NC 組細胞凋亡率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。Western blot 檢測細胞凋亡標志物 Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3/Caspase-3 比值在 UBE2T-shRNA3 組顯著增加（P<0.05）。結果見圖 3。
圖3
沉默 UBE2T 對 A549 細胞凋亡的影響
a、b. 流式細胞術檢測細胞凋亡；c、d、e. Western blot 檢測細胞增殖相關蛋白 Bax、Bcl-2、Caspase-3 及 Cleaved caspase-3 表達。與對照組比較，*
2.4 沉默 UBE2T 對 A549 細胞侵襲的影響
Transwell 實驗結果顯示，與對照組和 shRNA-NC 組比較，UBE2T-shRNA 組細胞侵襲數明顯減少（均 P<0.05），對照組和 shRNA-NC 組細胞侵襲數比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖 4。
圖4
沉默 UBE2T 對 A549 細胞侵襲的影響
a. Transwell 實驗檢測 A549 細胞侵襲能力；b. 各組 A549 細胞侵襲數。與對照組比較，*
2.5 沉默 UBE2T 對 A549 細胞遷移的影響
劃痕實驗結果顯示，與對照組和 shRNA-NC 組比較，UBE2T-shRNA 組劃痕愈合率明顯降低（均P<0.05），對照組和 shRNA-NC 組劃痕愈合率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖 5。
圖5
沉默 UBE2T 對 A549 細胞遷移的影響
a. 劃痕法檢測各組 A549 細胞遷移；b. 各組 A549 細胞劃痕愈合率。與對照組比較，*
2.6 沉默 UBE2T 對 A549 細胞 PI3K/AKT 信號通路的影響
Western blot 檢測結果顯示，與對照組和 shRNA-NC 組比較，UBE2T-shRNA 組 p-PI3K/PI3K、 p-AKT/AKT 比值顯著降低（均 P<0.05），對照組和 shRNA-NC 組 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 比值比較，差異無統計學意義（均 P>0.05）。結果見圖 6。
圖6
沉默 UBE2T 對 A549 細胞 PI3K/AKT 信號通路的影響
a. Western blot 檢測 PI3K/AKT 信號通路相關蛋白表達；b、c. 各組 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 比值。與對照組比較，*
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UBE2T 位于 1q32.1 中，屬于泛素蛋白酶降解系統成員之一。生理條件下，泛素結合酶 UBE2T 通過與特定的 E3 泛素連接酶結合而降解特定底物或對底物進行功能性修飾參與調節細胞周期和信號傳導等多種細胞過程。多項研究證實 UBE2T 在腫瘤組織中異常表達，并被認為在腫瘤發生、發展中發揮作用[6-7]。最近研究表明，UBE2T 表達中斷可通過干擾 DNA 損傷–修復反應，直接導致 Fanconi 貧血以及腫瘤細胞對 DNA 交聯損傷試劑的敏感性升高[8]。此外，UBE2T 的過表達被認為會促進乳腺癌的發生[9]。考慮到 UBE2T 在基因組完整性和癌變中的重要作用，本研究采用 shRNA 沉默 A549 細胞的 UBE2T 基因表達，以觀察下調 UBE2T 表達對 A549 細胞生物學特性的影響。為了防止脫靶效應，本實驗設計了三對 shRNA 序列干擾 UBE2T 表達，轉染后通過 RT-PCR 檢測證實三對 shRNA 干擾序列均能特異、高效地下調了 UBE2T 的表達，并在后續實驗中選擇其中干擾效果最好的 UBE2T-shRNA3 進行相關功能實驗。
腫瘤的發生是涉及多因素、多基因協作的復雜過程，細胞增殖和凋亡異常使腫瘤細胞能無限增殖，同時也為其浸潤和轉移提供了數量基礎[10]。既往研究表明，UBE2T 促進小鼠成纖維細胞系 NIH3T3 細胞的克隆集落形成[11]；體外抑制內源性 UBE2T 能顯著抑制乳腺癌細胞株的增殖[9]。這與本研究中結果相一致，UBE2T 明顯抑制了 A549 細胞的集落形成和增殖能力。本研究中，沉默 UBE2T 表達后，通過流式細胞術檢測細胞凋亡情況，結果提示沉默 UBE2T 表達顯著了 A549 細胞的凋亡。Caspase、Bax、Bcl-2 是重要的凋亡相關蛋白，其中 Bax 為促凋亡蛋白，而 Bcl-2 為抗凋亡蛋白，Bax/Bcl-2 比值決定了細胞凋亡的發生；Caspase 家族同樣在介導細胞凋亡方面也具有重要作用，Caspase-3 被認為是細胞凋亡的酶標物。本研究通過 Western blot 檢測到在沉默 UBE2T 表達后，Cleaved caspase-3 水平和 Bax/Bcl-2 比值顯著升高，認為在 A549 細胞中抑制 UBE2T 表達干擾了細胞凋亡通路。
向正常組織浸潤和侵襲是惡性腫瘤細胞的基本生物學特征，該過程包括腫瘤細胞的脫落、粘附、降解、移動等。隨著腫瘤微環境的惡化，腫瘤細胞首先脫離原發部位，侵入到細胞外基質、基底膜和細胞間質中[12-13]。與此同時，細胞內特定蛋白酶合成系統異常激活，并促進細胞外基質與基底膜的降解，形成局部溶解區域，使得腫瘤細胞易于侵入血管，并穿過血管壁外滲形成繼發性轉移灶。本研究通過 Transwell 實驗和劃痕實驗發現，低表達 UBE2T 的 A549 細胞表現出的侵襲性和遷移能力明顯弱于對照組或 shRNA-NC 組。這些結果提示 UBE2T 通過調控 A549 細胞多種生理過程，在其侵襲和遷移過程中發揮促癌基因作用。
在 UBE2T 發揮促癌作用機制的研究中，研究者發現 UBE2T 直接與 BRCA1/BARD1 相互作用，導致其蛋白酶體降解，促進乳腺癌細胞增殖[9]；Wen 等[14]發現 UBE2T 過表達可充分誘導前列腺癌細胞上皮間質轉化，并與波形蛋白協同促進腫瘤生長和轉移。鑒于 UBE2T 是一種 E2 泛素結合酶，具有多種生物學功能，且其結合底物為非特異性底物，我們推測 UBE2T 在不同類型的腫瘤中具有環境依賴的作用，通過不同的底物和信號通路發揮作用，促進 NSCLC 的發生和發展。研究表明 PI3K/AKT 信號通路與包括 NSCLC 在內的多種惡性腫瘤增殖、凋亡、侵襲級轉移等生物學行為具有密切關系[15-16]。在本研究中，沉默 UBE2T 表達明顯降低了 p-PI3K、p-AKT 的表達水平，PI3K 和 AKT 磷酸化是 PI3K/Akt 信號通路活化的標志之一，這些數據這表明 UBE2T 可能通過激活 PI3K/AKT 信號通路促進 NSCLC 的增殖、侵襲等生物學行為。考慮到 UBE2T 通過這一重要通路調控增殖、凋亡、侵襲和轉移，結合目前臨床試驗中泛素化抑制劑已顯示積極結果[17]，我們認為 UBE2T 可能是 NSCLC 的潛在治療靶點。另外，進一步研究在 NSCLC 中直接與 UBE2T 結合并激活 PI3K/AKT 通路的蛋白，將有助于進一步闡明 UBE2T 發揮促癌基因的作用機制。
綜上所述，體外沉默 UBE2T 表達促進 A549 細胞的凋亡，并抑制其增殖、侵襲和遷移能力，推測 UBE2T 基因作為促癌基因在 NSCLC 的惡性生物學行為中具有重要作用，是 NSCLC 的潛在治療靶點。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
