引用本文： 熊維希, 吳夢倩, 張樂, 遲瀟灑, 李勁梅, 周東. 非典型海馬硬化中自噬流異常阻滯的初步研究. 癲癇雜志, 2017, 3(5): 380-384. doi: 10.7507/2096-0247.20170058 復制
局灶性癲癇占所有成人癲癇的2/3[1]，而其中海馬硬化(Hippocampal sclerosis，HS)是成人耐藥性顳葉癲癇(Temporal lobe epilepsy，TLE)患者最常見的病理類型，然而其病因尚不明確。在切除性手術后兩年的隨訪中，60%~80%的患者可以達到無癲癇發作。更長期的隨訪顯示出術后病理同為HS的患者亦會出現不同的預后，提示TLE病因的異質性。而不同的因素，例如病程、起病年齡、癲癇頻率、是否存在復雜或持續性的熱性驚厥，也會對HS程度產生影響[2]。2013年國際抗癲癇聯盟(ILAE)HS新分類，根據病理學神經元丟失及膠質增生模式，又將HS分為典型HS(1型)及非典型HS(2型及3型)。典型及非典型HS患者臨床表現、及手術后癲癇控制率均有不同，特別是越來越多的研究提示，非典型HS患者術后無癲癇發作率相較于典型HS患者更低，提示可能存在不同的病理生理學基礎[3, 4]。自噬(autophagy)來源于希臘語，直譯為自體吞噬。自噬是細胞在自噬相關基因(Autophagyrelatedgene，Atg)的調控下利用溶酶體對自身“異常結構”(例如:衰老的線粒體、內質網及異常蛋白質)的消化降解，是重要的生理過程，可為細胞代謝循環、細胞器更新提供原料和能量，也是細胞適應內外環境所需的一種基本調節方式。自噬在細胞衰老、凋亡中起到了積極作用[5]。
本課題組前期研究發現HS患者海馬中存在自噬小體和線粒體自噬的異常激活。損傷線粒體的異常聚集，特別是在海馬部位，可能參與到了線粒體自噬過程，從而參與了致癇(epileptogenesis)過程[6]。然而不同亞型HS不僅預后有差異，其病因、病理生理也存在差異。不同HS亞型患者的病理生理過程中是否存在自噬流異常阻滯，目前尚罕見報道，本研究擬初步比較典型及非典型HS患者自噬流情況，探討非典型HS患者的可能發生及耐藥機制。
1 資料與方法
1.1 研究對象
24例自2015年3月-2015年12月于華西醫院就診的耐藥性TLE患者，并于神經外科手術切除海馬及顳葉癲癇灶。耐藥性癲癇根據2010國際抗癲癇聯盟指南診斷[7]。每例患者均在術前完善全套檢查包括頭顱核磁共振、腦電圖、正電子發射計算機斷層顯像(PET-CT)，以評估可能的致癇灶。術后病理組織學由經驗豐富的神經病理科醫生完成。分為10例典型HS組(HS1型)，7例非典型HS組(HS2型6例+HS3型1例)，其余7例患者分型不確定，或不存在HS，未納入分組。本研究經四川大學華西醫院倫理委員會審查批準。
1.2 研究方法
1.2.1 免疫組化染色
試劑：LC3B兔抗人多克隆抗體(ab48394，Abcam，Britain)，Beclin-1兔抗人多克隆抗體(ab62557，Abcam，Britain)。DAB顯色劑購自福州邁新公司。方法:取4μm的石蠟切片，采用免疫組織化學(Elivision二步法)，嚴格按試劑盒說明進行各步驟。脫蠟，水化組織切片，3%H202室溫下孵育10 min，微波枸櫞酸修復，DAB顯色，蘇木素復染，封片。其中LC3B工作效價1 :200，Beclin-1工作效價1 :500。并在光鏡下觀察。
1.2.2 免疫印跡
試劑：LC3B兔抗人多克隆抗體(ab48394，Abcam，Britain)，Beclin-1兔抗人多克隆抗體(ab62557，Abcam，Britain)，P62鼠抗人單克隆抗體(ab56416，Abcam，Britain)。方法:取海馬組織，考馬斯亮藍法進行蛋白定量，常規電泳、轉印和封閉后，分別加LC3B抗體(1 :200) 和Beclin-1抗體(1 :150)4℃孵育過夜，堿性磷酸酶標記二抗(1 :400，Santa Cruse，USA)，室溫孵育2 h，堿性磷酸酶染色5 min，膠片曝光顯影，結果用ImageJ分析，用β-actin作為內參。
1.3 統計學方法
免疫印跡灰度值使用ImageJ(National Institute of Mental Health，Bethesda，Maryland，USA)軟件統計。使用SPSS 20(IBM，Armonk，New York，USA)進行統計學分析。獨立樣本的t檢驗，P值＜0.05被認為具有統計學意義。
2 結果
2.1 自噬相關蛋白富集表達于神經元胞漿
10例典型HS患者手術切除海馬CA1區均可見胞漿明顯染色，提示LC3B及Beclin-1的表達(圖 1a、b)。7例非典型HS組手術切除海馬CA1區的LC3B及Beclin-1表達未見顯示。
圖1
典型海馬硬化患者的海馬CA1區免疫組織化學染色(×200)
Figure1.
Immunohistochemical detection of LC3B(a) and Beclin-1(b) in the hippocampus CA1 area on HS patient (×200)
2.2 非典型HS患者自噬產物LC3B、Beclin-1表達上調
患者組織自噬相關蛋白表達比較，非典型HS患者海馬組織中以β-actin為內參，LC3B與Beclin-1蛋白的表達明顯高于典型組，差異具有統計學意義(P＜0.01)，見圖 2。
圖2
兩組海馬硬化組織自噬相關蛋白免疫印跡表達
左列為典型海馬硬化組，右列為非典型海馬硬化組，最末兩條為內參β-actin及GAPDH，從上往下依次為LC3B、Beclin-1與P62
Figure2. Western blot expression of autophage related protein in hippocampal sclerosis tissue of atypical HS and typical HSTypical HS group(left), atypical HS group(right); Bands from top to bottom are LC3B, Beclin-1, P62, β-actin and GAPDH, respectively.
典型HS組與非典型HS組LC3B與Beclin-1蛋白灰度值有明顯區別，且均有統計學意義(P＜0.01)，非典型HS患者海馬組織自噬下游產物增多(圖 3a、b); 提示相對于典型HS組，非典型組出現了自噬底物的堆積和自噬流不暢。典型HS組與非典型HS組P62蛋白灰度值無明顯區別，且不具統計學意義(P＞0.05)，非典型HS患者海馬組織自噬底物表達較典型HS患者無變化(圖 3c)。用Image J軟件對蛋白印跡條帶進行分析，將LC3B與β-actin條帶相對灰度值之比表示LC3B的相對表達量，將Beclin-1與β-actin條帶相對灰度值之比表示Beclin-1的相對表達量，非典型HS組LC3B(0.90±0.06) 及Beclin-1(1.19±0.11) 表達較典型HS組LC3B(0.75±0.06) 與Beclin-1(0.93±0.08) 表達顯著增加(P＜0.01)，得出非典型HS組較典型HS組LC3B、Beclin-1相對表達量明顯增高，差異具有統計學意義。而將P62與β-actin條帶相對灰度值之比表示P62的相對表達量，非典型HS組P62(0.68±0.24) 表達與典型HS組P62(0.62±0.28) 表達無差異(P＞0.05)，非典型HS組較典型HS組LC3B、Beclin-1相對表達量無明顯變化，差異無統計學意義。同時發現3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)在兩組間存在極顯著差異(P=0.003)，見圖 3d。三次重復獨立試驗后，所得結果均一致。
圖3
兩組海馬硬化組織自噬相關蛋白相對表達量比較
a.典型HS與非典型HS組織LC3B比β-actin相對灰度值比較; b.典型HS與非典型HS組織Beclin-1比β-actin相對灰度值比較; c.典型HS與非典型HS組織P62比β-actin相對灰度值比較; d.典型HS與非典型HS組織GAPDH相對灰度值比較
Figure3. Comparison of the relative expression of autophagy related protein between typical and atypical hippocampal sclerosistissue.a.Relative expression of LC3B between typical and atypical hippocampal sclerosistissue (β-actin as internal reference); b.Relative expression of Beclin-1 between typical and atypical hippocampal sclerosistissue (β-actin as internal reference); c.Relative expression of P62 between typical and atypical hippocampal sclerosistissue (β-actin as internal reference); d.Comparison between GAPDH of typical and atypical hippocampal sclerosistissue
3 討論
自噬是一種細胞生物學過程，廣泛存在于真核細胞中，貫穿正常與異常細胞的生長發育和生理病理過程。微管相關蛋白LC3是公認的自噬標志性蛋白，LC3B定位于前自噬體和自噬體，其表達量與自噬小體的數量有明確正向關系，通過檢測細胞內LC3B含量變化，判斷自噬是被誘導還是被抑制狀態。Beclin-1是自噬的調控基因，也是PI3K復合體的組成部分，與Bcl-2作用而調控自噬與凋亡之間的平衡，其表達強度與自噬活性密切相關。通過檢測Beclin-1的表達水平，可對細胞的自噬活性進行動態監測和判斷[8]。自噬參與多種病理生理過程，也與多種疾病的發生關系密切，是一把雙刃劍[5]。近年來發現多種神經系統疾病都伴隨著自噬的發生，尤其是神經退行性疾病[9]。而在癲癇或其他發作性疾病中，針對自噬，特別是以人體組織為試驗的研究還比較少[10]。既往針對小鼠的研究發現，海人酸或匹羅卡品致癇的邊緣葉癲癇小鼠，自噬將增加，而反復癇性發作的小鼠海馬組織中亦發現LC3B陽性的自噬囊泡[11, 12]。我們課題組前期研究發現HS患者海馬中存在自噬小體和線粒體自噬的異常激活，提示自噬可能參與了HS這一病理生理過程。
本研究進一步根據2013年ILAE HS亞型分類，將HS分為典型和非典型HS。檢測到自噬底物在兩組間無差異，而自噬下游產物在非典型HS中有明顯增加，這一自噬下游產物的增加可能是自噬流中某一步驟不暢產生的，而不是或不僅是自噬產物增加所致。但這一研究結果尚需更大樣本量的病例驗證，或使用電鏡直接觀測自噬小體、構建動物模型模擬體內環境進行動態觀察。
本研究另一有趣的發現是，典型及非典型HS組GAPDH表達量存在極顯著差異，并且在重復試驗后仍然存在。GAPDH最初發現于糖酵解途徑，并被認為是一種管家基因，故而廣泛應用于各種實驗的內參，然而近年來，越來越多的研究提示除了參與糖酵解通路，GAPDH還有很多不同的作用，比如參與自噬、細胞凋亡、腫瘤發生等。GAPDH是如何參與到自噬中，目前所知甚少。其他學者的體外實驗發現，在低糖條件下，AMP依賴的蛋白激酶介導的GAPDH磷酸化進一步激活SIRT1，最終啟動自噬，但其與非典型HS存在何種關系，尚需進一步探索[13]。
我們的研究首次發現非典型HS中存在自噬流異常阻滯現象，并且GAPDH可能參與到其機制中，這為未來治療手術效果不佳的非典型HS患者提供了新的靶點和思路。
局灶性癲癇占所有成人癲癇的2/3[1]，而其中海馬硬化(Hippocampal sclerosis，HS)是成人耐藥性顳葉癲癇(Temporal lobe epilepsy，TLE)患者最常見的病理類型，然而其病因尚不明確。在切除性手術后兩年的隨訪中，60%~80%的患者可以達到無癲癇發作。更長期的隨訪顯示出術后病理同為HS的患者亦會出現不同的預后，提示TLE病因的異質性。而不同的因素，例如病程、起病年齡、癲癇頻率、是否存在復雜或持續性的熱性驚厥，也會對HS程度產生影響[2]。2013年國際抗癲癇聯盟(ILAE)HS新分類，根據病理學神經元丟失及膠質增生模式，又將HS分為典型HS(1型)及非典型HS(2型及3型)。典型及非典型HS患者臨床表現、及手術后癲癇控制率均有不同，特別是越來越多的研究提示，非典型HS患者術后無癲癇發作率相較于典型HS患者更低，提示可能存在不同的病理生理學基礎[3, 4]。自噬(autophagy)來源于希臘語，直譯為自體吞噬。自噬是細胞在自噬相關基因(Autophagyrelatedgene，Atg)的調控下利用溶酶體對自身“異常結構”(例如:衰老的線粒體、內質網及異常蛋白質)的消化降解，是重要的生理過程，可為細胞代謝循環、細胞器更新提供原料和能量，也是細胞適應內外環境所需的一種基本調節方式。自噬在細胞衰老、凋亡中起到了積極作用[5]。
本課題組前期研究發現HS患者海馬中存在自噬小體和線粒體自噬的異常激活。損傷線粒體的異常聚集，特別是在海馬部位，可能參與到了線粒體自噬過程，從而參與了致癇(epileptogenesis)過程[6]。然而不同亞型HS不僅預后有差異，其病因、病理生理也存在差異。不同HS亞型患者的病理生理過程中是否存在自噬流異常阻滯，目前尚罕見報道，本研究擬初步比較典型及非典型HS患者自噬流情況，探討非典型HS患者的可能發生及耐藥機制。
1 資料與方法
1.1 研究對象
24例自2015年3月-2015年12月于華西醫院就診的耐藥性TLE患者，并于神經外科手術切除海馬及顳葉癲癇灶。耐藥性癲癇根據2010國際抗癲癇聯盟指南診斷[7]。每例患者均在術前完善全套檢查包括頭顱核磁共振、腦電圖、正電子發射計算機斷層顯像(PET-CT)，以評估可能的致癇灶。術后病理組織學由經驗豐富的神經病理科醫生完成。分為10例典型HS組(HS1型)，7例非典型HS組(HS2型6例+HS3型1例)，其余7例患者分型不確定，或不存在HS，未納入分組。本研究經四川大學華西醫院倫理委員會審查批準。
1.2 研究方法
1.2.1 免疫組化染色
試劑：LC3B兔抗人多克隆抗體(ab48394，Abcam，Britain)，Beclin-1兔抗人多克隆抗體(ab62557，Abcam，Britain)。DAB顯色劑購自福州邁新公司。方法:取4μm的石蠟切片，采用免疫組織化學(Elivision二步法)，嚴格按試劑盒說明進行各步驟。脫蠟，水化組織切片，3%H202室溫下孵育10 min，微波枸櫞酸修復，DAB顯色，蘇木素復染，封片。其中LC3B工作效價1 :200，Beclin-1工作效價1 :500。并在光鏡下觀察。
1.2.2 免疫印跡
試劑：LC3B兔抗人多克隆抗體(ab48394，Abcam，Britain)，Beclin-1兔抗人多克隆抗體(ab62557，Abcam，Britain)，P62鼠抗人單克隆抗體(ab56416，Abcam，Britain)。方法:取海馬組織，考馬斯亮藍法進行蛋白定量，常規電泳、轉印和封閉后，分別加LC3B抗體(1 :200) 和Beclin-1抗體(1 :150)4℃孵育過夜，堿性磷酸酶標記二抗(1 :400，Santa Cruse，USA)，室溫孵育2 h，堿性磷酸酶染色5 min，膠片曝光顯影，結果用ImageJ分析，用β-actin作為內參。
1.3 統計學方法
免疫印跡灰度值使用ImageJ(National Institute of Mental Health，Bethesda，Maryland，USA)軟件統計。使用SPSS 20(IBM，Armonk，New York，USA)進行統計學分析。獨立樣本的t檢驗，P值＜0.05被認為具有統計學意義。
2 結果
2.1 自噬相關蛋白富集表達于神經元胞漿
10例典型HS患者手術切除海馬CA1區均可見胞漿明顯染色，提示LC3B及Beclin-1的表達(圖 1a、b)。7例非典型HS組手術切除海馬CA1區的LC3B及Beclin-1表達未見顯示。
圖1
典型海馬硬化患者的海馬CA1區免疫組織化學染色(×200)
Figure1.
Immunohistochemical detection of LC3B(a) and Beclin-1(b) in the hippocampus CA1 area on HS patient (×200)
2.2 非典型HS患者自噬產物LC3B、Beclin-1表達上調
患者組織自噬相關蛋白表達比較，非典型HS患者海馬組織中以β-actin為內參，LC3B與Beclin-1蛋白的表達明顯高于典型組，差異具有統計學意義(P＜0.01)，見圖 2。
圖2
兩組海馬硬化組織自噬相關蛋白免疫印跡表達
左列為典型海馬硬化組，右列為非典型海馬硬化組，最末兩條為內參β-actin及GAPDH，從上往下依次為LC3B、Beclin-1與P62
Figure2. Western blot expression of autophage related protein in hippocampal sclerosis tissue of atypical HS and typical HSTypical HS group(left), atypical HS group(right); Bands from top to bottom are LC3B, Beclin-1, P62, β-actin and GAPDH, respectively.
典型HS組與非典型HS組LC3B與Beclin-1蛋白灰度值有明顯區別，且均有統計學意義(P＜0.01)，非典型HS患者海馬組織自噬下游產物增多(圖 3a、b); 提示相對于典型HS組，非典型組出現了自噬底物的堆積和自噬流不暢。典型HS組與非典型HS組P62蛋白灰度值無明顯區別，且不具統計學意義(P＞0.05)，非典型HS患者海馬組織自噬底物表達較典型HS患者無變化(圖 3c)。用Image J軟件對蛋白印跡條帶進行分析，將LC3B與β-actin條帶相對灰度值之比表示LC3B的相對表達量，將Beclin-1與β-actin條帶相對灰度值之比表示Beclin-1的相對表達量，非典型HS組LC3B(0.90±0.06) 及Beclin-1(1.19±0.11) 表達較典型HS組LC3B(0.75±0.06) 與Beclin-1(0.93±0.08) 表達顯著增加(P＜0.01)，得出非典型HS組較典型HS組LC3B、Beclin-1相對表達量明顯增高，差異具有統計學意義。而將P62與β-actin條帶相對灰度值之比表示P62的相對表達量，非典型HS組P62(0.68±0.24) 表達與典型HS組P62(0.62±0.28) 表達無差異(P＞0.05)，非典型HS組較典型HS組LC3B、Beclin-1相對表達量無明顯變化，差異無統計學意義。同時發現3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)在兩組間存在極顯著差異(P=0.003)，見圖 3d。三次重復獨立試驗后，所得結果均一致。
圖3
兩組海馬硬化組織自噬相關蛋白相對表達量比較
a.典型HS與非典型HS組織LC3B比β-actin相對灰度值比較; b.典型HS與非典型HS組織Beclin-1比β-actin相對灰度值比較; c.典型HS與非典型HS組織P62比β-actin相對灰度值比較; d.典型HS與非典型HS組織GAPDH相對灰度值比較
Figure3. Comparison of the relative expression of autophagy related protein between typical and atypical hippocampal sclerosistissue.a.Relative expression of LC3B between typical and atypical hippocampal sclerosistissue (β-actin as internal reference); b.Relative expression of Beclin-1 between typical and atypical hippocampal sclerosistissue (β-actin as internal reference); c.Relative expression of P62 between typical and atypical hippocampal sclerosistissue (β-actin as internal reference); d.Comparison between GAPDH of typical and atypical hippocampal sclerosistissue
3 討論
自噬是一種細胞生物學過程，廣泛存在于真核細胞中，貫穿正常與異常細胞的生長發育和生理病理過程。微管相關蛋白LC3是公認的自噬標志性蛋白，LC3B定位于前自噬體和自噬體，其表達量與自噬小體的數量有明確正向關系，通過檢測細胞內LC3B含量變化，判斷自噬是被誘導還是被抑制狀態。Beclin-1是自噬的調控基因，也是PI3K復合體的組成部分，與Bcl-2作用而調控自噬與凋亡之間的平衡，其表達強度與自噬活性密切相關。通過檢測Beclin-1的表達水平，可對細胞的自噬活性進行動態監測和判斷[8]。自噬參與多種病理生理過程，也與多種疾病的發生關系密切，是一把雙刃劍[5]。近年來發現多種神經系統疾病都伴隨著自噬的發生，尤其是神經退行性疾病[9]。而在癲癇或其他發作性疾病中，針對自噬，特別是以人體組織為試驗的研究還比較少[10]。既往針對小鼠的研究發現，海人酸或匹羅卡品致癇的邊緣葉癲癇小鼠，自噬將增加，而反復癇性發作的小鼠海馬組織中亦發現LC3B陽性的自噬囊泡[11, 12]。我們課題組前期研究發現HS患者海馬中存在自噬小體和線粒體自噬的異常激活，提示自噬可能參與了HS這一病理生理過程。
本研究進一步根據2013年ILAE HS亞型分類，將HS分為典型和非典型HS。檢測到自噬底物在兩組間無差異，而自噬下游產物在非典型HS中有明顯增加，這一自噬下游產物的增加可能是自噬流中某一步驟不暢產生的，而不是或不僅是自噬產物增加所致。但這一研究結果尚需更大樣本量的病例驗證，或使用電鏡直接觀測自噬小體、構建動物模型模擬體內環境進行動態觀察。
本研究另一有趣的發現是，典型及非典型HS組GAPDH表達量存在極顯著差異，并且在重復試驗后仍然存在。GAPDH最初發現于糖酵解途徑，并被認為是一種管家基因，故而廣泛應用于各種實驗的內參，然而近年來，越來越多的研究提示除了參與糖酵解通路，GAPDH還有很多不同的作用，比如參與自噬、細胞凋亡、腫瘤發生等。GAPDH是如何參與到自噬中，目前所知甚少。其他學者的體外實驗發現，在低糖條件下，AMP依賴的蛋白激酶介導的GAPDH磷酸化進一步激活SIRT1，最終啟動自噬，但其與非典型HS存在何種關系，尚需進一步探索[13]。
我們的研究首次發現非典型HS中存在自噬流異常阻滯現象，并且GAPDH可能參與到其機制中，這為未來治療手術效果不佳的非典型HS患者提供了新的靶點和思路。
