超極化激活環核苷酸門控通道（Hyperpolarizationactivated cyclic nucleotide gatedchannel，HCN）屬于電壓門控型離子通道，迄今為止發現有四個亞型：HCN1～HCN4。HCN 通道的激活依賴于膜的超級化，在膜電位低于靜息電位時，HCN 通道被激活，產生局部緊張性電流，導致持續的鈉內流，使細胞膜發生去極化。該通道分布在人體的分布并不一致，主要在神經系統和心臟中表達。目前研究表明，HCN 通道既參與所在組織的正常生理功能，如睡眠和覺醒、學習和記憶、視覺和疼痛感知、神經元起搏、樹突整合等，也與多種中樞神經系統疾病及所在組織的病理狀態密切相關，如神經病理性疼痛、學習記憶障礙、藥物成癮和顳葉癲癇，特別是在伴海馬硬化性內側顳葉癲癇中。癲癇作為神經系統最常見的神經疾病之一，癲癇因其病因錯綜復雜，病理改變亦多樣性，至今尚未能完全了解其全部發病機制。目前有大量的文獻報道 HCN 與癲癇，特別是顳葉癲癇的發生發展有密切關系。因此本文就 HCN 通道的結構特征、分布、功能、調控及其在顳葉癲癇發生過程中的新研究進展進行綜述。
引用本文： 黎銀潮, 秦家明, 林婉蓉, 陳傲寒, 趙怡然, 周列民. 超極化激活環核苷酸門控通道在顳葉癲癇的研究新進展. 癲癇雜志, 2020, 6(1): 19-25. doi: 10.7507/2096-0247.20200005 復制
癲癇是一種由多種病因引起的慢性腦部疾病，以腦神經元過度放電導致反復性、發作性和短暫性的中樞神經系統功能失常為特征。任何年齡均會發病，全世界約 7 000 萬患者，其反復發作不僅影響患者的身體健康，還對患者及其家人的生活、心理及經濟等方面造成負擔[1, 2]。其中伴海馬硬化性內側顳葉癲癇（Mesial temporal lobe epilepsy with hippocampus sclrosis，MTLE-HS）是最常見的癲癇綜合征之一，但其發病機制仍不清楚，是獲得性癲癇常見類型，與熱性驚厥（Febrile seizure，FS）密切相關，作為獲得性癲癇，其主要發病機制包括表觀遺傳調控和遺傳易感性[3]。MTLE-HS 發病機制非常復雜，中樞神經系統興奮與抑制間的不平衡導致癲癇發作，其主要與離子通道神經遞質及神經膠質細胞的改變有關[4]。離子通道是體內可興奮性組織興奮性調節的基礎，其編碼基因多態性位點的改變可影響離子通道功能，從而增加癲癇的遺傳易感性。在 MTLE-HS 中，主要研究的離子通道包括鉀離子、鈣離子和鈉離子通道[5]。但近年超極化激活環核苷酸門控通道（Hyperpolarizationactivated cyclic nucleotide gatedchannel，HCN）逐漸成為研究的熱點，研究發現 HCN 與癲癇，特別是顳葉癲癇（TLE）的發生發展有密切關系[6, 7]。現對相關研究進展作一綜述，以助于臨床上加強對相關疾病的認識。
1 超極化激活環核苷酸門控通道的結構特征
HCN 通道屬于電壓門控型離子通道，目前為止，發現四個亞型：HCN1～HCN4，由 HCN1～HCN4 基因編碼[8]。每個亞型有 6 個跨膜區（S1-S6），S4 為電壓感受器，在 S5 和 S6 之間有攜帶 GYG 膜體的孔區，功能是選擇性的離子過濾器[9]。S6 之后有一個 80 次重復的 C-Linker 圍繞六個跨膜區，其后是環核苷酸結合區 CNBD（the Cyclic nucleotide binding domain，CNBD）。CNBD 包含 3 個 α 亞基（A-C）和一個位于 A、B 亞基之間的 β 球體。C-linker 和 CNBD 稱為 cAMP 敏感區（cAMP-sensing domain，CSD）[10]。HCN 通道能夠傳導內向 Na+、K+電流（Ih），在結構上類似于電壓門控鉀離子通道，但缺乏對鉀離子的高選擇性，而且在生理條件下主要是傳導鈉離子。研究認為由于 HCN 的孔區僅存在兩個過濾點，這與 Kv 通道的四個過濾點不同；此外，在 HCN 通道中，具有過濾作用的酪氨酸重定位。當 HCN 通道與鉀離子結合時，鈉離子滲透到孔中而不與通道結合，因此，Ih 是一種內向的去極化電流[11, 12]。HCN 的四種亞型可以組裝成同質通道，也可以在不同的組合中進行功能組裝，形成異質通道[13]。
2 超極化激活環核苷酸門控通道的分布、表達與功能
在中樞神經系統中，HCN 通道分布并不一致，HCN1 和 HCN2 表達最豐富，而 HCN3 和 HCN4 通道在中樞神經系統中表達較少。HCN1 主要在新皮層、海馬、小腦皮層和腦干中表達最多[14]。HCN2 幾乎在整個大腦中均有表達，表達最多為丘腦、外側膝狀體和腦干核團[15]。HCN3 在中樞神經系統中幾乎不表達，HCN4 與 HCN1 表達有關，主要表達在丘腦各個核團、基底節和僵核[16]。在周圍神經系統中，HCN 通道也有表達，如背根神經節和三叉神經節，以 HCN1 表達最豐富[17]。HCN4 在心臟表達豐富，與心律失常有關，也與癲癇患者的猝死相關[18]。HCN 通道亞細胞定位具有神經元特異性，在新皮層和海馬椎體神經元中，主要分布在遠端軸突，調控軸突的興奮和突觸的網絡聯系[19, 20]。海馬、小腦和中腦中間神經元，胞體和軸突均有分布，用于維持膜的穩定性和神經遞質的傳遞[21]。這種不同的表達和分布有助于完成 HCN 的生理功能。
神經系統中，當 HCN 通道被激活后，小部分 HCN 通道在靜息膜電位期迅速開放，產生 Ih，主要作用有：① 減少膜靜止性輸入，抑制膜電位在刺激后發生震蕩，削弱突觸整合，減輕突觸誘發的神經元興奮；② 內向的 Ih 使膜發生去極化，細胞膜更接近興奮閾值。因此，Ih 電流的正常生理功能包括維持靜息膜電位、產生神經元的某些節律活動、調節軸突的整合和突觸傳遞，并且參與人體的多種生理過程，如睡眠和覺醒、學習和記憶、感覺和感知等。HCN 通道類似于節律誘發通道，引起膜節律性點燃，閾值下膜電位的震蕩，改變其他離子的濃度等[22]。
在膜電位為-65 mV 時，一部分 HCN 通道激活，產生局部緊張性電流，導致持續的鈉流入，使細胞膜去極化[23]。當去極化導致通道失活時，由于離子的流動，細胞膜隨之產生超極化效應。因此，通過穩定正負離子的流動，HCN 通道使膜電位穩定在閾下電位。因此，HCN 功能的喪失將會導致膜的超極化和興奮性的降低。然而，同時由于輸入電阻的增加，神經元對突觸刺激的反應也更靈敏。HCN 電流對神經元功能的這種雙重作用已在不同的腦區得到明確，包括丘腦、海馬和小腦等，并對高級的大腦功能有著重要影響，比如學習和記憶、控制晝夜節律節奏、睡眠及覺醒狀態等[24]。在上橄欖核主神經元的軸突起始段，HCN1 介導的電流通過提高閾值來降低放電峰概率[25]。此外，5-羥色胺 7（5-HT7）受體的激活導致 HCN 電流活化曲線發生去極化偏移，加快了神經元的放電速率和體內呼吸節律[26]。
HCN 通道既參與所在組織的正常生理功能，如睡眠和覺醒、學習和記憶、視覺和疼痛感知、神經元起搏、樹突整合等，也與所在組織的病理狀態密切相關[27]。神經損傷引起的神經源性疼痛常檢測到 HCN 表達增加，肥厚性心肌病和終末期心力衰竭等常檢測到心室肌細胞 HCN4 mRNA 及 HCN2 mRNA 表達增加[8]。Cho 等[28]在牙髓炎模型中發現，三叉神經節 HCN1 和 HCN2 的表達顯著增加，并進一步驗證了 HCN1 和 HCN2 主要由三叉神經節神經元中機械敏感神經元的體細胞和感覺根中痛覺神經元的外周軸突共同表達的，并可能在牙髓炎癥性疼痛的機制中發揮重要作用。Luo 等[29]研究發現，慢性大腦低灌注模型中的空間學習和記憶缺陷與海馬 CA1 區的 HCN1 和 HCN2 異常表達有關。HCN1 和 HCN2 表達異常可能與早期的空間學習和記憶損傷有關，而空間學習、記憶的穩定性和晚期損傷可能是由于 HCN2 的表達上調。
3 超極化激活環核苷酸門控通道的調控
3.1 細胞內分子
包括小分子（如 cAMP、PIP2、protons），蛋白激酶（如 Src、p38-MAPK、PKC、cGKII、Ca2+/CaMKII），細胞間蛋白，都能影響到 HCN 通道的功能和表達[30, 31]。cAMP 在維持 HCN 生理功能上起著重要作用，能使 HCN2 和 HCN4 正相偏轉 17 mV。已經構建出 cAMP 對 HCN 抑制的動物模型，未連接 cAMP 的 CSD 區可抑制 S6 活動，并且限制內源性電壓活動。當 cAMP 結合 CNBD 釋放 CSD 時，促進 HCN 通道開放。使 HCN1 和 HCN3 CSD 活性增高。同樣，cGMP 和 cCMP 也能通過類似的方式調節 HCN 通道的相關亞型[32]。cGMP 和 cCMP 可以使 HCN2 和 HCN4 的電壓正相偏轉 6～8 mV，增加酶活性[33]。4,5-二磷酸磷脂酰肌醇（4,5-biphosphate，PIP2）能使 HCN 電壓在新生組織和離體表達組織正向偏轉約 20 mV，同時影響通道活性。PIP2 相結合的部位是孔區和跨膜區。通過膜的酸堿性調控 HCN 通道，調節神經元興奮性。小鼠丘腦內顆粒層（Internal granular layer，IGL）神經元 HCN3 表達非常豐富，PIP2 使 HCN 通道進一步去極化，使 HCN 通道活性增強。上調的 Ih 電流通過 PIP2 在 IGL 神經元引起低閾值點燃和瞬時震蕩。相反，PIP2 缺乏使 IGL 神經元興奮性減弱[34]。由此可見，PIP2 可以通過調節 HCN 門控的開放和活性，影響神經元的興奮性和節律性的點燃。
3.2 蛋白激酶
蛋白激酶在調控配體門控和電壓門控以及維持電壓方面起著非常重要的作用。越來越多的研究證實不同的激酶參與調控 HCN 通道的開放和細胞表面的表達。絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（Tyrosine kinase，Src）在中樞神經系統中廣泛表達，并且參與 HCN 的調節[35]。染料木黃銅是絲氨酸激酶抑制劑，能夠減小蟾蜍卵細胞和新生組織 HCN2 和 HCN4Ih 電流的峰值，伴隨電壓依賴性通道的負性偏轉。Src SH3 能夠直接和 CNBD 相結合，通過直接磷酸化起作用[36]?。
Serine/threonine 激酶同樣對 HCN 通道有調控作用。p38-MAPK 激活海馬椎體神經元，引起 25 mV 的超極化偏轉，使靜息膜電位（Resting membrane potential，RMP）超極化并且出現短時維持和瞬時峰值。同時又引起一個約 11 mV 的去極化電壓。在病理情況下，HCN 通道在海馬 CA1 區椎體神經元的持續性的下調，一部分原因可能是因為改變了 p38-MAPK 的信號通路。體外動物模型中，p38-MAPK 通道活性減低，外源性增加 p38-MAPK 的表達能使癲癇癥狀減輕[37]。在海馬神經元中，磷脂酶 C-蛋白激酶 C 活化，使 HCN1 磷酸化，降低 HCN 電流和 HCN1 的表達[30]。在神經元細胞中，HCN 通道也受到 p38 絲裂原活化蛋白激酶和鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 II 磷酸化的影響[38, 39]。另外，泛素化修飾肽（SUMO）對 HCN 通道的調節也起到重要作用。有研究在小鼠前腦發現了 HCN2 的泛素化，在轉染的 HEK 細胞中，HCN2 的泛素化增強 Ih 電流和 HCN2 的表達，這對于了解 HCN 在中樞神經系統疾病中的表達異常具有重要意義[40]。
3.3 相互作用蛋白
在神經系統中，許多支架蛋白與 HCN 通道 C 端相結合，調控 HCN 通道的開放。酵母雙雜交得出細絲蛋白可以和 HCN1 相結合，使 Ih明顯超極化。細絲蛋白 A 主要是通過 CNBD 下游的 22 個氨基酸序列相結合發揮調控作用，這個區域在 HCN2，HCN3 和 HCN4 并不是保守區域，因此，細絲蛋白 A 是 HCN1 的特異性調控蛋白。此外細絲蛋白 A 促進 HCN1 通道可逆的動力依賴性內化，并通過細胞內室通道的積累促進 HCN1 通道在細胞表面的再分布[41]。在體外培養的海馬神經元中發現，顯性負調節的細絲蛋白 A 能增加 HCN1 的表達，而快速消除兩者的相互作用后增強 Ih 電流[42]。支架蛋白 Tamalin、S-SCAM 和 Mint2 通過不同的蛋白亞基作用于 HCN2 通道。最近研究顯示，腦特異性因子 TRIP8b（TPR-containing Rab8b-interacting protein）在神經系統中影響 HCN 的表達、定位和功能。在哺乳動物大腦中，TRIP8b 是 HCN 通道輔助亞基，與 HCN1 有很強的共定位關系，定位在新皮層和海馬椎體神經元遠端軸突。在體內，TRIP8b N 端至少有 9 個不同的剪切體。這些剪切體在海馬椎體神經元和其他組織中調控 HCN1 的表達。TRIP8b 敲除鼠中，Ih 電流峰值在海馬椎體神經元中明顯減低。TRIP8b（1a-4）和 TRIP8b（1a）是在海馬中表達最為豐富的兩個剪切體 TRIP8b（1a-4）在離體細胞中上調 HCN1，啟動軸突表達 HCN1。TRIP8b（1a）相反，在蟾蜍卵細胞中能下調 HCN1，抑制海馬 CA1 區椎體神經胞體 HCN 通道表達。此外，TRIP8b 基因敲除大鼠還顯示運動學習能力的缺失[43]。總之，內源性 TRIP8b 與通道蛋白相互作用在調控 HCN 通道的生理功能上發揮著巨大作用。這個作用主要和 HCN 通道兩個位點有關：C-linker/CNBD 保守核心區 80 個氨基酸、 C-端 SNL 三堿基重復序列。最近研究證實，HCN1 通道的 C-linker/CNBD 和 TRIP8b 相結合，可以下調 HCN1 表達，而 C-端 SNL 區正好相反。因此，內源性 TRIP8b 通過與上述兩個位點相結合，動態調控 HCN 的表達。另外，TRIP8b 還參與調控 HCN 通道的門控性和開放性。這個作用主要是通過和 HCN1C-linker/CNBD 相結合完成。由于 CNBD 同時也是 cAMP 的結合位點，所以當結合的 cAMP 水平增高時，可干擾 TRIP8b 和 CNBD 的結合，從而抑制 HCN1 通道的上調。所以 TRIP8B 和 cAMP 共同調控 HCN 通道的開放、激活和失活[44]。另外研究發現，TRIP8b 基因敲除小鼠顯著降低了丘腦投射皮層 5b 神經元和丘腦中繼神經元的 HCN 通道表達和功能，但保留了網狀丘腦核抑制神經元的功能[45]。此外 Caveolin、KCR1，Nedd4-2 等輔助蛋白也能夠與 HCN 通道發生相互作用[46-48]。
3.4 細胞外神經遞質
3.4.1 乙酰膽堿
膽堿能神經元主要在腦干和前腦基底區表達最為豐富。在腦干，主要來自于腦橋角核和三叉神經背核。乙酰膽堿（Ach）在神經系統中和多種生理功能調控有關，如睡眠和覺醒，運動調節，增強感受器敏感性，促進快速動眼期（Rapid eye movemet，REM）睡眠[49]。主要是通過膽堿能受體（mAChRs）和阿片受體（nicotinic receptors）起作用。Ach 對 Ih的調控是通過激活不同的 mAChRs 亞型（M1-M5）起作用[50]。Ach 的總體作用是降低 Ih。在脊椎動物中，Ach 調控運動的啟動，引起運動相關神經元興奮性降低，這樣減少運動過程中相關神經元的參與[51]。在嗜鉻細胞中，mAChRs 的激活，導致膜電位持續時間增加。脊髓 α 運動神經元表達 m2AChRs，能夠降低 cAMP 水平，因此，有可能通過 M2 型受體抑制 cAMP 的信號傳導而導致 Ih的下調[8]。
3.4.2 單胺類神經遞質
單胺類神經遞質，如去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、醛固酮、多巴胺等在調節機體的各項活動中起著重要作用，如睡眠和覺醒，高級認知功能，如學習、工作記憶，警惕和做決定等[52]。單胺類神經遞質紊亂可以引起許多神經系統疾病，如帕金森氏病、藥物成癮、精神分裂癥、雙相情感障礙等。在神經系統中，HCN 通道是單胺類神經遞質的靶向位點，參與調控神經元興奮性，突觸傳遞、整合和可塑性。NE 能神經元通過抑制 HCN 使前腦功能性神經網路增強。在前額皮層神經元中，HCN 通道和 a2A-ARs（Alpha2A-adrenoceptors）共同定于軸突[52, 53]。一種觀點認為，HCN 通道的抑制是由于 cAMP 參與；另外一種觀點認為與 PLK-PKC 信號通路有關[54]。在小鼠中腦腹側被蓋區（Ventval tegmental area，VTA）多巴胺神經元中，Ih的調控也是通過激活 a2A-ARs 起作用。a2A-ARs 選擇性的降低 Ih電流幅度，減少 Ih激活頻率，通過受體亞型激活 PLK-PKC 通路。a2A-ARs 使 HCN 通道向超極化方向偏移，多巴胺能神經元更易激活，在病理情況下皮層-邊緣系統調控突觸可塑性上起著重要作用[55]。
3.4.3 谷氨酸
谷氨酸（Glu）是神經系統的初級興奮性神經遞質。離子型和代謝型 Glu 受體通過 Glu 的激活能在海馬軸突表面調控 HCN1 的表達。癲癇大鼠模型中 Glu 釋放增多會影響 HCN 通道的轉錄[8]。Glu 的增加使膜表面 HCN 蛋白表達上調。研究表明，N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptors，NMDA）依賴的長時程增強（Long-term potentiation，LTP）就是通過海馬 CA1 區 HCN 通道 theta 爆發表達上調的結果。這種上調的機制可能是離子型受體通過激活 Ca2+/CaMKII 使鈣離子內流增多導致。代謝型 Glu 受體激活可能使細胞表面 HCN 表達減少[56]。Schaffer 側枝的長時程抑制（Long-term depression，LTD）引起軸突 HCN 通道下調，同時伴隨有超極化電壓的衰減和閾值下反應頻率的減低。Glu 的調控主要是通過 I 型 Glu 受體 mGluRs，激活下游的 PLC-PKC 信號通道。阻斷 I 型 Glu 受體 mGluRs，上述作用明顯減弱。在病理情況下，Glu 能影響 HCN 基因轉錄。在癲癇小鼠模型中，Glu 通過激活 Ca2+/CaMKII 鈣依賴的 AMPA 受體，使鈣離子內流增多，從而減低 HCN mRNA 水平和蛋白水平。Ca2+/CaMKII 能夠增強轉錄因子神經元限制性沉默因子（Neuronal restrictive silencing factor，NRSF）的表達，降低 HCN1 轉錄。在癲癇持續狀態后，NRSF 與 HCN1 結合增強，導致海馬 CA1 區椎體神經元 HCN1 表達減少和 Ih 電流降低[57]。細胞外高濃度的 Glu 引起 HCN 通道不同亞型之間轉錄不平衡，這種不平衡增加神經元興奮性導致癲癇，形成了一個正反饋，稱為“癲癇誘發癲癇”。
4 超極化激活環核苷酸門控通道與顳葉癲癇
許多研究表明，HCN1 和 HCN2 亞型功能缺失突變會引起神經元興奮性增強，甚至可能引起癲癇持續狀態[6, 58]。HCN1 基因缺失小鼠通過紅藻氨酸誘導更容易引起癲癇發作，盡管其靜息膜電位存在超極化，但小鼠的皮質和海馬神經元的突觸興奮性增加[59]。已有研究表明，HCN2 的廣泛缺失將會導致癲癇的發生[60]。在 MTLE 大鼠模型中研究發現，大腦皮質和海馬 HCN1 和 HCN2 表達明顯下調，且這種下調可持續 6 周。在 MTLE 患者大腦皮質和海馬中也同樣發現 HCN1 和 HCN2 mRNA 水平的下調。MTLE-HS 患者多伴有早期觸發因素，如各種原因引起的癲癇持續狀態或腦部創傷、FS 等[61]。Wang 等[62]于 2001 年首次報道在 FS 模型中，海馬 CA1 區神經元胞體和軸突 HCN1 表達下降，而 HCN2 表達增多。在未成年的大鼠中腹側與背側的 CA1 神經元相比，HCN1 與 HCN2 亞基的比例增加，使 HCN 通道在腹側 CA1 神經元的靜息電位中發揮更突出作用，背側 CA1 神經元中 HCN 通道表達減少，增強了神經元興奮性[63, 64]。Nakamura 等[65]在 2 例 FS 家族中發現HCN2 的一個錯義突變，p.S126L。在功能上，該突變導致 HCN 與 cAMP 結合增強，從而增加了神經元興奮性，可能是導致 FS 的原因之一。許多動物模型已經證實，HCN 通道功能的改變和癲癇的起源密切相關，在 HCN1 基因完全敲除小鼠模型中，HCN1 的不表達導致 Ih 電流減弱，在皮層神經元，導致突觸整合和點燃時間延長[66]。同時，海馬 CA1 區椎體神經元軸突興奮性增加，瞬間可達到高峰，幼鼠在出生后不久即死亡[67]。 HCN2 基因敲除大鼠中，存活大鼠易發生癲癇。在 FS 動物模型中，FS 通過調控 HCN1 和 HCN2 的表達，增加神經元的興奮性，從而導致成年期癲癇反復發作[68]。文獻報道在 TLE 動物模型中，HCN 通道在急性期和慢性期均表達下調，推測可能是癲癇持續狀態后引起的代償反應[18]。因此，在不同的癲癇模型和不同時間點，HCN 的表達也會存在差異。HCN4 通道通常在心臟細胞中表達，但最近的研究發現，HCN4 的功能缺失突變也與癲癇密切相關。有報道稱，在患有嬰兒良性肌陣攣性癲癇的兩兄弟中發現HCN4p.Arg550Cys 雜合突變，導致 HCN4 通道功能的喪失，進而引起神經元興奮性增加，增加了癲癇易感性。另外已明確HCN4p.Pro1117Leu 和 p.Gly153Glu 突變也會對通道的功能產生重大影響[69]。Becker 等[70]在 HCN1 基因中鑒定出兩個新的雜合錯義變，并證實新的雜合突變導致早發癲癇性腦病。Marini 等[7]在 HCN1 基因中鑒定出新的雜合錯義突變，其中 Gly391Asp 變異體與最嚴重的新生兒表型相關，對通道功能也有最嚴重的影響，該研究進一步說明 HCN 通道在大腦發育和神經元興奮性控制中發揮著關鍵。大量的臨床前和人類遺傳學研究支持 HCN 通道病與癲癇之間存在關聯。然而并不是所有的研究都表明 HCN 通道的改變與疾病之間存在單一的因果關系。事實上，HCN 通道的上調和下調都與癲癇相關。
5 討論
HCN 通道在覺醒和睡眠，學習和記憶中起著非常重要的作用，其表達異常與 FS 和 MTLE 的發生密切相關。但其改變的機制仍不明確。MTLE 大部分屬于癥狀性癲癇，與表觀遺傳學密切相關。在臨床上，僅有少部分患者在 FS 后形成 MTLE，故也和遺傳易感性關系密切，因此，我們推測 HCN 基因多態性與 MTLE-HS 發生相關。目前 HCN 通道的研究報道仍相對較少，且 HCN 在 MTLE-HS 的致癇機制仍不明確。因此，有待在分子結構、細胞以及神經網絡水平中上對 HCN 通道進一步深入探討，以期揭示 HCN 基因多態性及表達異常導致 MTLE-HS 的致癇機制，為 MTLE-HS 防治研究提供新的思路和為開發臨床藥物治療新靶點提供理論依據。
癲癇是一種由多種病因引起的慢性腦部疾病，以腦神經元過度放電導致反復性、發作性和短暫性的中樞神經系統功能失常為特征。任何年齡均會發病，全世界約 7 000 萬患者，其反復發作不僅影響患者的身體健康，還對患者及其家人的生活、心理及經濟等方面造成負擔[1, 2]。其中伴海馬硬化性內側顳葉癲癇（Mesial temporal lobe epilepsy with hippocampus sclrosis，MTLE-HS）是最常見的癲癇綜合征之一，但其發病機制仍不清楚，是獲得性癲癇常見類型，與熱性驚厥（Febrile seizure，FS）密切相關，作為獲得性癲癇，其主要發病機制包括表觀遺傳調控和遺傳易感性[3]。MTLE-HS 發病機制非常復雜，中樞神經系統興奮與抑制間的不平衡導致癲癇發作，其主要與離子通道神經遞質及神經膠質細胞的改變有關[4]。離子通道是體內可興奮性組織興奮性調節的基礎，其編碼基因多態性位點的改變可影響離子通道功能，從而增加癲癇的遺傳易感性。在 MTLE-HS 中，主要研究的離子通道包括鉀離子、鈣離子和鈉離子通道[5]。但近年超極化激活環核苷酸門控通道（Hyperpolarizationactivated cyclic nucleotide gatedchannel，HCN）逐漸成為研究的熱點，研究發現 HCN 與癲癇，特別是顳葉癲癇（TLE）的發生發展有密切關系[6, 7]。現對相關研究進展作一綜述，以助于臨床上加強對相關疾病的認識。
1 超極化激活環核苷酸門控通道的結構特征
HCN 通道屬于電壓門控型離子通道，目前為止，發現四個亞型：HCN1～HCN4，由 HCN1～HCN4 基因編碼[8]。每個亞型有 6 個跨膜區（S1-S6），S4 為電壓感受器，在 S5 和 S6 之間有攜帶 GYG 膜體的孔區，功能是選擇性的離子過濾器[9]。S6 之后有一個 80 次重復的 C-Linker 圍繞六個跨膜區，其后是環核苷酸結合區 CNBD（the Cyclic nucleotide binding domain，CNBD）。CNBD 包含 3 個 α 亞基（A-C）和一個位于 A、B 亞基之間的 β 球體。C-linker 和 CNBD 稱為 cAMP 敏感區（cAMP-sensing domain，CSD）[10]。HCN 通道能夠傳導內向 Na+、K+電流（Ih），在結構上類似于電壓門控鉀離子通道，但缺乏對鉀離子的高選擇性，而且在生理條件下主要是傳導鈉離子。研究認為由于 HCN 的孔區僅存在兩個過濾點，這與 Kv 通道的四個過濾點不同；此外，在 HCN 通道中，具有過濾作用的酪氨酸重定位。當 HCN 通道與鉀離子結合時，鈉離子滲透到孔中而不與通道結合，因此，Ih 是一種內向的去極化電流[11, 12]。HCN 的四種亞型可以組裝成同質通道，也可以在不同的組合中進行功能組裝，形成異質通道[13]。
2 超極化激活環核苷酸門控通道的分布、表達與功能
在中樞神經系統中，HCN 通道分布并不一致，HCN1 和 HCN2 表達最豐富，而 HCN3 和 HCN4 通道在中樞神經系統中表達較少。HCN1 主要在新皮層、海馬、小腦皮層和腦干中表達最多[14]。HCN2 幾乎在整個大腦中均有表達，表達最多為丘腦、外側膝狀體和腦干核團[15]。HCN3 在中樞神經系統中幾乎不表達，HCN4 與 HCN1 表達有關，主要表達在丘腦各個核團、基底節和僵核[16]。在周圍神經系統中，HCN 通道也有表達，如背根神經節和三叉神經節，以 HCN1 表達最豐富[17]。HCN4 在心臟表達豐富，與心律失常有關，也與癲癇患者的猝死相關[18]。HCN 通道亞細胞定位具有神經元特異性，在新皮層和海馬椎體神經元中，主要分布在遠端軸突，調控軸突的興奮和突觸的網絡聯系[19, 20]。海馬、小腦和中腦中間神經元，胞體和軸突均有分布，用于維持膜的穩定性和神經遞質的傳遞[21]。這種不同的表達和分布有助于完成 HCN 的生理功能。
神經系統中，當 HCN 通道被激活后，小部分 HCN 通道在靜息膜電位期迅速開放，產生 Ih，主要作用有：① 減少膜靜止性輸入，抑制膜電位在刺激后發生震蕩，削弱突觸整合，減輕突觸誘發的神經元興奮；② 內向的 Ih 使膜發生去極化，細胞膜更接近興奮閾值。因此，Ih 電流的正常生理功能包括維持靜息膜電位、產生神經元的某些節律活動、調節軸突的整合和突觸傳遞，并且參與人體的多種生理過程，如睡眠和覺醒、學習和記憶、感覺和感知等。HCN 通道類似于節律誘發通道，引起膜節律性點燃，閾值下膜電位的震蕩，改變其他離子的濃度等[22]。
在膜電位為-65 mV 時，一部分 HCN 通道激活，產生局部緊張性電流，導致持續的鈉流入，使細胞膜去極化[23]。當去極化導致通道失活時，由于離子的流動，細胞膜隨之產生超極化效應。因此，通過穩定正負離子的流動，HCN 通道使膜電位穩定在閾下電位。因此，HCN 功能的喪失將會導致膜的超極化和興奮性的降低。然而，同時由于輸入電阻的增加，神經元對突觸刺激的反應也更靈敏。HCN 電流對神經元功能的這種雙重作用已在不同的腦區得到明確，包括丘腦、海馬和小腦等，并對高級的大腦功能有著重要影響，比如學習和記憶、控制晝夜節律節奏、睡眠及覺醒狀態等[24]。在上橄欖核主神經元的軸突起始段，HCN1 介導的電流通過提高閾值來降低放電峰概率[25]。此外，5-羥色胺 7（5-HT7）受體的激活導致 HCN 電流活化曲線發生去極化偏移，加快了神經元的放電速率和體內呼吸節律[26]。
HCN 通道既參與所在組織的正常生理功能，如睡眠和覺醒、學習和記憶、視覺和疼痛感知、神經元起搏、樹突整合等，也與所在組織的病理狀態密切相關[27]。神經損傷引起的神經源性疼痛常檢測到 HCN 表達增加，肥厚性心肌病和終末期心力衰竭等常檢測到心室肌細胞 HCN4 mRNA 及 HCN2 mRNA 表達增加[8]。Cho 等[28]在牙髓炎模型中發現，三叉神經節 HCN1 和 HCN2 的表達顯著增加，并進一步驗證了 HCN1 和 HCN2 主要由三叉神經節神經元中機械敏感神經元的體細胞和感覺根中痛覺神經元的外周軸突共同表達的，并可能在牙髓炎癥性疼痛的機制中發揮重要作用。Luo 等[29]研究發現，慢性大腦低灌注模型中的空間學習和記憶缺陷與海馬 CA1 區的 HCN1 和 HCN2 異常表達有關。HCN1 和 HCN2 表達異常可能與早期的空間學習和記憶損傷有關，而空間學習、記憶的穩定性和晚期損傷可能是由于 HCN2 的表達上調。
3 超極化激活環核苷酸門控通道的調控
3.1 細胞內分子
包括小分子（如 cAMP、PIP2、protons），蛋白激酶（如 Src、p38-MAPK、PKC、cGKII、Ca2+/CaMKII），細胞間蛋白，都能影響到 HCN 通道的功能和表達[30, 31]。cAMP 在維持 HCN 生理功能上起著重要作用，能使 HCN2 和 HCN4 正相偏轉 17 mV。已經構建出 cAMP 對 HCN 抑制的動物模型，未連接 cAMP 的 CSD 區可抑制 S6 活動，并且限制內源性電壓活動。當 cAMP 結合 CNBD 釋放 CSD 時，促進 HCN 通道開放。使 HCN1 和 HCN3 CSD 活性增高。同樣，cGMP 和 cCMP 也能通過類似的方式調節 HCN 通道的相關亞型[32]。cGMP 和 cCMP 可以使 HCN2 和 HCN4 的電壓正相偏轉 6～8 mV，增加酶活性[33]。4,5-二磷酸磷脂酰肌醇（4,5-biphosphate，PIP2）能使 HCN 電壓在新生組織和離體表達組織正向偏轉約 20 mV，同時影響通道活性。PIP2 相結合的部位是孔區和跨膜區。通過膜的酸堿性調控 HCN 通道，調節神經元興奮性。小鼠丘腦內顆粒層（Internal granular layer，IGL）神經元 HCN3 表達非常豐富，PIP2 使 HCN 通道進一步去極化，使 HCN 通道活性增強。上調的 Ih 電流通過 PIP2 在 IGL 神經元引起低閾值點燃和瞬時震蕩。相反，PIP2 缺乏使 IGL 神經元興奮性減弱[34]。由此可見，PIP2 可以通過調節 HCN 門控的開放和活性，影響神經元的興奮性和節律性的點燃。
3.2 蛋白激酶
蛋白激酶在調控配體門控和電壓門控以及維持電壓方面起著非常重要的作用。越來越多的研究證實不同的激酶參與調控 HCN 通道的開放和細胞表面的表達。絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（Tyrosine kinase，Src）在中樞神經系統中廣泛表達，并且參與 HCN 的調節[35]。染料木黃銅是絲氨酸激酶抑制劑，能夠減小蟾蜍卵細胞和新生組織 HCN2 和 HCN4Ih 電流的峰值，伴隨電壓依賴性通道的負性偏轉。Src SH3 能夠直接和 CNBD 相結合，通過直接磷酸化起作用[36]?。
Serine/threonine 激酶同樣對 HCN 通道有調控作用。p38-MAPK 激活海馬椎體神經元，引起 25 mV 的超極化偏轉，使靜息膜電位（Resting membrane potential，RMP）超極化并且出現短時維持和瞬時峰值。同時又引起一個約 11 mV 的去極化電壓。在病理情況下，HCN 通道在海馬 CA1 區椎體神經元的持續性的下調，一部分原因可能是因為改變了 p38-MAPK 的信號通路。體外動物模型中，p38-MAPK 通道活性減低，外源性增加 p38-MAPK 的表達能使癲癇癥狀減輕[37]。在海馬神經元中，磷脂酶 C-蛋白激酶 C 活化，使 HCN1 磷酸化，降低 HCN 電流和 HCN1 的表達[30]。在神經元細胞中，HCN 通道也受到 p38 絲裂原活化蛋白激酶和鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 II 磷酸化的影響[38, 39]。另外，泛素化修飾肽（SUMO）對 HCN 通道的調節也起到重要作用。有研究在小鼠前腦發現了 HCN2 的泛素化，在轉染的 HEK 細胞中，HCN2 的泛素化增強 Ih 電流和 HCN2 的表達，這對于了解 HCN 在中樞神經系統疾病中的表達異常具有重要意義[40]。
3.3 相互作用蛋白
在神經系統中，許多支架蛋白與 HCN 通道 C 端相結合，調控 HCN 通道的開放。酵母雙雜交得出細絲蛋白可以和 HCN1 相結合，使 Ih明顯超極化。細絲蛋白 A 主要是通過 CNBD 下游的 22 個氨基酸序列相結合發揮調控作用，這個區域在 HCN2，HCN3 和 HCN4 并不是保守區域，因此，細絲蛋白 A 是 HCN1 的特異性調控蛋白。此外細絲蛋白 A 促進 HCN1 通道可逆的動力依賴性內化，并通過細胞內室通道的積累促進 HCN1 通道在細胞表面的再分布[41]。在體外培養的海馬神經元中發現，顯性負調節的細絲蛋白 A 能增加 HCN1 的表達，而快速消除兩者的相互作用后增強 Ih 電流[42]。支架蛋白 Tamalin、S-SCAM 和 Mint2 通過不同的蛋白亞基作用于 HCN2 通道。最近研究顯示，腦特異性因子 TRIP8b（TPR-containing Rab8b-interacting protein）在神經系統中影響 HCN 的表達、定位和功能。在哺乳動物大腦中，TRIP8b 是 HCN 通道輔助亞基，與 HCN1 有很強的共定位關系，定位在新皮層和海馬椎體神經元遠端軸突。在體內，TRIP8b N 端至少有 9 個不同的剪切體。這些剪切體在海馬椎體神經元和其他組織中調控 HCN1 的表達。TRIP8b 敲除鼠中，Ih 電流峰值在海馬椎體神經元中明顯減低。TRIP8b（1a-4）和 TRIP8b（1a）是在海馬中表達最為豐富的兩個剪切體 TRIP8b（1a-4）在離體細胞中上調 HCN1，啟動軸突表達 HCN1。TRIP8b（1a）相反，在蟾蜍卵細胞中能下調 HCN1，抑制海馬 CA1 區椎體神經胞體 HCN 通道表達。此外，TRIP8b 基因敲除大鼠還顯示運動學習能力的缺失[43]。總之，內源性 TRIP8b 與通道蛋白相互作用在調控 HCN 通道的生理功能上發揮著巨大作用。這個作用主要和 HCN 通道兩個位點有關：C-linker/CNBD 保守核心區 80 個氨基酸、 C-端 SNL 三堿基重復序列。最近研究證實，HCN1 通道的 C-linker/CNBD 和 TRIP8b 相結合，可以下調 HCN1 表達，而 C-端 SNL 區正好相反。因此，內源性 TRIP8b 通過與上述兩個位點相結合，動態調控 HCN 的表達。另外，TRIP8b 還參與調控 HCN 通道的門控性和開放性。這個作用主要是通過和 HCN1C-linker/CNBD 相結合完成。由于 CNBD 同時也是 cAMP 的結合位點，所以當結合的 cAMP 水平增高時，可干擾 TRIP8b 和 CNBD 的結合，從而抑制 HCN1 通道的上調。所以 TRIP8B 和 cAMP 共同調控 HCN 通道的開放、激活和失活[44]。另外研究發現，TRIP8b 基因敲除小鼠顯著降低了丘腦投射皮層 5b 神經元和丘腦中繼神經元的 HCN 通道表達和功能，但保留了網狀丘腦核抑制神經元的功能[45]。此外 Caveolin、KCR1，Nedd4-2 等輔助蛋白也能夠與 HCN 通道發生相互作用[46-48]。
3.4 細胞外神經遞質
3.4.1 乙酰膽堿
膽堿能神經元主要在腦干和前腦基底區表達最為豐富。在腦干，主要來自于腦橋角核和三叉神經背核。乙酰膽堿（Ach）在神經系統中和多種生理功能調控有關，如睡眠和覺醒，運動調節，增強感受器敏感性，促進快速動眼期（Rapid eye movemet，REM）睡眠[49]。主要是通過膽堿能受體（mAChRs）和阿片受體（nicotinic receptors）起作用。Ach 對 Ih的調控是通過激活不同的 mAChRs 亞型（M1-M5）起作用[50]。Ach 的總體作用是降低 Ih。在脊椎動物中，Ach 調控運動的啟動，引起運動相關神經元興奮性降低，這樣減少運動過程中相關神經元的參與[51]。在嗜鉻細胞中，mAChRs 的激活，導致膜電位持續時間增加。脊髓 α 運動神經元表達 m2AChRs，能夠降低 cAMP 水平，因此，有可能通過 M2 型受體抑制 cAMP 的信號傳導而導致 Ih的下調[8]。
3.4.2 單胺類神經遞質
單胺類神經遞質，如去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、醛固酮、多巴胺等在調節機體的各項活動中起著重要作用，如睡眠和覺醒，高級認知功能，如學習、工作記憶，警惕和做決定等[52]。單胺類神經遞質紊亂可以引起許多神經系統疾病，如帕金森氏病、藥物成癮、精神分裂癥、雙相情感障礙等。在神經系統中，HCN 通道是單胺類神經遞質的靶向位點，參與調控神經元興奮性，突觸傳遞、整合和可塑性。NE 能神經元通過抑制 HCN 使前腦功能性神經網路增強。在前額皮層神經元中，HCN 通道和 a2A-ARs（Alpha2A-adrenoceptors）共同定于軸突[52, 53]。一種觀點認為，HCN 通道的抑制是由于 cAMP 參與；另外一種觀點認為與 PLK-PKC 信號通路有關[54]。在小鼠中腦腹側被蓋區（Ventval tegmental area，VTA）多巴胺神經元中，Ih的調控也是通過激活 a2A-ARs 起作用。a2A-ARs 選擇性的降低 Ih電流幅度，減少 Ih激活頻率，通過受體亞型激活 PLK-PKC 通路。a2A-ARs 使 HCN 通道向超極化方向偏移，多巴胺能神經元更易激活，在病理情況下皮層-邊緣系統調控突觸可塑性上起著重要作用[55]。
3.4.3 谷氨酸
谷氨酸（Glu）是神經系統的初級興奮性神經遞質。離子型和代謝型 Glu 受體通過 Glu 的激活能在海馬軸突表面調控 HCN1 的表達。癲癇大鼠模型中 Glu 釋放增多會影響 HCN 通道的轉錄[8]。Glu 的增加使膜表面 HCN 蛋白表達上調。研究表明，N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptors，NMDA）依賴的長時程增強（Long-term potentiation，LTP）就是通過海馬 CA1 區 HCN 通道 theta 爆發表達上調的結果。這種上調的機制可能是離子型受體通過激活 Ca2+/CaMKII 使鈣離子內流增多導致。代謝型 Glu 受體激活可能使細胞表面 HCN 表達減少[56]。Schaffer 側枝的長時程抑制（Long-term depression，LTD）引起軸突 HCN 通道下調，同時伴隨有超極化電壓的衰減和閾值下反應頻率的減低。Glu 的調控主要是通過 I 型 Glu 受體 mGluRs，激活下游的 PLC-PKC 信號通道。阻斷 I 型 Glu 受體 mGluRs，上述作用明顯減弱。在病理情況下，Glu 能影響 HCN 基因轉錄。在癲癇小鼠模型中，Glu 通過激活 Ca2+/CaMKII 鈣依賴的 AMPA 受體，使鈣離子內流增多，從而減低 HCN mRNA 水平和蛋白水平。Ca2+/CaMKII 能夠增強轉錄因子神經元限制性沉默因子（Neuronal restrictive silencing factor，NRSF）的表達，降低 HCN1 轉錄。在癲癇持續狀態后，NRSF 與 HCN1 結合增強，導致海馬 CA1 區椎體神經元 HCN1 表達減少和 Ih 電流降低[57]。細胞外高濃度的 Glu 引起 HCN 通道不同亞型之間轉錄不平衡，這種不平衡增加神經元興奮性導致癲癇，形成了一個正反饋，稱為“癲癇誘發癲癇”。
4 超極化激活環核苷酸門控通道與顳葉癲癇
許多研究表明，HCN1 和 HCN2 亞型功能缺失突變會引起神經元興奮性增強，甚至可能引起癲癇持續狀態[6, 58]。HCN1 基因缺失小鼠通過紅藻氨酸誘導更容易引起癲癇發作，盡管其靜息膜電位存在超極化，但小鼠的皮質和海馬神經元的突觸興奮性增加[59]。已有研究表明，HCN2 的廣泛缺失將會導致癲癇的發生[60]。在 MTLE 大鼠模型中研究發現，大腦皮質和海馬 HCN1 和 HCN2 表達明顯下調，且這種下調可持續 6 周。在 MTLE 患者大腦皮質和海馬中也同樣發現 HCN1 和 HCN2 mRNA 水平的下調。MTLE-HS 患者多伴有早期觸發因素，如各種原因引起的癲癇持續狀態或腦部創傷、FS 等[61]。Wang 等[62]于 2001 年首次報道在 FS 模型中，海馬 CA1 區神經元胞體和軸突 HCN1 表達下降，而 HCN2 表達增多。在未成年的大鼠中腹側與背側的 CA1 神經元相比，HCN1 與 HCN2 亞基的比例增加，使 HCN 通道在腹側 CA1 神經元的靜息電位中發揮更突出作用，背側 CA1 神經元中 HCN 通道表達減少，增強了神經元興奮性[63, 64]。Nakamura 等[65]在 2 例 FS 家族中發現HCN2 的一個錯義突變，p.S126L。在功能上，該突變導致 HCN 與 cAMP 結合增強，從而增加了神經元興奮性，可能是導致 FS 的原因之一。許多動物模型已經證實，HCN 通道功能的改變和癲癇的起源密切相關，在 HCN1 基因完全敲除小鼠模型中，HCN1 的不表達導致 Ih 電流減弱，在皮層神經元，導致突觸整合和點燃時間延長[66]。同時，海馬 CA1 區椎體神經元軸突興奮性增加，瞬間可達到高峰，幼鼠在出生后不久即死亡[67]。 HCN2 基因敲除大鼠中，存活大鼠易發生癲癇。在 FS 動物模型中，FS 通過調控 HCN1 和 HCN2 的表達，增加神經元的興奮性，從而導致成年期癲癇反復發作[68]。文獻報道在 TLE 動物模型中，HCN 通道在急性期和慢性期均表達下調，推測可能是癲癇持續狀態后引起的代償反應[18]。因此，在不同的癲癇模型和不同時間點，HCN 的表達也會存在差異。HCN4 通道通常在心臟細胞中表達，但最近的研究發現，HCN4 的功能缺失突變也與癲癇密切相關。有報道稱，在患有嬰兒良性肌陣攣性癲癇的兩兄弟中發現HCN4p.Arg550Cys 雜合突變，導致 HCN4 通道功能的喪失，進而引起神經元興奮性增加，增加了癲癇易感性。另外已明確HCN4p.Pro1117Leu 和 p.Gly153Glu 突變也會對通道的功能產生重大影響[69]。Becker 等[70]在 HCN1 基因中鑒定出兩個新的雜合錯義變，并證實新的雜合突變導致早發癲癇性腦病。Marini 等[7]在 HCN1 基因中鑒定出新的雜合錯義突變，其中 Gly391Asp 變異體與最嚴重的新生兒表型相關，對通道功能也有最嚴重的影響，該研究進一步說明 HCN 通道在大腦發育和神經元興奮性控制中發揮著關鍵。大量的臨床前和人類遺傳學研究支持 HCN 通道病與癲癇之間存在關聯。然而并不是所有的研究都表明 HCN 通道的改變與疾病之間存在單一的因果關系。事實上，HCN 通道的上調和下調都與癲癇相關。
5 討論
HCN 通道在覺醒和睡眠，學習和記憶中起著非常重要的作用，其表達異常與 FS 和 MTLE 的發生密切相關。但其改變的機制仍不明確。MTLE 大部分屬于癥狀性癲癇，與表觀遺傳學密切相關。在臨床上，僅有少部分患者在 FS 后形成 MTLE，故也和遺傳易感性關系密切，因此，我們推測 HCN 基因多態性與 MTLE-HS 發生相關。目前 HCN 通道的研究報道仍相對較少，且 HCN 在 MTLE-HS 的致癇機制仍不明確。因此，有待在分子結構、細胞以及神經網絡水平中上對 HCN 通道進一步深入探討，以期揭示 HCN 基因多態性及表達異常導致 MTLE-HS 的致癇機制，為 MTLE-HS 防治研究提供新的思路和為開發臨床藥物治療新靶點提供理論依據。