目的? 構建并篩選出具有干擾作用的髓磷脂相關抑制物 66（neurite?outgrowth? inhibitory?66，nogo66）小分子干擾 RNA（samll? interfering?RNA，siRNA）真核表達載體，為進一步構建腺相關病毒載體奠定基礎。? 方法? 設計 2 條針對大鼠 nogo66 基因的短發夾 RNA（short?hairpin?RNA，shRNA）和 1 條陰性對照序列，插入載體 pGenesil-1.1，
同時用 pGenesil-1.1 質粒作為空白對照，得到 4 種質粒 pGenesil-nogo66-siRNA-1、pGenesil-nogo66-siRNA-2、pGenesil-nogo66-siRNA-hk、pGenesil-nogo66-siRNA-kb，對 4 種質粒進行 DNA 測序和酶切鑒定；培養大鼠膠質細胞瘤 C6 細胞，用4 種質粒進行轉染，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白，檢測轉染效率；采用RT-PCR 和 Western?blot 分別檢測 nogo 基因在 mRNA 水平和蛋白水平的表達差異，篩選出對 nogo66 基因具有干擾作用的 nogo66-siRNA 表達質粒。? 結果 ? DNA測序顯示設計的 2 種質粒干擾序列正確； Kpn Ⅰ /Xho Ⅰ雙酶切 4 種質粒均可見 800?bp 及 4.3?kb 條帶； 4 種質粒分別轉染C6 細胞后培養 48?h，熒光顯微鏡下均可見綠色熒光蛋白表達，平均轉染效率約為 73%。RT-PCR 和 Western?blot 檢測顯示：與未轉染細胞相比，轉染 pGenesil-nogo66-siRNA-1 使 nogo 基因表達下降 22%、蛋白表達下降 73%，轉染 pGenesil-no-go66-siRNA-2 使 nogo 基因表達下降 28%、蛋白表達下降 78%，差異均有統計學意義（P? lt;?0.05）；而轉染 pGenesil-nogo66-siRNA-hk、pGenesil-nogo66-siRNA-kb 后 nogo 基因表達和蛋白表達均無明顯下降（P? gt;?0.05）。? 結論? 成功構建并篩選出具有干擾作用的 nogo66-siRNA 真核表達載體，為深入研究脊髓損傷修復奠定了理論基礎。
引用本文： 李若飛,黨曉謙,李建偉,王坤正,柏傳毅,包理忠,婁高杰. 髓磷脂相關抑制物 66 小分子干擾真核表達載體構建與篩選. 中國修復重建外科雜志, 2010, 24(2): 185-189. doi: 復制