為了構建pGenesil-1-Beclin1真核表達載體,并建立Beclin1穩定沉默的人成神經瘤SH-SY5Y細胞系,將合成的shRNA片段連接pGenesil-1質粒,構建成重組質粒pGenesil-1-Beclin1,轉化其至感受態大腸桿菌JM109,挑取陽性克隆進行雙酶切和DNA測序鑒定。常規培養SH-SY5Y細胞,將重組質粒pGenesil-1-Beclin1和空白對照質粒pGenesil-1轉染SH-SY5Y細胞,G418抗性篩選,在熒光顯微鏡下挑取單細胞克隆并擴大培養至穩定細胞株,經RT-PCR和Western blot 檢測Beclin1基因的表達。經酶切和DNA測序鑒定重組真核表達載體構建正確,成功篩選出兩株細胞系。和對照組轉染pGenesil-1的細胞系相比,轉染pGenesil-1-Beclin1 細胞系的Beclin1 mRNA表達下降71.28%±1.45%(P＜0.05),Beclin1蛋白表達下降75.50%±2.63%(P＜0.05)。提示已經成功構建pGenesil-1-Beclin1真核表達載體并建立了Beclin1基因穩定沉默的SH-SY5Y細胞系,為研究Beclin1功能提供了細胞模型。
