眼內淋巴瘤（IOL）是一種罕見的淋巴細胞惡性腫瘤，組織細胞學病理檢查是診斷IOL的金標準。但由于常用的玻璃體樣本中淋巴瘤細胞較少且易變性，對標本的處理及病理學專家要求較高，容易出現假陰性的結果，延誤疾病的及時診斷及治療。因此，許多輔助診斷IOL的實驗室檢查方法應運而生，包括流式細胞術、細胞因子白細胞介素（IL）-10和IL-6水平測定以及聚合酶鏈反應擴增技術等。近來基因突變分析技術也開始應用于玻璃體視網膜淋巴瘤（VRL）的診斷，基因突變技術可能成為早期診斷IOL的方法；宏基因組深度測序技術也有助于VRL的診斷及治療。未來有望繼續推動在分子水平對IOL疾病表型的認識，并發現新的靶向目標進行治療、監測對治療的反應及疾病復發情況，為患者個性化治療方法提供重要依據。
引用本文： 秦碧萱, 張妍春, 康紫薇. 眼內淋巴瘤實驗室診斷性檢查的研究現狀和進展. 中華眼底病雜志, 2023, 39(1): 68-73. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210412-00190 復制
眼內淋巴瘤（IOL）是一種罕見的眼內惡性腫瘤，包括主要起源于中樞神經系統（CNS）的原發性IOL（PIOL），以及起源于CNS以外的淋巴瘤轉移至眼內的繼發性IOL（SIOL）[1-2]。玻璃體視網膜淋巴瘤（VRL）是近年的一個新名詞，突出該病趨向視網膜下和玻璃體內的淋巴組織增生的過程，目前最常見的PIOL是原發性VRL（PVRL）[3-4]。IOL具有較高的偽裝性，導致臨床醫生常將該病誤診為葡萄膜炎并進行糖皮質激素治療，這可能會暫時緩解癥狀，但會延誤IOL的診治。VRL患者初次發生癥狀到確診平均時間大于1年[5]，及時診斷IOL具有挑戰性。VRL目前尚無標準化的診斷、治療和疾病監測指南[6-7]。不同的實驗室研究和診斷技術被用于VRL的診斷，檢驗樣本一般為玻璃體和（或）房水，偶爾使用視網膜或脈絡膜組織。VRL診斷的金標準仍然是眼內標本，尤其是玻璃液的細胞學病理分析，但由于玻璃體樣本難以保存，淋巴瘤細胞脆性較高不易保持完整性，對病理科醫生操作技術要求很高，使病理診斷困難重重[8]。近年來，研究者發現其他檢測方法在VRL診斷中具有重要作用，檢測標本主要是玻璃體和（或）房水，如免疫組織化學技術、流式細胞術、克隆基因重排的分子檢測、眼內液細胞因子分析和髓樣分化因子初次應答基因88（MYD88）L265P突變分析[9-14]。由于細胞學診斷的局限性，這些技術可用于輔助臨床高度可疑VRL的診斷。現就IOL實驗室診斷性檢查作一綜述，以期為IOL的臨床診療提供新的思路。
1 臨床表現
PIOL是一種偽裝綜合癥，其發病年齡15～85歲，中位年齡50～60歲，大部分患者為雙眼發病[7, 15]。但最初發病時，雙眼的臨床表現常不一致[7]。患者初始癥狀常為視物模糊、視力下降和飛蚊癥，但無黃斑水腫或水腫輕微，初期患者視力通常變化不明顯，且無眼紅、眼痛、畏光等癥狀。VRL最常見的臨床表現為后葡萄膜炎，眼科檢查常可發現眼中部及眼后節受累，包括玻璃體、視網膜和脈絡膜浸潤。盡管惡性腫瘤發生在視網膜內，VRL最常見的臨床初期表現為玻璃體混濁[16]，淋巴瘤細胞較反應性炎癥細胞體積更大，不與其簇狀聚集，在玻璃體內往往形成片狀淋巴瘤細胞堆積，這一表現有助于與其他非感染性葡萄膜炎鑒別。VRL患者視力通常較好，與玻璃體炎癥的表現嚴重程度不相符[5]。腫瘤細胞表現出嗜Bruch膜和視網膜色素上皮（RPE）之間區域浸潤的傾向[16]，眼底表現為RPE下的局灶性橘黃色“奶油狀”浸潤，這可能是由腫瘤表達的趨化因子受體和RPE異常表達的同源趨化因子配體介導[4]，逐漸擴大的浸潤灶使視網膜不斷增厚而透明度降低，最終甚至導致嚴重的滲出性視網膜脫離[5]。
IOL臨床表現多樣，常見一些不典型的眼底特征，如更小的淋巴瘤形成類玻璃膜疣樣沉積物[17]，血管周圍形成血管鞘的類似血管炎表現[18]，黃斑附近病變類似“盤狀”瘢痕，而浸潤到視盤時可類似視盤水腫[19]。這些病變可自行消退，遺留局灶性RPE萎縮和視網膜下纖維化[20]。腫瘤繼發性的炎癥反應和新生血管可加重滲出、黃斑水腫、視網膜血管阻塞和類似視網膜炎的出血。還需要注意的是，VRL也可表現為前/中葡萄膜炎，因為腫瘤細胞也可能累及前房，表現為非肉芽腫性葡萄膜炎或羊脂狀角膜后沉著物[21]，因此眼前節檢查同樣重要。大部分PIOL患者可出現淋巴瘤的CNS表現，當出現腦部浸潤時可發生行為和認知功能改變[7]。
2 影像學表現
除裂隙燈顯微鏡及眼底檢查外，可輔助診斷的影像檢查包括眼底自身熒光（FAF）、光相干斷層掃描（OCT）、熒光素眼底血管造影（FFA）和吲哚青綠血管造影（ICGA）。FAF有助于識別微小的淋巴瘤浸潤，尤其是RPE表層的微小破壞[22]，強熒光點提示活動性視網膜下RPE病灶[23]。淋巴瘤浸潤消退后（經治療或自發消退）可能會遺留弱自身熒光區域[23]。由于視網膜下腫瘤浸潤導致點片狀脈絡膜強熒光，VRL在FFA上可表現為斑駁狀、顆粒狀，晚期“豹紋斑點狀”等非VRL的特異性表現[24]；在ICGA多表現為散在或成簇的圓形斑點狀強熒光改變，也可表現為片狀強熒光[25]。OCT可以清晰顯示位于Bruch膜和RPE之間的浸潤性改變，其反射性一般比Bruch膜和RPE層稍弱，有時也表現為垂直的柱形超強反射[26]。OCT還可以顯示VRL中累及玻璃體和視網膜全層的病變，包括玻璃體混濁、RPE異常（蟲蝕樣改變）和RPE下沉積，以及視網膜前、視網膜內和視網膜神經感覺層下沉積。嚴重病例或晚期VRL，其OCT可表現為RPE損傷、光感受器視網膜內外節連接中斷、內層視網膜大量強反射性浸潤、滲出性視網膜脫離[27]。此外，OCT可用來動態觀察治療后視網膜下病變的消退情況。其他新型影像學成像方法，如激光共聚焦掃描眼底成像，可提供更為廣泛的視網膜病變證據[28]。
3 實驗室診斷性檢查
3.1 細胞學與免疫組織化學染色
眼部標本的組織病理學檢查是VRL診斷的金標準，即在眼內標本中找到惡性淋巴細胞，并通過免疫組織化學染色來確定淋巴細胞的類型和克隆性[7, 29]。可以通過細針前房穿刺抽液、玻璃體抽吸或玻璃體切割手術獲得標本，必要時需進行視網膜或脈絡膜活檢。玻璃體切割手術能夠獲得較大樣本量并清除玻璃體碎片改善患者癥狀[30]，但手術后淋巴瘤可能通過鞏膜切口進入眼球外間隙[31]。針刺活檢可能需要重復多次才能明確診斷，但所能獲得的樣本量較少[6]。淋巴瘤細胞非常脆弱，抽取的眼內液體必須保持平穩并快速送檢，防止細胞壞死造成診斷困難[32]。將樣本離心可以增加活檢的靈敏度，也可將樣本置于細胞凍存培養基提高細胞生存力[33]。由于淋巴瘤細胞對皮質類固醇敏感，因此，有學者建議在活檢前至少停用潑尼松2周或將口服劑量減少至≤10 mg/d，并應告知患者在此期間臨床癥狀可能加重[34]。彌漫大B細胞淋巴瘤的典型細胞病理學特征是體積增大（正常淋巴細胞的2～5倍），且細胞核增大、核分裂象增多，由于核質比增大，細胞核周圍僅有薄層細胞質包繞[16]。免疫組織化學染色能夠提供異常淋巴細胞是否為B細胞來源的證據[5]。B淋巴瘤細胞CD19、CD20、CD22和CD79 κ或λ陽性，而CD3表現為陰性。T淋巴瘤細胞CD3、CD4陽性，CD20陰性。B細胞和T細胞淋巴瘤均與高Ki67陽性率相關（平均值＞80%），提示細胞大量增生[3]。通過細胞學和免疫組織化學染色分析，在顯微鏡下可以直接觀察獲知細胞所屬的亞群[4, 35]。然而，因玻璃體處理不當及經驗豐富的細胞病理學專家數量限制，假陰性率高達30%[16]。
3.2 流式細胞術
流式細胞術可以檢測細胞表型并確定單克隆或多克隆的B細胞或T細胞群。惡性單克隆B淋巴細胞免疫球蛋白輕鏈（κ或λ鏈）比例失衡，κ：λ比值為3或0.6，是淋巴瘤的高度敏感標志物[36]。據報道，流式細胞術的靈敏度和特異性分別為82%、100%[37]。但是當淋巴瘤細胞和（或）豐富的反應性T細胞保存不當時會影響流式細胞術的診斷率，使其應用受限[11]。因此，需要其他簡單可靠的輔助診斷方法，如細胞因子水平分析和聚合酶鏈反應（PCR）檢測等無需特殊處理（運輸路程遠時可冷凍運輸），也無需專家判讀結果。其中最常用方法是測定白細胞介素（IL）-10和IL-6水平或對玻璃體標本進行免疫球蛋白重鏈（IGH）PCR測定。
3.3 PCR
現代PCR技術的應用大大減少了診斷所需的標本量，該技術的靈敏度為65%～95%，具體數值與引物和試劑的質量有關[20]。利用PCR技術對成熟B細胞增生進行克隆分析時，最常用的靶點是IGH基因重排，該方法的特異性為78.95%[38]。據報道，IGK基因重排的特異性為94.12%，較IGH更高，因此使用IGH和IGK聯合分析可以獲得比單獨分析更準確的VRL診斷結果[38]。對T細胞淋巴瘤的分析可使用T細胞受體基因重排[39]。檢測Bcl-2基因t（14；18）易位也是診斷IOL的有效方法。Wallace等[40]研究發現，72例PIOL患者中有40例在Bcl-2主要斷裂區發生t（14；18）易位。對疑似眼內NK細胞淋巴瘤患者的房水進行人類皰疹病毒4型病毒的PCR分析有利于支持該診斷[41]。
3.4 細胞因子分析
細胞因子分析可以輔助VRL的診斷，大多數研究都是使用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的方法測量細胞因子水平[42]。目前最新的方法為細胞因子微球檢測技術[43]，即一種基于流式細胞檢測系統的多重蛋白定量檢測方法，其基本原理和ELISA具有相似之處，可以對單個少量（25～50 μl）眼內液樣本中多個指標同時進行檢測。其診斷指標為IL-10/IL-6的比例＞1[12]或前房水中IL-10水平≥50 pg/ml[44]。IL-10是一種免疫調節因子，由淋巴瘤細胞分泌并促進其生長和擴增。Chan等[45]首次報道，在3例PVRL患者玻璃體樣本中檢測到IL-10。一般炎癥中，IL-6表達水平增加，IL-10/IL-6比例可鑒別葡萄膜炎和VRL。近年的研究發現，IL-10水平和IL-10/IL-6比例檢測的靈敏度為70%～90%[34, 46]。在最大的NIH分組研究中，IL-10/IL-6比例檢測的靈敏度為88%，特異性為85%[47]。另一項研究結果顯示，兩個參數的曲線下面積分別為0.931和0.972，均表現出非常高的獨立診斷性能[38]。一項納入150例可疑VRL患者的研究評估了細胞學、PCR、細胞因子水平三種不同方法對玻璃體標本檢測進行診斷的有效性，這些患者中最終有78例確診為VRL。結果表明，三種方法的檢測靈敏度分別為73.6%、46.0%和81.4%，準確率分別為85.6%、60.4%和80.9%[42]。而Kimura等[13]對52例VRL患者進行了細胞學、細胞因子水平和PCR的診斷比較，發現IL-10/IL-6比值的可靠性和靈敏度最高，其次是PCR IgH基因重排，而細胞學靈敏度最低；考慮到前房穿刺抽取房水的易操作性和安全性，以及房水細胞因子水平對診斷的高特異性和良好的準確度，有學者提出應將細胞因子分析作為診斷VRL的標準方法，為所有可疑VRL患者進行篩查[42]。
但是，應注意IL-10/IL-6比例僅適用于眼內彌漫大B細胞淋巴瘤的診斷，應作為診斷IOL的聯合診斷方法之一，而不能單獨用來作為獨立診斷依據[12, 44]。一些特殊病例如葡萄膜炎患者可能會出現IL-10/IL-6比例升高的情況，而VRL患者也可能會出現IL-10/IL-6比例偏低的情況[48-49]。當患者存在廣泛而嚴重的RPE下或視網膜浸潤時，IL-10/IL-6比例可能不典型，該類患者可能因血視網膜屏障破壞或反應性細胞募集并分泌IL-6而使IL-6水平升高[50]。所以，當PVRL患者出現廣泛的RPE下浸潤累及視盤或IL-6水平明顯升高時，建議更仔細地評估CNS[38]。此外，神經腫瘤醫生也不能憑借IL-10水平升高作為VRL患者進行全身化學藥物治療（以下簡稱為化療）的指征，需要結合細胞病理學、流式細胞術或腫瘤分子生物學等證據評價腫瘤進展后決定治療方案[51]。
3.5 基因突變分析
由于VRL的輔助診斷方法仍不完善，近年來，基因突變分析技術開始應用于VRL的診斷。最近，隊列研究發現在62%～88%的VRL患者玻璃體中檢測到MYD88 L265P突變[14, 52-53]這可能成為早期診斷VRL的方法，能提高玻璃體活檢的靈敏度。MYD88是一種細胞膜相關蛋白，可轉移toll樣受體和IL-1受體介導的免疫反應信號[54]。研究發現，在彌漫性大B細胞淋巴瘤中，MYD88基因最常見的突變是密碼子265由亮氨酸突變為脯氨酸（L265P），該突變具有致癌性，能激活核因子-κB從而促進細胞存活[55]。
近年來，一些研究將MYD88 L265P突變的PCR技術作為VRL的診斷方法[56]，甚至從抽取的房水標本中進行檢測[57]。Miserocchi等[53]應用細胞學在75%的VRL患者房水中檢測到MYD88基因突變。雖然樣本量較少，但與對照組相比，房水和玻璃體樣本檢測結果的一致性和與對照組比較的特異性都表明MYD88 L265P突變與VRL診斷有很強的相關性。這兩項研究都未能將葡萄膜炎患者作為MYD88基因突變研究的對照組進行討論。該方法不能診斷出所有的VRL，陰性結果也并不能完全排除VRL，因此，其不能完全取代現有的其他診斷方法[38]。
3.6 宏基因組深度測序（MDS）
盡管上述一系列方法對診斷IOL有重要的作用，但在臨床診斷VRL時仍受限于有限的玻璃體組織樣本量，這使醫生往往不得不面臨究竟將未稀釋的玻璃體標本用來做何種檢測的選擇。一種新的分子生物學檢查方法，MDS提供了全面檢測VRL發生的可能。利用該技術可對全基因組進行測序，因此可以識別與淋巴瘤發生有關的任何基因突變，而非某單個基因突變。Gonzales等[58]通過MDS在IOL患者樣本中檢測出人類皰疹病毒（HHV）-4和HHV-8的RNA及MYD88基因的罕見突變；Takhar等[5]在患者樣本中檢測出MYD88基因的L265P突變，并已檢測出105個基因突變。更為重要的是，該技術僅需微小的樣本量（20～50 μl）就能發現淋巴瘤細胞，這對于診斷眼部疾病非常理想[24]。另外，與流式細胞術和細胞病理學需要完整的細胞不同，MDS不受細胞完整性的限制，因此MDS實用性可能更強[5]。進一步研究發現，MDS不僅可用于診斷VRL，還能同時識別淋巴瘤相關的基因突變和感染性病原體，可以根據相關基因突變對化療耐藥性的不同制定個性化的治療方法[58]，指導淋巴瘤的治療。迄今為止，MDS相關的分析尚處于研究階段，僅靠MDS還不足以診斷VRL，但該方法為我們提供了未來非常有前景的IOL診斷技術。
4 治療
IOL的治療方式根據疾病的程度、是否存在CNS受累以及患者的身體狀況而有所不同，包括玻璃體內化療、全身化療和放射療法（以下簡稱為放療），可單獨或聯合使用，目前尚無明確的治療指南。目前認為腫瘤未累及CNS及全身其他器官的患者，應行局部眼內化療或眼部放療，以減輕治療的全身毒性[59]。CNS受累患者則應行放療及化療聯合治療。化療藥物主要為甲氨蝶玲、阿糖胞苷及利妥昔單抗，并可與其他藥物聯合使用，如地塞米松、噻替派，治療方案需要根據患者的具體情況來制定[3, 60]。
5 小結
IOL是一種罕見的淋巴細胞惡性腫瘤，極具偽裝性，易被誤認為眼內炎癥而導致誤診、漏診、治療不當，死亡率高。患者預后取決于：（1）是否累及CNS：累及CNS的患者幾乎均在短期內死亡，因此神經的影像學檢查在治療后仍然重要[61-62]。（2）組織病理學類型：T細胞來源的IOL通常比B細胞來源預后更差[63]。（3）治療機會：發病后及早治療可改善預后，獲得更好的視力[64]。（4）是否復發：腫瘤復發患者的視力和生存率均較差[3]。因此，盡早明確VRL的診斷非常重要。頻域OCT和FAF為評估VRL的亞臨床視網膜和脈絡膜病變帶來了新的希望。在臨床中通過對眼內標本進行細胞病理學、免疫組織化學染色、流式細胞術、PCR分析以及MYD88 L265P突變檢測的綜合分析，有助于對VRL的診斷。同時IL-10水平及IL-10/IL-6比例可為診斷提供有力支持，可作為對可疑VRL患者進行篩查的工具。隨著對VRL不斷深入的研究及MDS生物信息學的發展，將有機會在分子水平上進一步了解疾病表型和腫瘤對化療藥物的反應，IOL的診斷方法可能出現巨大的變化，同時利用小樣本量液體分析的相關檢查可能推動新的靶向目標治療、監測對治療的反應以及眼內腫瘤的復發，未來為患者制定個性化的治療方法提供臨床依據。
眼內淋巴瘤（IOL）是一種罕見的眼內惡性腫瘤，包括主要起源于中樞神經系統（CNS）的原發性IOL（PIOL），以及起源于CNS以外的淋巴瘤轉移至眼內的繼發性IOL（SIOL）[1-2]。玻璃體視網膜淋巴瘤（VRL）是近年的一個新名詞，突出該病趨向視網膜下和玻璃體內的淋巴組織增生的過程，目前最常見的PIOL是原發性VRL（PVRL）[3-4]。IOL具有較高的偽裝性，導致臨床醫生常將該病誤診為葡萄膜炎并進行糖皮質激素治療，這可能會暫時緩解癥狀，但會延誤IOL的診治。VRL患者初次發生癥狀到確診平均時間大于1年[5]，及時診斷IOL具有挑戰性。VRL目前尚無標準化的診斷、治療和疾病監測指南[6-7]。不同的實驗室研究和診斷技術被用于VRL的診斷，檢驗樣本一般為玻璃體和（或）房水，偶爾使用視網膜或脈絡膜組織。VRL診斷的金標準仍然是眼內標本，尤其是玻璃液的細胞學病理分析，但由于玻璃體樣本難以保存，淋巴瘤細胞脆性較高不易保持完整性，對病理科醫生操作技術要求很高，使病理診斷困難重重[8]。近年來，研究者發現其他檢測方法在VRL診斷中具有重要作用，檢測標本主要是玻璃體和（或）房水，如免疫組織化學技術、流式細胞術、克隆基因重排的分子檢測、眼內液細胞因子分析和髓樣分化因子初次應答基因88（MYD88）L265P突變分析[9-14]。由于細胞學診斷的局限性，這些技術可用于輔助臨床高度可疑VRL的診斷。現就IOL實驗室診斷性檢查作一綜述，以期為IOL的臨床診療提供新的思路。
1 臨床表現
PIOL是一種偽裝綜合癥，其發病年齡15～85歲，中位年齡50～60歲，大部分患者為雙眼發病[7, 15]。但最初發病時，雙眼的臨床表現常不一致[7]。患者初始癥狀常為視物模糊、視力下降和飛蚊癥，但無黃斑水腫或水腫輕微，初期患者視力通常變化不明顯，且無眼紅、眼痛、畏光等癥狀。VRL最常見的臨床表現為后葡萄膜炎，眼科檢查常可發現眼中部及眼后節受累，包括玻璃體、視網膜和脈絡膜浸潤。盡管惡性腫瘤發生在視網膜內，VRL最常見的臨床初期表現為玻璃體混濁[16]，淋巴瘤細胞較反應性炎癥細胞體積更大，不與其簇狀聚集，在玻璃體內往往形成片狀淋巴瘤細胞堆積，這一表現有助于與其他非感染性葡萄膜炎鑒別。VRL患者視力通常較好，與玻璃體炎癥的表現嚴重程度不相符[5]。腫瘤細胞表現出嗜Bruch膜和視網膜色素上皮（RPE）之間區域浸潤的傾向[16]，眼底表現為RPE下的局灶性橘黃色“奶油狀”浸潤，這可能是由腫瘤表達的趨化因子受體和RPE異常表達的同源趨化因子配體介導[4]，逐漸擴大的浸潤灶使視網膜不斷增厚而透明度降低，最終甚至導致嚴重的滲出性視網膜脫離[5]。
IOL臨床表現多樣，常見一些不典型的眼底特征，如更小的淋巴瘤形成類玻璃膜疣樣沉積物[17]，血管周圍形成血管鞘的類似血管炎表現[18]，黃斑附近病變類似“盤狀”瘢痕，而浸潤到視盤時可類似視盤水腫[19]。這些病變可自行消退，遺留局灶性RPE萎縮和視網膜下纖維化[20]。腫瘤繼發性的炎癥反應和新生血管可加重滲出、黃斑水腫、視網膜血管阻塞和類似視網膜炎的出血。還需要注意的是，VRL也可表現為前/中葡萄膜炎，因為腫瘤細胞也可能累及前房，表現為非肉芽腫性葡萄膜炎或羊脂狀角膜后沉著物[21]，因此眼前節檢查同樣重要。大部分PIOL患者可出現淋巴瘤的CNS表現，當出現腦部浸潤時可發生行為和認知功能改變[7]。
2 影像學表現
除裂隙燈顯微鏡及眼底檢查外，可輔助診斷的影像檢查包括眼底自身熒光（FAF）、光相干斷層掃描（OCT）、熒光素眼底血管造影（FFA）和吲哚青綠血管造影（ICGA）。FAF有助于識別微小的淋巴瘤浸潤，尤其是RPE表層的微小破壞[22]，強熒光點提示活動性視網膜下RPE病灶[23]。淋巴瘤浸潤消退后（經治療或自發消退）可能會遺留弱自身熒光區域[23]。由于視網膜下腫瘤浸潤導致點片狀脈絡膜強熒光，VRL在FFA上可表現為斑駁狀、顆粒狀，晚期“豹紋斑點狀”等非VRL的特異性表現[24]；在ICGA多表現為散在或成簇的圓形斑點狀強熒光改變，也可表現為片狀強熒光[25]。OCT可以清晰顯示位于Bruch膜和RPE之間的浸潤性改變，其反射性一般比Bruch膜和RPE層稍弱，有時也表現為垂直的柱形超強反射[26]。OCT還可以顯示VRL中累及玻璃體和視網膜全層的病變，包括玻璃體混濁、RPE異常（蟲蝕樣改變）和RPE下沉積，以及視網膜前、視網膜內和視網膜神經感覺層下沉積。嚴重病例或晚期VRL，其OCT可表現為RPE損傷、光感受器視網膜內外節連接中斷、內層視網膜大量強反射性浸潤、滲出性視網膜脫離[27]。此外，OCT可用來動態觀察治療后視網膜下病變的消退情況。其他新型影像學成像方法，如激光共聚焦掃描眼底成像，可提供更為廣泛的視網膜病變證據[28]。
3 實驗室診斷性檢查
3.1 細胞學與免疫組織化學染色
眼部標本的組織病理學檢查是VRL診斷的金標準，即在眼內標本中找到惡性淋巴細胞，并通過免疫組織化學染色來確定淋巴細胞的類型和克隆性[7, 29]。可以通過細針前房穿刺抽液、玻璃體抽吸或玻璃體切割手術獲得標本，必要時需進行視網膜或脈絡膜活檢。玻璃體切割手術能夠獲得較大樣本量并清除玻璃體碎片改善患者癥狀[30]，但手術后淋巴瘤可能通過鞏膜切口進入眼球外間隙[31]。針刺活檢可能需要重復多次才能明確診斷，但所能獲得的樣本量較少[6]。淋巴瘤細胞非常脆弱，抽取的眼內液體必須保持平穩并快速送檢，防止細胞壞死造成診斷困難[32]。將樣本離心可以增加活檢的靈敏度，也可將樣本置于細胞凍存培養基提高細胞生存力[33]。由于淋巴瘤細胞對皮質類固醇敏感，因此，有學者建議在活檢前至少停用潑尼松2周或將口服劑量減少至≤10 mg/d，并應告知患者在此期間臨床癥狀可能加重[34]。彌漫大B細胞淋巴瘤的典型細胞病理學特征是體積增大（正常淋巴細胞的2～5倍），且細胞核增大、核分裂象增多，由于核質比增大，細胞核周圍僅有薄層細胞質包繞[16]。免疫組織化學染色能夠提供異常淋巴細胞是否為B細胞來源的證據[5]。B淋巴瘤細胞CD19、CD20、CD22和CD79 κ或λ陽性，而CD3表現為陰性。T淋巴瘤細胞CD3、CD4陽性，CD20陰性。B細胞和T細胞淋巴瘤均與高Ki67陽性率相關（平均值＞80%），提示細胞大量增生[3]。通過細胞學和免疫組織化學染色分析，在顯微鏡下可以直接觀察獲知細胞所屬的亞群[4, 35]。然而，因玻璃體處理不當及經驗豐富的細胞病理學專家數量限制，假陰性率高達30%[16]。
3.2 流式細胞術
流式細胞術可以檢測細胞表型并確定單克隆或多克隆的B細胞或T細胞群。惡性單克隆B淋巴細胞免疫球蛋白輕鏈（κ或λ鏈）比例失衡，κ：λ比值為3或0.6，是淋巴瘤的高度敏感標志物[36]。據報道，流式細胞術的靈敏度和特異性分別為82%、100%[37]。但是當淋巴瘤細胞和（或）豐富的反應性T細胞保存不當時會影響流式細胞術的診斷率，使其應用受限[11]。因此，需要其他簡單可靠的輔助診斷方法，如細胞因子水平分析和聚合酶鏈反應（PCR）檢測等無需特殊處理（運輸路程遠時可冷凍運輸），也無需專家判讀結果。其中最常用方法是測定白細胞介素（IL）-10和IL-6水平或對玻璃體標本進行免疫球蛋白重鏈（IGH）PCR測定。
3.3 PCR
現代PCR技術的應用大大減少了診斷所需的標本量，該技術的靈敏度為65%～95%，具體數值與引物和試劑的質量有關[20]。利用PCR技術對成熟B細胞增生進行克隆分析時，最常用的靶點是IGH基因重排，該方法的特異性為78.95%[38]。據報道，IGK基因重排的特異性為94.12%，較IGH更高，因此使用IGH和IGK聯合分析可以獲得比單獨分析更準確的VRL診斷結果[38]。對T細胞淋巴瘤的分析可使用T細胞受體基因重排[39]。檢測Bcl-2基因t（14；18）易位也是診斷IOL的有效方法。Wallace等[40]研究發現，72例PIOL患者中有40例在Bcl-2主要斷裂區發生t（14；18）易位。對疑似眼內NK細胞淋巴瘤患者的房水進行人類皰疹病毒4型病毒的PCR分析有利于支持該診斷[41]。
3.4 細胞因子分析
細胞因子分析可以輔助VRL的診斷，大多數研究都是使用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的方法測量細胞因子水平[42]。目前最新的方法為細胞因子微球檢測技術[43]，即一種基于流式細胞檢測系統的多重蛋白定量檢測方法，其基本原理和ELISA具有相似之處，可以對單個少量（25～50 μl）眼內液樣本中多個指標同時進行檢測。其診斷指標為IL-10/IL-6的比例＞1[12]或前房水中IL-10水平≥50 pg/ml[44]。IL-10是一種免疫調節因子，由淋巴瘤細胞分泌并促進其生長和擴增。Chan等[45]首次報道，在3例PVRL患者玻璃體樣本中檢測到IL-10。一般炎癥中，IL-6表達水平增加，IL-10/IL-6比例可鑒別葡萄膜炎和VRL。近年的研究發現，IL-10水平和IL-10/IL-6比例檢測的靈敏度為70%～90%[34, 46]。在最大的NIH分組研究中，IL-10/IL-6比例檢測的靈敏度為88%，特異性為85%[47]。另一項研究結果顯示，兩個參數的曲線下面積分別為0.931和0.972，均表現出非常高的獨立診斷性能[38]。一項納入150例可疑VRL患者的研究評估了細胞學、PCR、細胞因子水平三種不同方法對玻璃體標本檢測進行診斷的有效性，這些患者中最終有78例確診為VRL。結果表明，三種方法的檢測靈敏度分別為73.6%、46.0%和81.4%，準確率分別為85.6%、60.4%和80.9%[42]。而Kimura等[13]對52例VRL患者進行了細胞學、細胞因子水平和PCR的診斷比較，發現IL-10/IL-6比值的可靠性和靈敏度最高，其次是PCR IgH基因重排，而細胞學靈敏度最低；考慮到前房穿刺抽取房水的易操作性和安全性，以及房水細胞因子水平對診斷的高特異性和良好的準確度，有學者提出應將細胞因子分析作為診斷VRL的標準方法，為所有可疑VRL患者進行篩查[42]。
但是，應注意IL-10/IL-6比例僅適用于眼內彌漫大B細胞淋巴瘤的診斷，應作為診斷IOL的聯合診斷方法之一，而不能單獨用來作為獨立診斷依據[12, 44]。一些特殊病例如葡萄膜炎患者可能會出現IL-10/IL-6比例升高的情況，而VRL患者也可能會出現IL-10/IL-6比例偏低的情況[48-49]。當患者存在廣泛而嚴重的RPE下或視網膜浸潤時，IL-10/IL-6比例可能不典型，該類患者可能因血視網膜屏障破壞或反應性細胞募集并分泌IL-6而使IL-6水平升高[50]。所以，當PVRL患者出現廣泛的RPE下浸潤累及視盤或IL-6水平明顯升高時，建議更仔細地評估CNS[38]。此外，神經腫瘤醫生也不能憑借IL-10水平升高作為VRL患者進行全身化學藥物治療（以下簡稱為化療）的指征，需要結合細胞病理學、流式細胞術或腫瘤分子生物學等證據評價腫瘤進展后決定治療方案[51]。
3.5 基因突變分析
由于VRL的輔助診斷方法仍不完善，近年來，基因突變分析技術開始應用于VRL的診斷。最近，隊列研究發現在62%～88%的VRL患者玻璃體中檢測到MYD88 L265P突變[14, 52-53]這可能成為早期診斷VRL的方法，能提高玻璃體活檢的靈敏度。MYD88是一種細胞膜相關蛋白，可轉移toll樣受體和IL-1受體介導的免疫反應信號[54]。研究發現，在彌漫性大B細胞淋巴瘤中，MYD88基因最常見的突變是密碼子265由亮氨酸突變為脯氨酸（L265P），該突變具有致癌性，能激活核因子-κB從而促進細胞存活[55]。
近年來，一些研究將MYD88 L265P突變的PCR技術作為VRL的診斷方法[56]，甚至從抽取的房水標本中進行檢測[57]。Miserocchi等[53]應用細胞學在75%的VRL患者房水中檢測到MYD88基因突變。雖然樣本量較少，但與對照組相比，房水和玻璃體樣本檢測結果的一致性和與對照組比較的特異性都表明MYD88 L265P突變與VRL診斷有很強的相關性。這兩項研究都未能將葡萄膜炎患者作為MYD88基因突變研究的對照組進行討論。該方法不能診斷出所有的VRL，陰性結果也并不能完全排除VRL，因此，其不能完全取代現有的其他診斷方法[38]。
3.6 宏基因組深度測序（MDS）
盡管上述一系列方法對診斷IOL有重要的作用，但在臨床診斷VRL時仍受限于有限的玻璃體組織樣本量，這使醫生往往不得不面臨究竟將未稀釋的玻璃體標本用來做何種檢測的選擇。一種新的分子生物學檢查方法，MDS提供了全面檢測VRL發生的可能。利用該技術可對全基因組進行測序，因此可以識別與淋巴瘤發生有關的任何基因突變，而非某單個基因突變。Gonzales等[58]通過MDS在IOL患者樣本中檢測出人類皰疹病毒（HHV）-4和HHV-8的RNA及MYD88基因的罕見突變；Takhar等[5]在患者樣本中檢測出MYD88基因的L265P突變，并已檢測出105個基因突變。更為重要的是，該技術僅需微小的樣本量（20～50 μl）就能發現淋巴瘤細胞，這對于診斷眼部疾病非常理想[24]。另外，與流式細胞術和細胞病理學需要完整的細胞不同，MDS不受細胞完整性的限制，因此MDS實用性可能更強[5]。進一步研究發現，MDS不僅可用于診斷VRL，還能同時識別淋巴瘤相關的基因突變和感染性病原體，可以根據相關基因突變對化療耐藥性的不同制定個性化的治療方法[58]，指導淋巴瘤的治療。迄今為止，MDS相關的分析尚處于研究階段，僅靠MDS還不足以診斷VRL，但該方法為我們提供了未來非常有前景的IOL診斷技術。
4 治療
IOL的治療方式根據疾病的程度、是否存在CNS受累以及患者的身體狀況而有所不同，包括玻璃體內化療、全身化療和放射療法（以下簡稱為放療），可單獨或聯合使用，目前尚無明確的治療指南。目前認為腫瘤未累及CNS及全身其他器官的患者，應行局部眼內化療或眼部放療，以減輕治療的全身毒性[59]。CNS受累患者則應行放療及化療聯合治療。化療藥物主要為甲氨蝶玲、阿糖胞苷及利妥昔單抗，并可與其他藥物聯合使用，如地塞米松、噻替派，治療方案需要根據患者的具體情況來制定[3, 60]。
5 小結
IOL是一種罕見的淋巴細胞惡性腫瘤，極具偽裝性，易被誤認為眼內炎癥而導致誤診、漏診、治療不當，死亡率高。患者預后取決于：（1）是否累及CNS：累及CNS的患者幾乎均在短期內死亡，因此神經的影像學檢查在治療后仍然重要[61-62]。（2）組織病理學類型：T細胞來源的IOL通常比B細胞來源預后更差[63]。（3）治療機會：發病后及早治療可改善預后，獲得更好的視力[64]。（4）是否復發：腫瘤復發患者的視力和生存率均較差[3]。因此，盡早明確VRL的診斷非常重要。頻域OCT和FAF為評估VRL的亞臨床視網膜和脈絡膜病變帶來了新的希望。在臨床中通過對眼內標本進行細胞病理學、免疫組織化學染色、流式細胞術、PCR分析以及MYD88 L265P突變檢測的綜合分析，有助于對VRL的診斷。同時IL-10水平及IL-10/IL-6比例可為診斷提供有力支持，可作為對可疑VRL患者進行篩查的工具。隨著對VRL不斷深入的研究及MDS生物信息學的發展，將有機會在分子水平上進一步了解疾病表型和腫瘤對化療藥物的反應，IOL的診斷方法可能出現巨大的變化，同時利用小樣本量液體分析的相關檢查可能推動新的靶向目標治療、監測對治療的反應以及眼內腫瘤的復發，未來為患者制定個性化的治療方法提供臨床依據。