視網膜由多類細胞組成，每類細胞都有著獨特的生物學功能。即使是同類細胞，也會因遺傳異質性導致細胞功能出現差異。以往傳統的研究手段無法分辨這些差異，有些細胞由于缺乏特異性分子標記或數量稀缺也難以定義，阻礙了人們對這些細胞的認識及研究。隨著生物技術的發展，單細胞轉錄組測序技術可以獲得單個細胞轉錄組表達譜、識別細胞間異質性、鑒別細胞亞類及稀有細胞群，揭示每個細胞的轉錄組表達譜特征和功能差異，剖析細胞的起源、功能及變異特征。可獲得與疾病相關的特征性細胞亞類及特異性差異表達基因，加深我們對疾病起因、發展的理解，也為臨床診斷及靶向治療提供幫助。
引用本文： 朱禾, 周翔天, 趙福新. 視網膜單細胞轉錄組測序研究進展. 中華眼底病雜志, 2023, 39(1): 73-77. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220117-00030 復制
細胞是生命活動最基本的單位，每個細胞在特定的時空分裂分化，并與相鄰細胞協調精準發揮生物學功能。同種細胞因存在遺傳異質性，在細胞分裂或分化中呈現不同的基因組、轉錄組及表觀基因修飾組，會產生差異性的生物學功能。以往傳統的基因表達分析是在混合組織多細胞水平層面進行的，獲得的是多個細胞的表達平均信號值，丟失了細胞間異質性信息和特異性變化。常規的細胞分類方法主要根據細胞分子標記、細胞形態及功能等來區分，但這些方法因人為主觀因素而存在爭議；另外有些細胞則因特異性抗體缺乏或數量稀少也無法鑒別。隨著單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）技術的出現，這些問題也迎刃而解。scRNA-seq是指對單個細胞轉錄組進行測序獲得單個細胞的RNA表達譜，可在單細胞水平分析基因表達、細胞內群體異質性、定義細胞類型、識別新細胞亞型及稀有細胞群、辨識細胞狀態和細胞的動態轉變，分析轉錄動態表達譜和基因調控關系。2009年，Tang等[1]首次報道單細胞mRNA轉錄組高通量測序研究并證實方法具有可靠性。隨著各種單細胞測序技術平臺的涌現以及下一代測序儀相繼推出，單細胞測序成本不斷降低，使得scRNA-seq技術在視網膜研究中被廣泛運用[2-4]。現就scRNA-seq在視網膜細胞分類、視網膜分化發育、視網膜疾病中的應用作一綜述，以期為視網膜疾病病因解析及精準化干預治療提供指導。
1 scRNA-seq技術
自2009年Tang等[1]開發出了第一代scRNA-seq技術，目前已經有幾十種不同的scRNA-seq技術相繼被開發[5-10]。目前商業產品最成熟、最為普及的為哈佛大學McCarroll團隊在2015年研發的液滴測序（Drop-Seq）技術平臺，該技術利用微流體裝置將帶有獨特標識（barcode）的微珠和單個細胞一起包裝到微小液滴，可檢測數千個細胞，開啟了高通量scRNA-seq研究的先河[7]。檢測流程簡述如下：（1）對解剖分離的視網膜用蛋白酶（常用消化能力溫和的木瓜蛋白酶）消化獲得單個細胞懸液；（2）通過微流體芯片裝置，單個細胞與帶有獨特標識的微珠和油滴形成油包水液滴；（3）在10× Genomics儀器上對油包水液滴進行消化，釋放出mRNA并逆轉錄合成互補脫氧核糖核酸（cDNA）；（4）cDNA文庫構建；（5）高通量測序儀進行雙端測序；（6）生物信息學分析：細胞質量控制并過濾，降維分析（t-SNE、UMAP），根據細胞特征表達基因進行細胞分類及表達譜分析。一次可成功捕獲細胞約5 000～10 000個，按平均7 500個計算，建庫加測序成本約2元/個細胞。目前國內浙江大學郭國驥團隊開發的Microwell-seq技術可把建庫成本降到約0.07元/個細胞[11-12]。
2 視網膜細胞分類
視網膜結構極其精細且復雜，細胞類型眾多，其各類細胞功能并未完全明確。既往主要通過免疫熒光、電子顯微鏡、電生理等傳統方法依靠細胞分子標記、形態特征、空間位置結構及生物學功能對細胞進行分類[13-15]。視網膜細胞主要被分為視桿細胞（Rod）、視錐細胞（Cone）、水平細胞（HC）、雙極細胞（BC）、無長突細胞（AC）、視網膜神經節細胞（RGC）、Müller細胞7種，且視網膜各種細胞的比例已大致明確[13]。其中BC通過免疫熒光、電生理及細胞膜片鉗技術進一步分成12個亞類[14]，而AC分成伽瑪氨基丁酸能（GABA）、甘氨酸能（Gly）、非GABA非Gly能（nGnG）細胞三類，但還有大量AC未被定義。scRNA-seq技術出現使視網膜細胞精準分類及特征解析變成可能。
2.1 小鼠視網膜細胞分類
目前應用scRNA-seq技術對小鼠的視網膜細胞分類最為詳盡。2015年，Macosko等[7]對小鼠44 808個視網膜細胞進行scRNA-seq，并將視網膜細胞定義為10種主要類型并明確各類細胞比例，包括Rod（65.6%）、Cone（4.2%）、HC（0.6%）、BC（14.0%）、AC（9.9%）、RGC（1.0%）、Müller細胞（3.6%）、小膠質細胞（0.2%）、視網膜內皮細胞（0.6%）及星形膠質細胞（0.1%）。10種細胞依據細胞表達譜特征經t-SNE降維處理進一步定義為38個亞類，這也是當時對視網膜細胞最精確的系統性分類和定義，首次解析了視網膜每類細胞的特征表達譜及每類細胞的準確比例。
BC作為中間神經元，負責把光感覺器視覺信息傳遞給RGC，在信號加工處理傳遞處于關鍵環節。2015年，經scRNA-seq技術BC被分成8個亞類[7]，隨后該團隊利用BC熒光標記進一步把BC分成15個亞類[16]，包括1類ON型視桿BC，6類OFF型視錐BC和8類ON型視錐BC，肯定了以前傳統的分類結果[14]，并鑒定出3個新亞類（BC1重新分為BC1a、BC1b，BC5a-b新定義出BC5c-d兩個亞類）。
AC在視網膜神經遞質分泌、信號加工整合、傳遞過程中發揮重要作用。2015年，研究人員利用scRNA-seq技術把AC分成21個亞類并發現一些新亞類的分子標記（如Maf、Pppp1r17）[7]。Yan等[17]把AC進一步定義為63個亞類，鑒定出一些以前從未報道的新亞類（如Cd140a+ AC、Gad+ GlyT+ AC）并通過原位雜交和免疫熒光予以證實。這些研究首次對AC進行系統地分類并對各類細胞表達譜特征進行了分析，為明確AC亞類在視網膜的功能提供堅實的數據基礎。
RGC負責把BC傳遞過來的信號傳到大腦形成可感知的視覺信號。2018年，Rheaume等[18]把小鼠RGC分成40個亞類；隨后Tran等[19]把小鼠RGC進一步分成46個亞類，細胞分類結果與傳統的電子顯微鏡分類結果（約35個亞類）[20]大體相似，并發現一些新的RGC細胞亞類（如Mmp7+ RGC、Col25a1+ RGC、Calb1+ RGC），RGC作為重要的視覺信號傳導細胞被進一步精確定義和解析。目前隨著單細胞測序數據的增加，小鼠視網膜細胞已被定義出多達128個亞類，其中Rod（1類）、Cone（2類）、HC（1類）、BC（15類）、AC（63類）、RGC（46類）[17]；與以往傳統研究[21-22]相比，BC新定義出3類，AC新定義出33類，RGC新定義出26類。這些數據為后繼的視網膜功能及視覺信號精細調控機制研究提供了有力保證。
2.2 人類視網膜細胞分類
因樣本來源及倫理限制，對人類視網膜細胞定義及表達譜特征解析的研究較少。Lukowski等[23]對三位成年捐獻者視網膜細胞進行scRNA-seq，獲得約2萬個有效細胞并定義為9種細胞類型（與傳統方法分類一致）共16個細胞亞類，包括Rod（首次定義出6個亞類）、HC（3個亞類）、Cone、BC、AC、RGC、Müller細胞、小膠質細胞及星形膠質細胞各1類。Yi等[24]利用scRNA-seq分析成人及嬰兒視網膜，除了定義上述9種類型，另外還鑒定出內皮細胞、周細胞兩種細胞類型。利用scRNA-seq技術，研究者獲得了詳盡的視網膜細胞亞類及每個細胞的表達譜特征，鑒定出一些新亞類及可用的分子標記并經原位雜交及免疫熒光技術等證實，這為后繼視網膜功能及致病機制研究工作提供了良好的基礎數據。
3 視網膜分化發育
解析視網膜分化發育的時空規律對了解視網膜的功能極其重要。有學者對1 174個人類胚胎干細胞來源的RGC培養36 d后進行scRNA-seq，發現3類不同成熟度的細胞亞類，其中一個亞類中與軸突導向、細胞外基質交互及蛋白聚糖相關的基因（如FN1、CTGF、ELN等）表達明顯上調，提示其為一類成熟的RGC，這也為后繼胚胎干細胞定向RGC分化用于治療視神經病變研究提供線索[25]。有研究對16個時間點的人胚胎期到成體期的視網膜和4個發育階段的人視網膜類器官進行scRNA-seq，將捕獲的約12萬個單細胞定義為126個亞類，并首次描繪了人視網膜主要細胞類型發育順序及分化的時空規律，如發現ATOH7可能是調控Cone分化發育的一個關鍵因子[26]。Hu等[27]對人胚胎視網膜及視網膜色素上皮（RPE）進行scRNA-seq分析，解析了視循環和配體-受體互作基因的動態表達譜模式，并發現了與遺傳性視網膜疾病相關的一些致病基因（如USH2A、EYS、CRB1、CLRN1、KCNJ13和KIF11）在胚胎期視網膜表達，這為視網膜遺傳病干預研究提供了重要分子靶點。
利用scRNA-seq技術，Wang等[28]首次繪制了非人靈長類（食蟹猴）視網膜衰老的高精度單細胞轉錄組圖譜，定義了具有特異基因表達特征的15個亞類細胞，并鑒定出一個具有神經發育潛能的Müller細胞亞類。通過差異表達基因（DEG）分析發現，老年食蟹猴視網膜氧化應激反應明顯增加，RPE和脈絡膜細胞炎性反應明顯增強，提示氧化應激及炎癥與視網膜衰老有關。Clark等[29]對小鼠胚胎期14、18 d及出生后2 d三個時間點的視網膜進行scRNA-seq，研究視網膜神經細胞的增生分化過程，發現Nfi轉錄因子家族（Nfia、Nfib、Nfix）主要表達在發育后期的視網膜神經祖細胞上，并決定BC和Müller細胞的命運與增生。
scRNA-seq技術可清晰地剖析視網膜定向發育分化的時空規律、細胞命運決擇及關鍵的調控分子及信號通路，發現視網膜疾病相關的一些特殊細胞類型，這為視網膜疾病的靶點鑒定和視網膜定向修復提供良好的指導。
4 視網膜變性
scRNA-seq技術在視網膜變性疾病已有廣泛應用，并發現一些與視網膜變性相關的DEG及獨特的細胞亞類[23, 30-32]。Lukowski等[23]對三位捐獻者視網膜細胞進行scRNA-seq，發現健康者和視網膜變性患者間的Rod具有明顯的異質性，死亡時間較長的捐獻者視網膜中Rod MALAT1基因（長鏈非編碼RNA）表達喪失，提示MALAT1低表達容易引起Rod死亡，MALAT1可作為維持Rod正常功能的指標分子。Voigt等[30]對1例老年視網膜變性患者和4名正常健康者視網膜進行scRNA-seq，發現視網膜中心凹和外周部的基因表達譜存在明顯差異，并在視網膜變性患者中發現存在一類特殊的膠質細胞（星形膠質細胞和Müller細胞），并呈現神經膠質細胞增生相關的表達譜變化，提示這類膠質細胞與視網膜變性進程有關。
Ronning等[32]利用光誘導建立Arr-/-小鼠視網膜損傷模型并進行視網膜scRNA-seq，其分析發現有4類CD11b+CD5+細胞（小膠質細胞、激活小膠質細胞、單核細胞、巨噬細胞）參與光感受器細胞死亡，提示這類CD11b+CD5+細胞參與光損傷。Yu和Saban[33]則發現小鼠一類獨特的小膠質細胞參與光損傷導致的視網膜變性，這類細胞P2ry12、Tmem119、Siglech基因表達明顯下調，而基因Lgals3、Lpl、Cd68則高表達，提示這些基因與光損傷視網膜變性有關，為后續光損傷干預提供分子靶點。這些人類及小鼠的研究結果均提示膠質細胞與視網膜變性進展有關。通過干預這些靶基因及某類細胞達到治療視網膜變性的目的，如提高MALAT1基因表達可抑制光感受器死亡，干預膠質細胞可能成為視網膜變性治療的一個潛在靶點。
5 老年性黃斑變性（AMD）
AMD目前缺乏有效的治療手段。Voigt等[34]對7個人類捐獻的眼球樣本進行scRNA-seq，發現黃斑區與視網膜外周部RPE的一些基因表達差異顯著，如黃斑區RPE高表達CXCL14（調節免疫細胞遷移和增加血管生成的趨化因子），提示CXCL14引起免疫反應增強可能損傷RPE導致視網膜變性；視網膜外周部RPE有兩個基因（TFPI2、IGFBP5）表達顯著增加，TFPI2在體外可促進RPE增生，而IGFBP5則與新生血管減少有關；通過分析脈絡膜血管細胞的基因特征表達譜及關系樹，發現RGCC基因在AMD患者中高表達，影響內皮細胞補體激活及凋亡。這為研究RPE和脈絡膜基因表達，特別是脈絡膜內皮細胞基因表達提供了豐富的信息。Menon等[35]對3位捐獻者的視網膜進行scRNA-seq，發現人類視網膜膠質細胞比想象中的更具多樣性，并證實幾類細胞（Cone、大膠質細胞、小膠質細胞、血管細胞）與AMD的患病風險顯著相關；此外還發現一些轉錄因子（FOS、FTL、EGR1）與萎縮型或滲出型AMD相關；確定了風險基因（CFI、TIMP3、VEGFA、COL4A3）與AMD的關系，TIMP3主要表達在Müller細胞，提示可通過阻斷血管內皮生長因子受體來抑制視網膜新生血管，從而減少AMD的發生。
Luthert和Kiel[36]開發了一個系統基因本體數據庫，整合文獻中人脈絡膜/RPE及視網膜的scRNA-seq數據，定義出17個細胞亞類并通過蛋白互作分析篩選AMD風險基因；此外通過功能富集分析還發現一些未曾報道的涉及細胞粘附功能的基因（如ADGRL3、CDH6、EMP2、ERC2s）與AMD相關，以及一些新的細胞類型（成纖維細胞、小膠質細胞）也可能參與調控AMD。scRNA-seq技術可充分剖析特定視網膜區域的細胞類型及基因表達譜變化，并重構了黃斑區及脈絡膜細胞的基因表達動態變化，發現一些特異性AMD基因，為解析AMD分子調控機制提供了新的思路，AMD藥物開發提供了新的干預靶點。
6 小結與展望
scRNA-seq技術也存在一些不足。如細胞消化成單細胞懸液時失去原來的空間結構位置，無法剖析并還原細胞在組織上空間異質性特征。空間轉錄組可提供每個細胞在組織上空間信息及組織內的細胞通訊和發育軌跡。通過整合單細胞轉錄組與空間轉錄組學，可產生組織內細胞亞類的高分辨率空間表達圖譜，達到精確分辨細胞及空間定位的目的。當前視網膜研究難點之一是缺乏動物疾病模型情況下，只能使用臨床生物樣本，但很難獲得視網膜活體樣本，極大地限制了對視網膜相關疾病的研究。人源胚胎干細胞及誘導干細胞可誘導分化出視網膜類器官，對這些視網膜類器官進行干預構建相關視網膜疾病模型用于后繼scRNA-seq研究[37-38]，可能是目前較好的代替選擇方案。
視網膜功能及相關疾病的研究一直是本領域的難點，之前由于缺乏能夠有效解析單細胞功能的技術手段而限制了相關領域的深入研究。scRNA-seq為視網膜研究提供了一個全新的技術和機會[39-44]。如通過scRNA-seq發現MALAT1基因與視網膜變性有關[23]，提示MALAT1可作為視網膜退行性疾病治療的新靶點。膠質細胞參與AMD進程和糖尿病視網膜病變（DR），可針對這些膠質細胞進行特異性干預治療，延緩或阻止AMD和DR進展[34-35, 45-46]。目前針對膠質細胞的干預也是治療視網膜變性的一個好的手段[32]。為便于眼部單細胞數據使用，有學者收集并整合了已發表的眼部單細胞轉錄組數據，建立了一個眼部單細胞轉錄組數據庫[47]和眼宏組學數據集[48]，研究者可進行個體化DEG分析、靶基因篩查，尋找眼部疾病早期分子標記及篩選潛在的藥物作用靶點。scRNA-seq技術將有助于視網膜基礎研究向臨床應用轉化，有望為視網膜疾病的診斷及治療提供全新的指導。
細胞是生命活動最基本的單位，每個細胞在特定的時空分裂分化，并與相鄰細胞協調精準發揮生物學功能。同種細胞因存在遺傳異質性，在細胞分裂或分化中呈現不同的基因組、轉錄組及表觀基因修飾組，會產生差異性的生物學功能。以往傳統的基因表達分析是在混合組織多細胞水平層面進行的，獲得的是多個細胞的表達平均信號值，丟失了細胞間異質性信息和特異性變化。常規的細胞分類方法主要根據細胞分子標記、細胞形態及功能等來區分，但這些方法因人為主觀因素而存在爭議；另外有些細胞則因特異性抗體缺乏或數量稀少也無法鑒別。隨著單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）技術的出現，這些問題也迎刃而解。scRNA-seq是指對單個細胞轉錄組進行測序獲得單個細胞的RNA表達譜，可在單細胞水平分析基因表達、細胞內群體異質性、定義細胞類型、識別新細胞亞型及稀有細胞群、辨識細胞狀態和細胞的動態轉變，分析轉錄動態表達譜和基因調控關系。2009年，Tang等[1]首次報道單細胞mRNA轉錄組高通量測序研究并證實方法具有可靠性。隨著各種單細胞測序技術平臺的涌現以及下一代測序儀相繼推出，單細胞測序成本不斷降低，使得scRNA-seq技術在視網膜研究中被廣泛運用[2-4]。現就scRNA-seq在視網膜細胞分類、視網膜分化發育、視網膜疾病中的應用作一綜述，以期為視網膜疾病病因解析及精準化干預治療提供指導。
1 scRNA-seq技術
自2009年Tang等[1]開發出了第一代scRNA-seq技術，目前已經有幾十種不同的scRNA-seq技術相繼被開發[5-10]。目前商業產品最成熟、最為普及的為哈佛大學McCarroll團隊在2015年研發的液滴測序（Drop-Seq）技術平臺，該技術利用微流體裝置將帶有獨特標識（barcode）的微珠和單個細胞一起包裝到微小液滴，可檢測數千個細胞，開啟了高通量scRNA-seq研究的先河[7]。檢測流程簡述如下：（1）對解剖分離的視網膜用蛋白酶（常用消化能力溫和的木瓜蛋白酶）消化獲得單個細胞懸液；（2）通過微流體芯片裝置，單個細胞與帶有獨特標識的微珠和油滴形成油包水液滴；（3）在10× Genomics儀器上對油包水液滴進行消化，釋放出mRNA并逆轉錄合成互補脫氧核糖核酸（cDNA）；（4）cDNA文庫構建；（5）高通量測序儀進行雙端測序；（6）生物信息學分析：細胞質量控制并過濾，降維分析（t-SNE、UMAP），根據細胞特征表達基因進行細胞分類及表達譜分析。一次可成功捕獲細胞約5 000～10 000個，按平均7 500個計算，建庫加測序成本約2元/個細胞。目前國內浙江大學郭國驥團隊開發的Microwell-seq技術可把建庫成本降到約0.07元/個細胞[11-12]。
2 視網膜細胞分類
視網膜結構極其精細且復雜，細胞類型眾多，其各類細胞功能并未完全明確。既往主要通過免疫熒光、電子顯微鏡、電生理等傳統方法依靠細胞分子標記、形態特征、空間位置結構及生物學功能對細胞進行分類[13-15]。視網膜細胞主要被分為視桿細胞（Rod）、視錐細胞（Cone）、水平細胞（HC）、雙極細胞（BC）、無長突細胞（AC）、視網膜神經節細胞（RGC）、Müller細胞7種，且視網膜各種細胞的比例已大致明確[13]。其中BC通過免疫熒光、電生理及細胞膜片鉗技術進一步分成12個亞類[14]，而AC分成伽瑪氨基丁酸能（GABA）、甘氨酸能（Gly）、非GABA非Gly能（nGnG）細胞三類，但還有大量AC未被定義。scRNA-seq技術出現使視網膜細胞精準分類及特征解析變成可能。
2.1 小鼠視網膜細胞分類
目前應用scRNA-seq技術對小鼠的視網膜細胞分類最為詳盡。2015年，Macosko等[7]對小鼠44 808個視網膜細胞進行scRNA-seq，并將視網膜細胞定義為10種主要類型并明確各類細胞比例，包括Rod（65.6%）、Cone（4.2%）、HC（0.6%）、BC（14.0%）、AC（9.9%）、RGC（1.0%）、Müller細胞（3.6%）、小膠質細胞（0.2%）、視網膜內皮細胞（0.6%）及星形膠質細胞（0.1%）。10種細胞依據細胞表達譜特征經t-SNE降維處理進一步定義為38個亞類，這也是當時對視網膜細胞最精確的系統性分類和定義，首次解析了視網膜每類細胞的特征表達譜及每類細胞的準確比例。
BC作為中間神經元，負責把光感覺器視覺信息傳遞給RGC，在信號加工處理傳遞處于關鍵環節。2015年，經scRNA-seq技術BC被分成8個亞類[7]，隨后該團隊利用BC熒光標記進一步把BC分成15個亞類[16]，包括1類ON型視桿BC，6類OFF型視錐BC和8類ON型視錐BC，肯定了以前傳統的分類結果[14]，并鑒定出3個新亞類（BC1重新分為BC1a、BC1b，BC5a-b新定義出BC5c-d兩個亞類）。
AC在視網膜神經遞質分泌、信號加工整合、傳遞過程中發揮重要作用。2015年，研究人員利用scRNA-seq技術把AC分成21個亞類并發現一些新亞類的分子標記（如Maf、Pppp1r17）[7]。Yan等[17]把AC進一步定義為63個亞類，鑒定出一些以前從未報道的新亞類（如Cd140a+ AC、Gad+ GlyT+ AC）并通過原位雜交和免疫熒光予以證實。這些研究首次對AC進行系統地分類并對各類細胞表達譜特征進行了分析，為明確AC亞類在視網膜的功能提供堅實的數據基礎。
RGC負責把BC傳遞過來的信號傳到大腦形成可感知的視覺信號。2018年，Rheaume等[18]把小鼠RGC分成40個亞類；隨后Tran等[19]把小鼠RGC進一步分成46個亞類，細胞分類結果與傳統的電子顯微鏡分類結果（約35個亞類）[20]大體相似，并發現一些新的RGC細胞亞類（如Mmp7+ RGC、Col25a1+ RGC、Calb1+ RGC），RGC作為重要的視覺信號傳導細胞被進一步精確定義和解析。目前隨著單細胞測序數據的增加，小鼠視網膜細胞已被定義出多達128個亞類，其中Rod（1類）、Cone（2類）、HC（1類）、BC（15類）、AC（63類）、RGC（46類）[17]；與以往傳統研究[21-22]相比，BC新定義出3類，AC新定義出33類，RGC新定義出26類。這些數據為后繼的視網膜功能及視覺信號精細調控機制研究提供了有力保證。
2.2 人類視網膜細胞分類
因樣本來源及倫理限制，對人類視網膜細胞定義及表達譜特征解析的研究較少。Lukowski等[23]對三位成年捐獻者視網膜細胞進行scRNA-seq，獲得約2萬個有效細胞并定義為9種細胞類型（與傳統方法分類一致）共16個細胞亞類，包括Rod（首次定義出6個亞類）、HC（3個亞類）、Cone、BC、AC、RGC、Müller細胞、小膠質細胞及星形膠質細胞各1類。Yi等[24]利用scRNA-seq分析成人及嬰兒視網膜，除了定義上述9種類型，另外還鑒定出內皮細胞、周細胞兩種細胞類型。利用scRNA-seq技術，研究者獲得了詳盡的視網膜細胞亞類及每個細胞的表達譜特征，鑒定出一些新亞類及可用的分子標記并經原位雜交及免疫熒光技術等證實，這為后繼視網膜功能及致病機制研究工作提供了良好的基礎數據。
3 視網膜分化發育
解析視網膜分化發育的時空規律對了解視網膜的功能極其重要。有學者對1 174個人類胚胎干細胞來源的RGC培養36 d后進行scRNA-seq，發現3類不同成熟度的細胞亞類，其中一個亞類中與軸突導向、細胞外基質交互及蛋白聚糖相關的基因（如FN1、CTGF、ELN等）表達明顯上調，提示其為一類成熟的RGC，這也為后繼胚胎干細胞定向RGC分化用于治療視神經病變研究提供線索[25]。有研究對16個時間點的人胚胎期到成體期的視網膜和4個發育階段的人視網膜類器官進行scRNA-seq，將捕獲的約12萬個單細胞定義為126個亞類，并首次描繪了人視網膜主要細胞類型發育順序及分化的時空規律，如發現ATOH7可能是調控Cone分化發育的一個關鍵因子[26]。Hu等[27]對人胚胎視網膜及視網膜色素上皮（RPE）進行scRNA-seq分析，解析了視循環和配體-受體互作基因的動態表達譜模式，并發現了與遺傳性視網膜疾病相關的一些致病基因（如USH2A、EYS、CRB1、CLRN1、KCNJ13和KIF11）在胚胎期視網膜表達，這為視網膜遺傳病干預研究提供了重要分子靶點。
利用scRNA-seq技術，Wang等[28]首次繪制了非人靈長類（食蟹猴）視網膜衰老的高精度單細胞轉錄組圖譜，定義了具有特異基因表達特征的15個亞類細胞，并鑒定出一個具有神經發育潛能的Müller細胞亞類。通過差異表達基因（DEG）分析發現，老年食蟹猴視網膜氧化應激反應明顯增加，RPE和脈絡膜細胞炎性反應明顯增強，提示氧化應激及炎癥與視網膜衰老有關。Clark等[29]對小鼠胚胎期14、18 d及出生后2 d三個時間點的視網膜進行scRNA-seq，研究視網膜神經細胞的增生分化過程，發現Nfi轉錄因子家族（Nfia、Nfib、Nfix）主要表達在發育后期的視網膜神經祖細胞上，并決定BC和Müller細胞的命運與增生。
scRNA-seq技術可清晰地剖析視網膜定向發育分化的時空規律、細胞命運決擇及關鍵的調控分子及信號通路，發現視網膜疾病相關的一些特殊細胞類型，這為視網膜疾病的靶點鑒定和視網膜定向修復提供良好的指導。
4 視網膜變性
scRNA-seq技術在視網膜變性疾病已有廣泛應用，并發現一些與視網膜變性相關的DEG及獨特的細胞亞類[23, 30-32]。Lukowski等[23]對三位捐獻者視網膜細胞進行scRNA-seq，發現健康者和視網膜變性患者間的Rod具有明顯的異質性，死亡時間較長的捐獻者視網膜中Rod MALAT1基因（長鏈非編碼RNA）表達喪失，提示MALAT1低表達容易引起Rod死亡，MALAT1可作為維持Rod正常功能的指標分子。Voigt等[30]對1例老年視網膜變性患者和4名正常健康者視網膜進行scRNA-seq，發現視網膜中心凹和外周部的基因表達譜存在明顯差異，并在視網膜變性患者中發現存在一類特殊的膠質細胞（星形膠質細胞和Müller細胞），并呈現神經膠質細胞增生相關的表達譜變化，提示這類膠質細胞與視網膜變性進程有關。
Ronning等[32]利用光誘導建立Arr-/-小鼠視網膜損傷模型并進行視網膜scRNA-seq，其分析發現有4類CD11b+CD5+細胞（小膠質細胞、激活小膠質細胞、單核細胞、巨噬細胞）參與光感受器細胞死亡，提示這類CD11b+CD5+細胞參與光損傷。Yu和Saban[33]則發現小鼠一類獨特的小膠質細胞參與光損傷導致的視網膜變性，這類細胞P2ry12、Tmem119、Siglech基因表達明顯下調，而基因Lgals3、Lpl、Cd68則高表達，提示這些基因與光損傷視網膜變性有關，為后續光損傷干預提供分子靶點。這些人類及小鼠的研究結果均提示膠質細胞與視網膜變性進展有關。通過干預這些靶基因及某類細胞達到治療視網膜變性的目的，如提高MALAT1基因表達可抑制光感受器死亡，干預膠質細胞可能成為視網膜變性治療的一個潛在靶點。
5 老年性黃斑變性（AMD）
AMD目前缺乏有效的治療手段。Voigt等[34]對7個人類捐獻的眼球樣本進行scRNA-seq，發現黃斑區與視網膜外周部RPE的一些基因表達差異顯著，如黃斑區RPE高表達CXCL14（調節免疫細胞遷移和增加血管生成的趨化因子），提示CXCL14引起免疫反應增強可能損傷RPE導致視網膜變性；視網膜外周部RPE有兩個基因（TFPI2、IGFBP5）表達顯著增加，TFPI2在體外可促進RPE增生，而IGFBP5則與新生血管減少有關；通過分析脈絡膜血管細胞的基因特征表達譜及關系樹，發現RGCC基因在AMD患者中高表達，影響內皮細胞補體激活及凋亡。這為研究RPE和脈絡膜基因表達，特別是脈絡膜內皮細胞基因表達提供了豐富的信息。Menon等[35]對3位捐獻者的視網膜進行scRNA-seq，發現人類視網膜膠質細胞比想象中的更具多樣性，并證實幾類細胞（Cone、大膠質細胞、小膠質細胞、血管細胞）與AMD的患病風險顯著相關；此外還發現一些轉錄因子（FOS、FTL、EGR1）與萎縮型或滲出型AMD相關；確定了風險基因（CFI、TIMP3、VEGFA、COL4A3）與AMD的關系，TIMP3主要表達在Müller細胞，提示可通過阻斷血管內皮生長因子受體來抑制視網膜新生血管，從而減少AMD的發生。
Luthert和Kiel[36]開發了一個系統基因本體數據庫，整合文獻中人脈絡膜/RPE及視網膜的scRNA-seq數據，定義出17個細胞亞類并通過蛋白互作分析篩選AMD風險基因；此外通過功能富集分析還發現一些未曾報道的涉及細胞粘附功能的基因（如ADGRL3、CDH6、EMP2、ERC2s）與AMD相關，以及一些新的細胞類型（成纖維細胞、小膠質細胞）也可能參與調控AMD。scRNA-seq技術可充分剖析特定視網膜區域的細胞類型及基因表達譜變化，并重構了黃斑區及脈絡膜細胞的基因表達動態變化，發現一些特異性AMD基因，為解析AMD分子調控機制提供了新的思路，AMD藥物開發提供了新的干預靶點。
6 小結與展望
scRNA-seq技術也存在一些不足。如細胞消化成單細胞懸液時失去原來的空間結構位置，無法剖析并還原細胞在組織上空間異質性特征。空間轉錄組可提供每個細胞在組織上空間信息及組織內的細胞通訊和發育軌跡。通過整合單細胞轉錄組與空間轉錄組學，可產生組織內細胞亞類的高分辨率空間表達圖譜，達到精確分辨細胞及空間定位的目的。當前視網膜研究難點之一是缺乏動物疾病模型情況下，只能使用臨床生物樣本，但很難獲得視網膜活體樣本，極大地限制了對視網膜相關疾病的研究。人源胚胎干細胞及誘導干細胞可誘導分化出視網膜類器官，對這些視網膜類器官進行干預構建相關視網膜疾病模型用于后繼scRNA-seq研究[37-38]，可能是目前較好的代替選擇方案。
視網膜功能及相關疾病的研究一直是本領域的難點，之前由于缺乏能夠有效解析單細胞功能的技術手段而限制了相關領域的深入研究。scRNA-seq為視網膜研究提供了一個全新的技術和機會[39-44]。如通過scRNA-seq發現MALAT1基因與視網膜變性有關[23]，提示MALAT1可作為視網膜退行性疾病治療的新靶點。膠質細胞參與AMD進程和糖尿病視網膜病變（DR），可針對這些膠質細胞進行特異性干預治療，延緩或阻止AMD和DR進展[34-35, 45-46]。目前針對膠質細胞的干預也是治療視網膜變性的一個好的手段[32]。為便于眼部單細胞數據使用，有學者收集并整合了已發表的眼部單細胞轉錄組數據，建立了一個眼部單細胞轉錄組數據庫[47]和眼宏組學數據集[48]，研究者可進行個體化DEG分析、靶基因篩查，尋找眼部疾病早期分子標記及篩選潛在的藥物作用靶點。scRNA-seq技術將有助于視網膜基礎研究向臨床應用轉化，有望為視網膜疾病的診斷及治療提供全新的指導。