引用本文： 潘學良, 王鮮, 李志敏, 楊主敏, 徐濤. 坎地沙坦對早期糖尿病大鼠視網膜中Akt蛋白及其磷酸化位點表達的影響. 中華眼底病雜志, 2015, 31(2): 184-186. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.02.020 復制
Akt作為磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路的主要下游分子，在PI3K或缺氧微環境的刺激下發生磷酸化，其中Thr308位點和Ser473位點的同時磷酸化為Akt活化所必需[1]。PI3K/Akt信號通路在糖尿病(DM)血管內皮炎癥、凋亡、增生調控中起關鍵作用[2]。PI3K/Akt激活劑坎地沙坦以其具有獨立于降低血壓以外的保護作用，已廣泛應用于心腦血管及腎病的治療[3, 4]。但坎地沙坦是否可以通過激活PI3K/Akt信號通路進而參與對視網膜細胞的保護作用尚不清楚。為此，我們對一組早期糖尿病大鼠進行消化道灌注坎地沙坦，觀察其對大鼠視網膜中Akt蛋白及其磷酸化位點Akt Ser473表達的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，坎地沙坦(重慶圣華曦藥業)，羅氏血糖儀(瑞士羅氏公司)，Akt及AktSer473鼠大鼠單克隆抗體(美國Santa公司)。
健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠78只，鼠齡1～2個月，體重180～220 g，無特定病原體級，重慶騰鑫實驗動物中心提供。隨機數字表法將大鼠分為空白對照組、實驗組, 分別為36、42只大鼠。實驗組大鼠按體重40 mg/kg經鼠尾靜脈注射1%STZ制作DM模型；建模后72 h取尾靜脈血，羅氏血糖儀檢測血糖值＞16.7 mmol/L為建模成功。隨機數字表法將空白對照組大鼠分為空白對照組、空白對照+干預組，均為18只大鼠。實驗組剔除未成模及死亡大鼠6只，隨機數字表法將大鼠分為DM組、DM+干預組，均為18只大鼠。建模后3 d，空白對照+干預組、DM+干預組大鼠10 mg/(kg·d)坎地沙坦灌胃, 隔日1次。空白對照組、DM組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。灌胃4、8周處死大鼠，摘除雙眼眼球。左眼球行免疫組織化學染色測定，右眼球行視網膜鋪片、酶組織化學染色檢查。處死前測量大鼠體重及血糖。
制備視網膜石蠟切片，切片厚度5μm。梯度脫蠟和水化后，組織抗原行高溫熱修復；冷卻至常溫后沖洗5 min，3%過氧化氫消除內源性過氧化物酶；磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min，共3次；加入非免疫性動物血清阻斷非特異性結合，20 min后甩去封閉液加一抗，4℃保濕，過夜；PBS洗5 min，共3次，滴加二抗，室溫孵育30 min；PBS洗2 min，共3次，3，3′-二氨基聯苯胺(DAB)顯色，沖洗5 min，蘇木精復染，逐級脫水，透明，中性樹膠封片。每組取18張切片，每張切片取4個視野, 400倍光學顯微鏡下觀察。Akt蛋白、AktSer473陽性表達均為細胞膜呈棕黃色或棕褐色染色。采用HMIAS-2000高清晰彩色病理圖片報告分析系統(武漢千屏公司)測定陽性顆粒的陽性單位值。
視網膜剝離步驟參照文獻[5]的方法。完整游離視網膜組織后，按照絲氨酸/蘇氨酸激酶(ADP)染色方法對視網膜鋪片進行染色，甘油明膠封片。光學顯微鏡下觀察。
采用SPSS 18.0統計軟件對數據行統計學分析處理。所有數據以均數±標準差(
2 結果
免疫組織化學染色結果顯示，建模后4、8周，空白對照組、空白對照組+干預組大鼠視網膜內核層、節細胞層可見大量Akt蛋白、Akt Ser473陽性表達；DM組大鼠視網膜內核層Akt總蛋白及Akt Ser473陽性表達明顯少于空白對照組；與空白對照組比較，DM+干預組大鼠視網膜Akt總蛋白、Akt Ser473陽性表達明顯增多，但仍少于空白對照組(圖 1, 2)。4組間Akt蛋白、AktSer473陽性單位值比較，差異均有統計學意義(P＜0.01)(表 1, 2)。
圖1
各組大鼠視網膜免疫組織化學染色像。1A.空白對照組; 1B.空白對照+干預組; 1C. DM組; 1D. DM+干預組。各組大鼠視網膜組織均可見Akt蛋白表達(白箭)，主要分布在視網膜內核層、節細胞層。空白對照組和空白對照+干預組表達最強，DM組表達最弱，DM+干預組居中DAB×400??圖 2各組大鼠視網膜免疫組織化學染色像。2A.空白對照組; 2B.空白對照+干預組; 2C.DM組; 2D.DM+干預組。各組大鼠視網膜組織均可見Akt Ser473表達(白箭)，主要分布在神經上皮層、內叢狀層、外核層和視網膜色素上皮層。空白對照組和空白對照+干預組表達最強，DM組表達最弱，DM+干預組居中DAB×400
表1
各組大鼠不同時間視網膜Akt蛋白的陽性單位值(
表2
各組大鼠不同時間視網膜Akt Ser473陽性單位值(視網膜鋪片檢查結果顯示，空白對照組、空白對照+干預組大鼠視網膜血管自視盤發出的大血管向四周呈放射狀分布，毛細血管分布均勻。與空白對照組大鼠視網膜比較，4周時，DM組、DM組+干預組大鼠視網膜無明顯變化；8周時，DM組、DM組+干預組大鼠視網膜周邊均可見毛細血管紆曲，形成扭結或血管袢及血管閉塞，但此改變DM組大鼠較DM組+干預組大鼠明顯(圖 3)。
圖3
8周時大鼠視網膜血管鋪片光學顯微鏡像。3A.空白對照組; 3B.空白對照+干預組; 3C.DM組; 3D.DM+干預組。空白對照組、空白對照+干預組視網膜大血管向四周呈放射狀分布，毛細血管分布均勻；DM組、DM組+干預組大鼠視網膜周邊均可見毛細血管紆曲、扭結或閉塞，但改變DM組較DM組+干預組大鼠ADP×40
3 討論
DM患者因為高血糖可導致全身多組織器官微血管病變的發生，其中視網膜病變是其中最為嚴重的并發癥之一。PI3K/Akt信號通路在DM血管內皮炎癥、增生調控中起關鍵作用[2]。Akt作為PI3K信號通路的主要下游分子，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。它在PI3K或缺氧微環境的刺激下發生磷酸化，其中Thr308位點和Ser473位點的同時磷酸化為Akt活化所必需[1]。Akt在DM血管內皮細胞凋亡、增生的調控中起關鍵作用，并且有研究表明PI3K/Akt途徑可參與抑制炎癥反應[6]。研究證明高糖條件下產生的活性氧簇(ROS)可使Akt去磷酸化，抑制Akt激活或加速其滅活，進而抑制其下游eNOS的產生而加速內皮細胞凋亡[7]。
坎地沙坦西酯為二苯四咪唑類血管緊張素Ⅱ受體拮抗藥，臨床用于治療高血壓、心力衰竭、心肌梗死等[8]。目前有研究者認為坎地沙坦治療2型DM輕中度視網膜病變，可延緩視網膜病變進程[9]。并且有研究證明對DM合并高血壓的患者采取嚴格的血糖和血壓控制，可顯著減少DM眼病進展[10]。即使對于血壓正常的患者，降壓治療對視網膜病變也有一定的療效。故本研究進一步探索坎地沙坦作用于糖尿病視網膜病變的機制，以便為坎地沙坦參與對DR的保護作用提供新依據。本研究結果顯示，經坎地沙坦治療后，能明顯使Akt磷酸化位點激活從而激活PI3K/Akt信號通路。該通路是抑制細胞凋亡及炎癥的重要通路，不僅可以上調各種抗凋亡蛋白，還能通過轉錄因子抑制細胞凋亡及炎癥，以達到對視網膜細胞的保護作用，提示坎地沙坦可以通過激活Akt蛋白從而保護DM大鼠視網膜的細胞。
Akt作為磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路的主要下游分子，在PI3K或缺氧微環境的刺激下發生磷酸化，其中Thr308位點和Ser473位點的同時磷酸化為Akt活化所必需[1]。PI3K/Akt信號通路在糖尿病(DM)血管內皮炎癥、凋亡、增生調控中起關鍵作用[2]。PI3K/Akt激活劑坎地沙坦以其具有獨立于降低血壓以外的保護作用，已廣泛應用于心腦血管及腎病的治療[3, 4]。但坎地沙坦是否可以通過激活PI3K/Akt信號通路進而參與對視網膜細胞的保護作用尚不清楚。為此，我們對一組早期糖尿病大鼠進行消化道灌注坎地沙坦，觀察其對大鼠視網膜中Akt蛋白及其磷酸化位點Akt Ser473表達的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，坎地沙坦(重慶圣華曦藥業)，羅氏血糖儀(瑞士羅氏公司)，Akt及AktSer473鼠大鼠單克隆抗體(美國Santa公司)。
健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠78只，鼠齡1～2個月，體重180～220 g，無特定病原體級，重慶騰鑫實驗動物中心提供。隨機數字表法將大鼠分為空白對照組、實驗組, 分別為36、42只大鼠。實驗組大鼠按體重40 mg/kg經鼠尾靜脈注射1%STZ制作DM模型；建模后72 h取尾靜脈血，羅氏血糖儀檢測血糖值＞16.7 mmol/L為建模成功。隨機數字表法將空白對照組大鼠分為空白對照組、空白對照+干預組，均為18只大鼠。實驗組剔除未成模及死亡大鼠6只，隨機數字表法將大鼠分為DM組、DM+干預組，均為18只大鼠。建模后3 d，空白對照+干預組、DM+干預組大鼠10 mg/(kg·d)坎地沙坦灌胃, 隔日1次。空白對照組、DM組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。灌胃4、8周處死大鼠，摘除雙眼眼球。左眼球行免疫組織化學染色測定，右眼球行視網膜鋪片、酶組織化學染色檢查。處死前測量大鼠體重及血糖。
制備視網膜石蠟切片，切片厚度5μm。梯度脫蠟和水化后，組織抗原行高溫熱修復；冷卻至常溫后沖洗5 min，3%過氧化氫消除內源性過氧化物酶；磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min，共3次；加入非免疫性動物血清阻斷非特異性結合，20 min后甩去封閉液加一抗，4℃保濕，過夜；PBS洗5 min，共3次，滴加二抗，室溫孵育30 min；PBS洗2 min，共3次，3，3′-二氨基聯苯胺(DAB)顯色，沖洗5 min，蘇木精復染，逐級脫水，透明，中性樹膠封片。每組取18張切片，每張切片取4個視野, 400倍光學顯微鏡下觀察。Akt蛋白、AktSer473陽性表達均為細胞膜呈棕黃色或棕褐色染色。采用HMIAS-2000高清晰彩色病理圖片報告分析系統(武漢千屏公司)測定陽性顆粒的陽性單位值。
視網膜剝離步驟參照文獻[5]的方法。完整游離視網膜組織后，按照絲氨酸/蘇氨酸激酶(ADP)染色方法對視網膜鋪片進行染色，甘油明膠封片。光學顯微鏡下觀察。
采用SPSS 18.0統計軟件對數據行統計學分析處理。所有數據以均數±標準差(
2 結果
免疫組織化學染色結果顯示，建模后4、8周，空白對照組、空白對照組+干預組大鼠視網膜內核層、節細胞層可見大量Akt蛋白、Akt Ser473陽性表達；DM組大鼠視網膜內核層Akt總蛋白及Akt Ser473陽性表達明顯少于空白對照組；與空白對照組比較，DM+干預組大鼠視網膜Akt總蛋白、Akt Ser473陽性表達明顯增多，但仍少于空白對照組(圖 1, 2)。4組間Akt蛋白、AktSer473陽性單位值比較，差異均有統計學意義(P＜0.01)(表 1, 2)。
圖1
各組大鼠視網膜免疫組織化學染色像。1A.空白對照組; 1B.空白對照+干預組; 1C. DM組; 1D. DM+干預組。各組大鼠視網膜組織均可見Akt蛋白表達(白箭)，主要分布在視網膜內核層、節細胞層。空白對照組和空白對照+干預組表達最強，DM組表達最弱，DM+干預組居中DAB×400??圖 2各組大鼠視網膜免疫組織化學染色像。2A.空白對照組; 2B.空白對照+干預組; 2C.DM組; 2D.DM+干預組。各組大鼠視網膜組織均可見Akt Ser473表達(白箭)，主要分布在神經上皮層、內叢狀層、外核層和視網膜色素上皮層。空白對照組和空白對照+干預組表達最強，DM組表達最弱，DM+干預組居中DAB×400
表1
各組大鼠不同時間視網膜Akt蛋白的陽性單位值(
表2
各組大鼠不同時間視網膜Akt Ser473陽性單位值(視網膜鋪片檢查結果顯示，空白對照組、空白對照+干預組大鼠視網膜血管自視盤發出的大血管向四周呈放射狀分布，毛細血管分布均勻。與空白對照組大鼠視網膜比較，4周時，DM組、DM組+干預組大鼠視網膜無明顯變化；8周時，DM組、DM組+干預組大鼠視網膜周邊均可見毛細血管紆曲，形成扭結或血管袢及血管閉塞，但此改變DM組大鼠較DM組+干預組大鼠明顯(圖 3)。
圖3
8周時大鼠視網膜血管鋪片光學顯微鏡像。3A.空白對照組; 3B.空白對照+干預組; 3C.DM組; 3D.DM+干預組。空白對照組、空白對照+干預組視網膜大血管向四周呈放射狀分布，毛細血管分布均勻；DM組、DM組+干預組大鼠視網膜周邊均可見毛細血管紆曲、扭結或閉塞，但改變DM組較DM組+干預組大鼠ADP×40
3 討論
DM患者因為高血糖可導致全身多組織器官微血管病變的發生，其中視網膜病變是其中最為嚴重的并發癥之一。PI3K/Akt信號通路在DM血管內皮炎癥、增生調控中起關鍵作用[2]。Akt作為PI3K信號通路的主要下游分子，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。它在PI3K或缺氧微環境的刺激下發生磷酸化，其中Thr308位點和Ser473位點的同時磷酸化為Akt活化所必需[1]。Akt在DM血管內皮細胞凋亡、增生的調控中起關鍵作用，并且有研究表明PI3K/Akt途徑可參與抑制炎癥反應[6]。研究證明高糖條件下產生的活性氧簇(ROS)可使Akt去磷酸化，抑制Akt激活或加速其滅活，進而抑制其下游eNOS的產生而加速內皮細胞凋亡[7]。
坎地沙坦西酯為二苯四咪唑類血管緊張素Ⅱ受體拮抗藥，臨床用于治療高血壓、心力衰竭、心肌梗死等[8]。目前有研究者認為坎地沙坦治療2型DM輕中度視網膜病變，可延緩視網膜病變進程[9]。并且有研究證明對DM合并高血壓的患者采取嚴格的血糖和血壓控制，可顯著減少DM眼病進展[10]。即使對于血壓正常的患者，降壓治療對視網膜病變也有一定的療效。故本研究進一步探索坎地沙坦作用于糖尿病視網膜病變的機制，以便為坎地沙坦參與對DR的保護作用提供新依據。本研究結果顯示，經坎地沙坦治療后，能明顯使Akt磷酸化位點激活從而激活PI3K/Akt信號通路。該通路是抑制細胞凋亡及炎癥的重要通路，不僅可以上調各種抗凋亡蛋白，還能通過轉錄因子抑制細胞凋亡及炎癥，以達到對視網膜細胞的保護作用，提示坎地沙坦可以通過激活Akt蛋白從而保護DM大鼠視網膜的細胞。
