引用本文： 周賢慧, 孟旭霞, 付浴東, 劉鵬輝, 胡迭. 不同濃度外源性軸突導向因子-1對糖尿病大鼠視網膜血管通透性的影響. 中華眼底病雜志, 2017, 33(3): 286-289. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.03.015 復制
視網膜血管通透性增加是早期糖尿病（DM）視網膜病變（DR）的顯著表現；降低視網膜血管通透性，抑制新生血管形成是阻止DR的主要手段[1,2]。我們前期研究表明，100 μg/ml的軸突導向因子（netrin）-1能降低視網膜血管通透性，抑制DR進展[3]。另有研究發現，不同濃度外源性netrin-1對新生血管的形成具有雙重作用[4]。視網膜閉合蛋白（occludin）是構成緊密連接的跨膜蛋白，能與內皮細胞緊密連接的復合物相互作用，發揮調控細胞外滲透的作用[5]。而血視網膜屏障的破壞是通過打開內皮細胞間的緊密連接來實現的[6]，這提示occludin可作為觀察視網膜血管通透性變化的研究對象。為了尋找新的降低DR血管通透性的方法并進一步確定合適的外源性netrin-1濃度，本研究觀察了不同濃度外源性netrin-1對DM大鼠視網膜occludin表達以及視網膜血管通透性的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康清潔級8～12周齡雄性Sprague-Dawley大鼠80只，體重約250 g，由山東魯抗醫藥公司提供。所有動物的飼養及管理均符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。
采用隨機數字表法將80只大鼠隨機分為正常對照組（A組）、正常＋平衡鹽溶液（BSS）組（B組）、正常＋netrin-1 500 μg/ml組（C組）、DM＋BSS組（D組）、DM＋netrin-1 10 μg/ml組（E組）、DM＋netrin-1 50 μg/ml組（F組）、DM＋netrin-1 100 μg/ml組（G組）、DM＋netrin-1 500 μg/ml組（H組），每組10只。E～H組大鼠按60 mg/kg的劑量，左下腹腔注射鏈脲佐菌素誘導DM動物模型。以注射48 h后空腹血糖≥16.5 mmol/L為DM模型建立成功[7]。建模成功率為83.3%。剔除建模失敗大鼠后，再補充大鼠進行DM建模，確保各組最終大鼠數量為10只。建模3個月后，E～H組大鼠玻璃體腔分別注射10、50、100、500 μg/ml netrin-1 5 μl。C組大鼠玻璃體腔注射500 μg/ml netrin-1 5 μl。B、D組大鼠玻璃體腔注射等體積BSS。A組大鼠不做任何處理。所有注射大鼠均未出現與注射相關的高眼壓及鞏膜口漏等并發癥。
玻璃體腔注射netrin-1后1個月，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，按45 mg/kg的劑量尾靜脈注射伊凡斯藍（EB）；循環2 h，打開胸腔，左心室插管，右心耳灌注多聚甲醛2 min，速度66 ml/min。灌注結束后，迅速取出眼球，剝離視網膜，干燥后稱重。每個視網膜加甲酰胺 0.3 ml，70℃水浴箱孵育18 h；4℃條件下離心45 min，取上清液100 μl。分光光度計分別測量在620、740 nm處吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值，并計算其差值。差值×1000=凈A值。每一樣本測量3次，取平均值。視網膜EB滲出量=[視網膜EB量（mg）/視網膜干重（g）]/[單位時間內血漿EB量（mg）/血漿體積（μl）×循環時間（h）]，結果以ng/mg表示。以視網膜EB滲出量表示視網膜血管通透性。以平均積分A值表示視網膜occludin的蛋白表達量。
采用免疫組織化學染色法觀察大鼠視網膜occludin的陽性染色情況。玻璃體腔注射netrin-1后1個月，過量麻醉處死大鼠，摘取眼球，制備石蠟切片。石蠟切片脫蠟至水，5%山羊血清封閉后，一抗用1:200兔抗大鼠occludin多克隆抗體，二抗用生物素標記山羊抗兔IgG抗體，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察并照相，以血管內皮細胞膜呈棕黃色為陽性表達。采用Image Pro Plus 6.0軟件對圖像進行分析。
采用熒光定量聚合酶鏈反應檢測大鼠視網膜occludin mRNA表達。玻璃體腔注射netrin-1后1個月，過量麻醉處死大鼠。視網膜稱重，按照每50～l00 mg加1 ml RNAiso Plus裂解視網膜，提取視網膜總RNA，逆轉錄成cDNA，以β-肌動蛋白（β-actin）作為內參照，用occludin引物SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法擴增相應基因。Occludin：上游引物5′-CCTGTCTATGCTCGTCATCG-3′，下游引物5′-TAGCCGTAACCGTAGCCGTA-3′；β-actin：上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。退火溫度60℃，40個循環后形成擴增曲線，記錄熒光值到達閾值時所經歷的循環閾值。將A組大鼠視網膜occludin mRNA表達設定為1，計算其他各組大鼠視網膜occludin mRNA表達。
采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析，定量資料結果以均數±標準差（ ）表示。本研究測量數據經檢驗均符合正態分布，均數經Levene檢驗呈方差齊性。兩獨立樣本間比較采用獨立樣本t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析；兩變量間關系分析采用相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
A～C組大鼠視網膜occludin陽性表達主要位于神經纖維層、神經節細胞層、內叢狀層及內核層（圖1A，1B）。D組大鼠視網膜occludin陽性表達主要位于視網膜血管周圍，表達量少，陽性染色淺。E～H組大鼠視網膜occludin陽性表達主要位于視網膜血管周圍，并隨著外源性netrin-1濃度的升高而增加（圖1C～1G）。
與A組比較，D組大鼠視網膜occludin陽性表達（t=27.71，P=0.00）、mRNA表達（t=8.59，P=0.00）減少，差異有統計學意義。D～H組大鼠視網膜occludin陽性表達（F=146.31，P=0.00）、mRNA表達（F=16.54，P=0.00）比較，差異有統計學意義。B、C組大鼠視網膜occludin陽性表達（t=?1.13，P=0.27）、mRNA表達（t=0.93，P=0.36）比較，差異無統計學意義（表1）。相關性分析結果顯示，隨著外源性netrin-1濃度升高，大鼠視網膜occludin陽性表達、mRNA表達升高；大鼠視網膜occludin mRNA表達（r=0.73，P=0.00）、mRNA表達（r=0.81，P=0.00）均與外源性netrin-1濃度呈正相關。
與A組比較，D組大鼠視網膜血管通透性增加，差異有統計學意義（t=?42.72，P=0.00）。D～H組大鼠視網膜血管通透性比較，差異有統計學意義（F=67.77，P=0.00）。B、C組大鼠視網膜血管通透性比較，差異無統計學意義（t=1.04，P=0.31）（表1）。相關性分析結果顯示，外源性netrin-1濃度越高，大鼠視網膜血管通透性越低，兩者呈負相關（r=?0.61，P=0.00）。
表1
各組大鼠視網膜occludin陽性表達、mRNA表達及視網膜血管通透性比較（
）
3 討論
Netrin-1能介導軸突的生長和延長。最近研究發現，netrin-1在血管的發生過程中也發揮重要作用[8,9]。Zhang等[10]和Liu等[11]發現，DM大鼠視網膜netrin-1表達增多，認為netrin-1在DR進展中起重要作用。而Tu等[12]發現，netrin-1對視網膜血管具有雙重作用；濃度＜200 ng/ml的低劑量netrin-1可與CD146受體結合，促進血管生成；濃度高于2000 ng/ml的高劑量netrin-1可與非協調性分子5同源蛋白B結合，抑制血管生成。本研究結果顯示，大鼠玻璃體腔注射netrin-1后視網膜occludin表達量增高，視網膜血管通透性降低，且其變化趨勢與netrin-1濃度變化有關。由此我們認為，netrin-1對DM大鼠視網膜血管具有保護作用，其該作用可能是通過保護occludin，抑制其表達降低來實現的；并且，外源性netrin-1濃度越高，對視網膜血管的保護作用可能越顯著。
我們前期實驗研究發現，100 μg/ml外源性netrin-1可降低DM大鼠視網膜血管通透性[3]。基于此，本研究對DM大鼠玻璃體腔注射不同濃度外源性netrin-1，以探討netrin-1作用的臨界濃度。結果顯示，E～H組大鼠視網膜occludin的表達逐漸增加，視網膜血管通透性逐漸下降，并且呈現濃度相關性。該結果與Tu等[12]報道結果不一致，且并未得到預期實驗結果。我們分析這可能與以下幾個因素有關：（1）玻璃體腔注射有效濃度誤差較大。本實驗研究屬于體內實驗，玻璃體腔注射netrin-1的量可能存在一定誤差，并且體內實驗相對于細胞培養敏感性差。（2）實驗中玻璃體腔注射的外源性netrin-1的濃度級數不夠，需要進一步擴大實驗樣本量。（3）DM時視網膜netrin-1表達增多[10]；而外源性加入netin-1后是否有可能引發負反饋機制尚需要進一步實驗支持。
本研究結果表明，外源性netrin-1可降低DM大鼠視網膜血管通透性，并且該作用與外源性netrin-1濃度有關，其對視網膜血管的保護作用可能是通過保護occludin來實現的。但關于netrin-1降低DM大鼠視網膜血管通透性的有效濃度范圍以及netrin-1保護occludin的具體機制還不明確，有待進一步實驗加以探討分析。
志謝 感謝煙臺市業達醫院劉曉玲醫師對文稿撰寫提供的幫助
視網膜血管通透性增加是早期糖尿病（DM）視網膜病變（DR）的顯著表現；降低視網膜血管通透性，抑制新生血管形成是阻止DR的主要手段[1,2]。我們前期研究表明，100 μg/ml的軸突導向因子（netrin）-1能降低視網膜血管通透性，抑制DR進展[3]。另有研究發現，不同濃度外源性netrin-1對新生血管的形成具有雙重作用[4]。視網膜閉合蛋白（occludin）是構成緊密連接的跨膜蛋白，能與內皮細胞緊密連接的復合物相互作用，發揮調控細胞外滲透的作用[5]。而血視網膜屏障的破壞是通過打開內皮細胞間的緊密連接來實現的[6]，這提示occludin可作為觀察視網膜血管通透性變化的研究對象。為了尋找新的降低DR血管通透性的方法并進一步確定合適的外源性netrin-1濃度，本研究觀察了不同濃度外源性netrin-1對DM大鼠視網膜occludin表達以及視網膜血管通透性的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康清潔級8～12周齡雄性Sprague-Dawley大鼠80只，體重約250 g，由山東魯抗醫藥公司提供。所有動物的飼養及管理均符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。
采用隨機數字表法將80只大鼠隨機分為正常對照組（A組）、正常＋平衡鹽溶液（BSS）組（B組）、正常＋netrin-1 500 μg/ml組（C組）、DM＋BSS組（D組）、DM＋netrin-1 10 μg/ml組（E組）、DM＋netrin-1 50 μg/ml組（F組）、DM＋netrin-1 100 μg/ml組（G組）、DM＋netrin-1 500 μg/ml組（H組），每組10只。E～H組大鼠按60 mg/kg的劑量，左下腹腔注射鏈脲佐菌素誘導DM動物模型。以注射48 h后空腹血糖≥16.5 mmol/L為DM模型建立成功[7]。建模成功率為83.3%。剔除建模失敗大鼠后，再補充大鼠進行DM建模，確保各組最終大鼠數量為10只。建模3個月后，E～H組大鼠玻璃體腔分別注射10、50、100、500 μg/ml netrin-1 5 μl。C組大鼠玻璃體腔注射500 μg/ml netrin-1 5 μl。B、D組大鼠玻璃體腔注射等體積BSS。A組大鼠不做任何處理。所有注射大鼠均未出現與注射相關的高眼壓及鞏膜口漏等并發癥。
玻璃體腔注射netrin-1后1個月，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，按45 mg/kg的劑量尾靜脈注射伊凡斯藍（EB）；循環2 h，打開胸腔，左心室插管，右心耳灌注多聚甲醛2 min，速度66 ml/min。灌注結束后，迅速取出眼球，剝離視網膜，干燥后稱重。每個視網膜加甲酰胺 0.3 ml，70℃水浴箱孵育18 h；4℃條件下離心45 min，取上清液100 μl。分光光度計分別測量在620、740 nm處吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值，并計算其差值。差值×1000=凈A值。每一樣本測量3次，取平均值。視網膜EB滲出量=[視網膜EB量（mg）/視網膜干重（g）]/[單位時間內血漿EB量（mg）/血漿體積（μl）×循環時間（h）]，結果以ng/mg表示。以視網膜EB滲出量表示視網膜血管通透性。以平均積分A值表示視網膜occludin的蛋白表達量。
采用免疫組織化學染色法觀察大鼠視網膜occludin的陽性染色情況。玻璃體腔注射netrin-1后1個月，過量麻醉處死大鼠，摘取眼球，制備石蠟切片。石蠟切片脫蠟至水，5%山羊血清封閉后，一抗用1:200兔抗大鼠occludin多克隆抗體，二抗用生物素標記山羊抗兔IgG抗體，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察并照相，以血管內皮細胞膜呈棕黃色為陽性表達。采用Image Pro Plus 6.0軟件對圖像進行分析。
采用熒光定量聚合酶鏈反應檢測大鼠視網膜occludin mRNA表達。玻璃體腔注射netrin-1后1個月，過量麻醉處死大鼠。視網膜稱重，按照每50～l00 mg加1 ml RNAiso Plus裂解視網膜，提取視網膜總RNA，逆轉錄成cDNA，以β-肌動蛋白（β-actin）作為內參照，用occludin引物SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法擴增相應基因。Occludin：上游引物5′-CCTGTCTATGCTCGTCATCG-3′，下游引物5′-TAGCCGTAACCGTAGCCGTA-3′；β-actin：上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。退火溫度60℃，40個循環后形成擴增曲線，記錄熒光值到達閾值時所經歷的循環閾值。將A組大鼠視網膜occludin mRNA表達設定為1，計算其他各組大鼠視網膜occludin mRNA表達。
采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析，定量資料結果以均數±標準差（ ）表示。本研究測量數據經檢驗均符合正態分布，均數經Levene檢驗呈方差齊性。兩獨立樣本間比較采用獨立樣本t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析；兩變量間關系分析采用相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
A～C組大鼠視網膜occludin陽性表達主要位于神經纖維層、神經節細胞層、內叢狀層及內核層（圖1A，1B）。D組大鼠視網膜occludin陽性表達主要位于視網膜血管周圍，表達量少，陽性染色淺。E～H組大鼠視網膜occludin陽性表達主要位于視網膜血管周圍，并隨著外源性netrin-1濃度的升高而增加（圖1C～1G）。
與A組比較，D組大鼠視網膜occludin陽性表達（t=27.71，P=0.00）、mRNA表達（t=8.59，P=0.00）減少，差異有統計學意義。D～H組大鼠視網膜occludin陽性表達（F=146.31，P=0.00）、mRNA表達（F=16.54，P=0.00）比較，差異有統計學意義。B、C組大鼠視網膜occludin陽性表達（t=?1.13，P=0.27）、mRNA表達（t=0.93，P=0.36）比較，差異無統計學意義（表1）。相關性分析結果顯示，隨著外源性netrin-1濃度升高，大鼠視網膜occludin陽性表達、mRNA表達升高；大鼠視網膜occludin mRNA表達（r=0.73，P=0.00）、mRNA表達（r=0.81，P=0.00）均與外源性netrin-1濃度呈正相關。
與A組比較，D組大鼠視網膜血管通透性增加，差異有統計學意義（t=?42.72，P=0.00）。D～H組大鼠視網膜血管通透性比較，差異有統計學意義（F=67.77，P=0.00）。B、C組大鼠視網膜血管通透性比較，差異無統計學意義（t=1.04，P=0.31）（表1）。相關性分析結果顯示，外源性netrin-1濃度越高，大鼠視網膜血管通透性越低，兩者呈負相關（r=?0.61，P=0.00）。
表1
各組大鼠視網膜occludin陽性表達、mRNA表達及視網膜血管通透性比較（
）
3 討論
Netrin-1能介導軸突的生長和延長。最近研究發現，netrin-1在血管的發生過程中也發揮重要作用[8,9]。Zhang等[10]和Liu等[11]發現，DM大鼠視網膜netrin-1表達增多，認為netrin-1在DR進展中起重要作用。而Tu等[12]發現，netrin-1對視網膜血管具有雙重作用；濃度＜200 ng/ml的低劑量netrin-1可與CD146受體結合，促進血管生成；濃度高于2000 ng/ml的高劑量netrin-1可與非協調性分子5同源蛋白B結合，抑制血管生成。本研究結果顯示，大鼠玻璃體腔注射netrin-1后視網膜occludin表達量增高，視網膜血管通透性降低，且其變化趨勢與netrin-1濃度變化有關。由此我們認為，netrin-1對DM大鼠視網膜血管具有保護作用，其該作用可能是通過保護occludin，抑制其表達降低來實現的；并且，外源性netrin-1濃度越高，對視網膜血管的保護作用可能越顯著。
我們前期實驗研究發現，100 μg/ml外源性netrin-1可降低DM大鼠視網膜血管通透性[3]。基于此，本研究對DM大鼠玻璃體腔注射不同濃度外源性netrin-1，以探討netrin-1作用的臨界濃度。結果顯示，E～H組大鼠視網膜occludin的表達逐漸增加，視網膜血管通透性逐漸下降，并且呈現濃度相關性。該結果與Tu等[12]報道結果不一致，且并未得到預期實驗結果。我們分析這可能與以下幾個因素有關：（1）玻璃體腔注射有效濃度誤差較大。本實驗研究屬于體內實驗，玻璃體腔注射netrin-1的量可能存在一定誤差，并且體內實驗相對于細胞培養敏感性差。（2）實驗中玻璃體腔注射的外源性netrin-1的濃度級數不夠，需要進一步擴大實驗樣本量。（3）DM時視網膜netrin-1表達增多[10]；而外源性加入netin-1后是否有可能引發負反饋機制尚需要進一步實驗支持。
本研究結果表明，外源性netrin-1可降低DM大鼠視網膜血管通透性，并且該作用與外源性netrin-1濃度有關，其對視網膜血管的保護作用可能是通過保護occludin來實現的。但關于netrin-1降低DM大鼠視網膜血管通透性的有效濃度范圍以及netrin-1保護occludin的具體機制還不明確，有待進一步實驗加以探討分析。
志謝 感謝煙臺市業達醫院劉曉玲醫師對文稿撰寫提供的幫助
