引用本文： 殷曉雯, 邵珺, 鄒健, 謝田華, 姚勇. 糖尿病視網膜病變患者血漿miR-1470表達變化及可能機制探討. 中華眼底病雜志, 2018, 34(4): 348-351. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.04.008 復制
miRNA在糖尿病視網膜病變（DR）的發生發展中起著至關重要的作用[1-6]。我們的前期研究通過基因芯片、逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測發現，DR患者、糖尿病患者及正常受檢者血漿中最具表達差異的miRNA之一miR-1470在DR患者中的表達量明顯低于糖尿病患者及正常受檢者[6]。表皮生長因子受體（EGFR）是一種重要的跨膜受體，被配體激活后啟動胞內信號傳導，指導細胞遷移、粘附、增生、分化、凋亡且與腫瘤的形成和惡化密切相關[7, 8]。盡管目前miR-1470、EGFR與DR的相關性研究甚少，但通過上述研究結果我們推測兩者可能與DR新生血管的發生發展有著密切關系。為此，我們對一組DR患者、糖尿病患者及正常受檢者血漿中miR-1470的表達進行了檢測，并探討EGFR在其表達變化中可能的作用。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性分析。隨機抽取2016年3～6月在南京醫科大學附屬無錫人民醫院眼科住院治療的30例DR患者（DR組）以及在眼科門診檢查的30例糖尿病患者（DM組）[6]納入本研究。DM組患者均符合世界衛生組織制定的糖尿病診斷標準[11]。DR組患者經裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡及熒光素眼底血管造影檢查明確其符合DR臨床診斷標準[12]。
DM組患者中，男性15例，女性15例；年齡18～90歲，平均年齡（53.6±16.8）歲。糖尿病病程10～30年，平均糖尿病病程（17.2±11.4）年。DR組患者中，男性15例，女性15例；年齡42～81歲，平均年齡（64.7±11.2）歲。糖尿病病程10～30年，平均糖尿病病程（18.2±11.1）年。選擇同期在眼科門診常規檢查的健康者30名作為正常組。其中，男性15名，女性15名；年齡28～78歲，平均年齡（63.5±13.2）歲。
經本院倫理委員會審批并獲取所有受檢者的知情同意后，抽取受檢者靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝，4 ℃條件下以離心半徑15～20 cm、3000 r/min離心15 min，提取血漿置于?80 ℃冰箱備用。采用改良異硫氰酸肌法（Trizol）提取血漿總RNA，用NanoDrop2000紫外分光光度計（美國Thermo Scientific公司）分析RNA純度和濃度。選取純度值為1.8～2.1的樣本。通過PubMed數據庫進行信息檢索，每組隨機選取10個樣本并結合差異倍數較大的原則選取miR-1470，采用LightCycler 1.5定量PCR儀（瑞士Roche公司）行實時RT-PCR，驗證基因芯片檢測結果。
選取差異表達的miR-1470，按照RT-PCR定量試劑盒（康為世紀生物科技有限公司）說明書，以U6為內參，將miRNA逆轉錄成cDNA，然后進行實時熒光定量檢測。miR-1470的PCR引物及逆轉錄引物購自天根生化科技（北京）有限公司。每例樣本均做3個復孔，Ct值取3次平均值。△Ct樣品=Ct樣品－CtU6，△△Ct樣品=△Ct樣品－△Ct校正樣品，以2－△△Ct樣品表示每個miRNA的相對表達比率，即樣品的miRNA表達量表示成校正樣品的2－△△Ct樣品倍。2－△△Ct樣品＞2為表達增強，2－△△Ct樣品＜0.5為表達減弱。匯總Mirnada、Mmirbase、Targetscan數據庫中已知miRNA靶點信息，將三種數據庫的結果交集作為最終miRNA的靶基因結果，同時結合已發現的與DR相關的基因，對靶基因進行功能分析，確定EGFR可能是miR-1470調控的潛在靶基因。
將人視網膜內皮細胞（hREC，上海拜力生物科技有限公司）分為正常組（糖濃度5.5 mmol/L）、高糖組（糖濃度25.0 mmol/L），均置于含10%胎牛血漿和2%青霉素、鏈霉素溶液雙抗的Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM），37℃、5% CO2培養箱中培養。取對數生長期高糖組hREC進行細胞轉染，按siRNA oligo（吉瑪基因）說明書的方法將miR-1470模擬物、模擬物對照分別轉染到hREC中。miR-1470模擬物序列：5’-GCCCUCCGCCCGUGCACCCCGGGGUGCACGGGCGGAGGGCUU-3’；模擬物對照：正向引物：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，反向引物：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。轉染前1 d收集對數生長期細胞接種于6孔板，將miR-1470模擬物和模擬物對照分別轉染細胞8 h，用熒光倒置顯微鏡檢測轉染效率。轉染效率達80%時以磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入含10%胎牛血漿的DMEM高糖培養液（美國Hyclone公司）繼續培養24 h用于后續實驗。
將hREC分為空白對照組（即高糖組）、高表達組及陰性對照組。空白對照組hREC不作任何處理；高表達組hREC轉染miR-1470模擬物；陰性對照組hREC轉染模擬物對照。細胞轉染24 h后，Trizol法提取細胞總RNA，分光光度計測定總RNA的純度。
細胞轉染72 h后，提取細胞總蛋白，采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測EGFR蛋白的表達。應用Image J圖像分析系統對蛋白灰度值進行分析。以EGFR蛋白灰度值/β-肌動蛋白（β-actin）灰度值為目標蛋白的相對表達量。
采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。兩組間計量資料比較采用獨立樣本t檢驗；多組間計量資料比較采用方差分析，組間計量資料兩兩比較采用多重比較，即q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
RT-PCR驗證結果與基因芯片檢測結果相符。DR組患者血漿中miR-1470表達是正常組的（0.33±0.02）倍，是DM組的（0.42±0.04）倍。三組受檢者血漿中miR-1470表達比較，差異有統計學意義（F=63.486，P=0.049）。多重比較結果顯示，與DM組和正常組比較，DR組患者血漿中miR-1470表達明顯減弱，差異有統計學意義（q=111.2、73.9，P＜0.05）。與正常組比較，DM組患者血漿中miR-1470表達有所減弱，但差異無統計學意義（q=37.2，P＞0.05）。
RT-PCR檢測結果顯示，高糖組hREC中miR-1470表達明顯低于正常組，差異有統計學意義（t=42.082，P=0.015）（圖1A）。Western blot檢測結果顯示，高糖組hREC中EGFR蛋白表達明顯高于正常組，差異有統計學意義（t=?39.939，P=0.0.16）（圖1B）。
圖1
正常組及高糖組hREC中miR-1470表達及EGFR蛋白表達比較。1A.miR-1470表達；1B.EGFR蛋白表達。* P＜0.05
RT-PCR檢測結果顯示，空白對照組、陰性對照組、高表達組hREC中miR-1470表達比較，差異有統計學意義（F=637.069，P=0.000）。與空白對照組、陰性對照組比較，高表達組hREC中miR-1470表達明顯升高，差異有統計學意義（q=329.7、328.8，P＜0.05）（圖2A）。陰性對照組與空白對照組hREC中miR-1470表達比較，差異無統計學意義（q=1.5，P＞0.05）。Western blot檢測結果顯示，空白對照組、陰性對照組、高表達組hREC中EGFR蛋白表達比較，差異有統計學意義（F=122.908，P=0.000）。與空白對照組、陰性對照組比較，高表達組hREC中EGFR蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（q=242.5、234.6，P＜0.05）, （圖2B）。陰性對照組與空白對照組hREC中EGFR蛋白表達比較，差異無統計學意義（q=7.9，P＞0.05）。
圖2
空白對照組、陰性對照組、高表達組hREC中miR-1470表達及EGFR蛋白表達比較。2A.miR-1470表達；2B.EGFR蛋白表達。*P＜0.05
3 討論
目前miRNA作為治療靶標的潛力已引起人們廣泛關注。我們前期研究的基因芯片檢測結果顯示，DR組miR-1470表達較DM組下調7.95倍，較正常組下調12.31倍[6]。由于miR-1470在DR中的差異表達比較明顯，才引起了本研究團隊的注意。本研究結果顯示，DR患者血漿中miR-1470明顯降低，并且在細胞水平也證明高糖組hREC中miR-1470表達明顯低于正常組。此實驗結果是我們后續研究的基礎。
此前我們匯總Mirnada、Mmirbase、Targetscan數據庫中已知miRNA靶點信息，將三種數據庫的結果交集作為最終miR-1470的靶基因結果，同時結合已發現的與DR相關的基因，對靶基因進行功能分析，確定EGFR可能是miR-1470調控的潛在靶基因。而后我們發現高糖組hREC中EGFR蛋白表達明顯高于正常組，說明miR-1470與EGFR的表達呈負相關。為了驗證兩者之間的關系，我們在hREC中高表達miR-1470并觀察EGFR的表達。Western blot檢測結果顯示，miR-1470高表達組EGFR蛋白表達明顯降低。此結果與我們的假設相符，即miR-1470能抑制EGFR的表達。
有研究發現，miRNA能通過靶向抑制EGFR表達減弱人非小細胞肺癌的增生和侵襲能力[13]。也有研究發現，miRNA靶向沉默EGFR抑制大鼠星形膠質細胞活化[14]。因此，我們猜測miR-1470或許能通過下調EGFR表達來抑制hREC的增生和遷移能力，從而阻止新生血管的發生，但這還需要進一步實驗研究加以驗證。我們后續研究首先會在細胞水平驗證miR-1470的功能，探索其對hREC遷移、增生和凋亡的作用；其次利用熒光素酶報告基因實驗驗證EGFR是否為miR-1470的靶基因；最后根據結果進一步在信號通路上加以機制的深究。
miRNA在糖尿病視網膜病變（DR）的發生發展中起著至關重要的作用[1-6]。我們的前期研究通過基因芯片、逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測發現，DR患者、糖尿病患者及正常受檢者血漿中最具表達差異的miRNA之一miR-1470在DR患者中的表達量明顯低于糖尿病患者及正常受檢者[6]。表皮生長因子受體（EGFR）是一種重要的跨膜受體，被配體激活后啟動胞內信號傳導，指導細胞遷移、粘附、增生、分化、凋亡且與腫瘤的形成和惡化密切相關[7, 8]。盡管目前miR-1470、EGFR與DR的相關性研究甚少，但通過上述研究結果我們推測兩者可能與DR新生血管的發生發展有著密切關系。為此，我們對一組DR患者、糖尿病患者及正常受檢者血漿中miR-1470的表達進行了檢測，并探討EGFR在其表達變化中可能的作用。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性分析。隨機抽取2016年3～6月在南京醫科大學附屬無錫人民醫院眼科住院治療的30例DR患者（DR組）以及在眼科門診檢查的30例糖尿病患者（DM組）[6]納入本研究。DM組患者均符合世界衛生組織制定的糖尿病診斷標準[11]。DR組患者經裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡及熒光素眼底血管造影檢查明確其符合DR臨床診斷標準[12]。
DM組患者中，男性15例，女性15例；年齡18～90歲，平均年齡（53.6±16.8）歲。糖尿病病程10～30年，平均糖尿病病程（17.2±11.4）年。DR組患者中，男性15例，女性15例；年齡42～81歲，平均年齡（64.7±11.2）歲。糖尿病病程10～30年，平均糖尿病病程（18.2±11.1）年。選擇同期在眼科門診常規檢查的健康者30名作為正常組。其中，男性15名，女性15名；年齡28～78歲，平均年齡（63.5±13.2）歲。
經本院倫理委員會審批并獲取所有受檢者的知情同意后，抽取受檢者靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝，4 ℃條件下以離心半徑15～20 cm、3000 r/min離心15 min，提取血漿置于?80 ℃冰箱備用。采用改良異硫氰酸肌法（Trizol）提取血漿總RNA，用NanoDrop2000紫外分光光度計（美國Thermo Scientific公司）分析RNA純度和濃度。選取純度值為1.8～2.1的樣本。通過PubMed數據庫進行信息檢索，每組隨機選取10個樣本并結合差異倍數較大的原則選取miR-1470，采用LightCycler 1.5定量PCR儀（瑞士Roche公司）行實時RT-PCR，驗證基因芯片檢測結果。
選取差異表達的miR-1470，按照RT-PCR定量試劑盒（康為世紀生物科技有限公司）說明書，以U6為內參，將miRNA逆轉錄成cDNA，然后進行實時熒光定量檢測。miR-1470的PCR引物及逆轉錄引物購自天根生化科技（北京）有限公司。每例樣本均做3個復孔，Ct值取3次平均值。△Ct樣品=Ct樣品－CtU6，△△Ct樣品=△Ct樣品－△Ct校正樣品，以2－△△Ct樣品表示每個miRNA的相對表達比率，即樣品的miRNA表達量表示成校正樣品的2－△△Ct樣品倍。2－△△Ct樣品＞2為表達增強，2－△△Ct樣品＜0.5為表達減弱。匯總Mirnada、Mmirbase、Targetscan數據庫中已知miRNA靶點信息，將三種數據庫的結果交集作為最終miRNA的靶基因結果，同時結合已發現的與DR相關的基因，對靶基因進行功能分析，確定EGFR可能是miR-1470調控的潛在靶基因。
將人視網膜內皮細胞（hREC，上海拜力生物科技有限公司）分為正常組（糖濃度5.5 mmol/L）、高糖組（糖濃度25.0 mmol/L），均置于含10%胎牛血漿和2%青霉素、鏈霉素溶液雙抗的Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM），37℃、5% CO2培養箱中培養。取對數生長期高糖組hREC進行細胞轉染，按siRNA oligo（吉瑪基因）說明書的方法將miR-1470模擬物、模擬物對照分別轉染到hREC中。miR-1470模擬物序列：5’-GCCCUCCGCCCGUGCACCCCGGGGUGCACGGGCGGAGGGCUU-3’；模擬物對照：正向引物：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，反向引物：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。轉染前1 d收集對數生長期細胞接種于6孔板，將miR-1470模擬物和模擬物對照分別轉染細胞8 h，用熒光倒置顯微鏡檢測轉染效率。轉染效率達80%時以磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入含10%胎牛血漿的DMEM高糖培養液（美國Hyclone公司）繼續培養24 h用于后續實驗。
將hREC分為空白對照組（即高糖組）、高表達組及陰性對照組。空白對照組hREC不作任何處理；高表達組hREC轉染miR-1470模擬物；陰性對照組hREC轉染模擬物對照。細胞轉染24 h后，Trizol法提取細胞總RNA，分光光度計測定總RNA的純度。
細胞轉染72 h后，提取細胞總蛋白，采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測EGFR蛋白的表達。應用Image J圖像分析系統對蛋白灰度值進行分析。以EGFR蛋白灰度值/β-肌動蛋白（β-actin）灰度值為目標蛋白的相對表達量。
采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。兩組間計量資料比較采用獨立樣本t檢驗；多組間計量資料比較采用方差分析，組間計量資料兩兩比較采用多重比較，即q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
RT-PCR驗證結果與基因芯片檢測結果相符。DR組患者血漿中miR-1470表達是正常組的（0.33±0.02）倍，是DM組的（0.42±0.04）倍。三組受檢者血漿中miR-1470表達比較，差異有統計學意義（F=63.486，P=0.049）。多重比較結果顯示，與DM組和正常組比較，DR組患者血漿中miR-1470表達明顯減弱，差異有統計學意義（q=111.2、73.9，P＜0.05）。與正常組比較，DM組患者血漿中miR-1470表達有所減弱，但差異無統計學意義（q=37.2，P＞0.05）。
RT-PCR檢測結果顯示，高糖組hREC中miR-1470表達明顯低于正常組，差異有統計學意義（t=42.082，P=0.015）（圖1A）。Western blot檢測結果顯示，高糖組hREC中EGFR蛋白表達明顯高于正常組，差異有統計學意義（t=?39.939，P=0.0.16）（圖1B）。
圖1
正常組及高糖組hREC中miR-1470表達及EGFR蛋白表達比較。1A.miR-1470表達；1B.EGFR蛋白表達。* P＜0.05
RT-PCR檢測結果顯示，空白對照組、陰性對照組、高表達組hREC中miR-1470表達比較，差異有統計學意義（F=637.069，P=0.000）。與空白對照組、陰性對照組比較，高表達組hREC中miR-1470表達明顯升高，差異有統計學意義（q=329.7、328.8，P＜0.05）（圖2A）。陰性對照組與空白對照組hREC中miR-1470表達比較，差異無統計學意義（q=1.5，P＞0.05）。Western blot檢測結果顯示，空白對照組、陰性對照組、高表達組hREC中EGFR蛋白表達比較，差異有統計學意義（F=122.908，P=0.000）。與空白對照組、陰性對照組比較，高表達組hREC中EGFR蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（q=242.5、234.6，P＜0.05）, （圖2B）。陰性對照組與空白對照組hREC中EGFR蛋白表達比較，差異無統計學意義（q=7.9，P＞0.05）。
圖2
空白對照組、陰性對照組、高表達組hREC中miR-1470表達及EGFR蛋白表達比較。2A.miR-1470表達；2B.EGFR蛋白表達。*P＜0.05
3 討論
目前miRNA作為治療靶標的潛力已引起人們廣泛關注。我們前期研究的基因芯片檢測結果顯示，DR組miR-1470表達較DM組下調7.95倍，較正常組下調12.31倍[6]。由于miR-1470在DR中的差異表達比較明顯，才引起了本研究團隊的注意。本研究結果顯示，DR患者血漿中miR-1470明顯降低，并且在細胞水平也證明高糖組hREC中miR-1470表達明顯低于正常組。此實驗結果是我們后續研究的基礎。
此前我們匯總Mirnada、Mmirbase、Targetscan數據庫中已知miRNA靶點信息，將三種數據庫的結果交集作為最終miR-1470的靶基因結果，同時結合已發現的與DR相關的基因，對靶基因進行功能分析，確定EGFR可能是miR-1470調控的潛在靶基因。而后我們發現高糖組hREC中EGFR蛋白表達明顯高于正常組，說明miR-1470與EGFR的表達呈負相關。為了驗證兩者之間的關系，我們在hREC中高表達miR-1470并觀察EGFR的表達。Western blot檢測結果顯示，miR-1470高表達組EGFR蛋白表達明顯降低。此結果與我們的假設相符，即miR-1470能抑制EGFR的表達。
有研究發現，miRNA能通過靶向抑制EGFR表達減弱人非小細胞肺癌的增生和侵襲能力[13]。也有研究發現，miRNA靶向沉默EGFR抑制大鼠星形膠質細胞活化[14]。因此，我們猜測miR-1470或許能通過下調EGFR表達來抑制hREC的增生和遷移能力，從而阻止新生血管的發生，但這還需要進一步實驗研究加以驗證。我們后續研究首先會在細胞水平驗證miR-1470的功能，探索其對hREC遷移、增生和凋亡的作用；其次利用熒光素酶報告基因實驗驗證EGFR是否為miR-1470的靶基因；最后根據結果進一步在信號通路上加以機制的深究。
