引用本文： 武斌, 陳松, 張惟, 何廣輝, 王健. 阿托伐他汀對體外培養的大鼠骨髓間充質干細胞CXC趨化因子受體4表達及遷移能力的影響. 中華眼底病雜志, 2018, 34(6): 575-579. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.06.010 復制
糖尿病視網膜病變（DR）是工作年齡人群致盲的首要原因[1]。間充質干細胞（MSC）具有多向分化潛能、低免疫原性和免疫赦免等特性[2-3]，被廣泛應用于多種疾病的預防和治療。近年來，MSC移植治療DR表現出良好的應用前景[4]，但其存在體內存活率低、分化效率低、歸巢能力差的缺點[5-7]。據報道，基質細胞衍生因子-1（SDF-1）/CXC趨化因子受體4（CXCR4）信號通路在MSC的歸巢、趨化，黏附分子的表達和植入中發揮重要作用[8]。研究表明，阿托伐他汀（ATV）可以使腺苷磷酸（AMP）蛋白激酶磷酸化水平顯著升高，誘導內皮型一氧化氮合酶（eNOS）上調，一氧化氮的合成增加，這可能導致CXCR4的表達增加，促進歸巢[9-10]。本研究應用ATV處理的大鼠骨髓MSC（BMSC），初步探討通過藥物處理BMSC以增強其遷移歸巢能力的可行性，為研究BMSC對DR治療作用提供實驗基礎。現將結果報道如下。
1 材料和方法
?
抗原分化簇（CD）（美國BD公司）；Polybrene（美國Santa Cruze公司）；總RNA提取試劑盒（北京賽百盛基因技術有限公司）；CXCR4單克隆抗體（美國Invitrogen公司）；dNTP（美國Invitrogen公司）；聚合酶鏈（PCR）引物（北京奧科生物技術有限公司）；SYBR Premix Ex Taq Ⅰ、RNA酶抑制劑、脫氧核糖核酸Marker DL2000、TaqDNA聚合酶、Oligo Dt primer、DNA marker（日本Takara公司）；M-MLV cDNA合成試劑盒（美國Invitrogen公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；熒光定量PCR儀（德國Eppendorf公司）；酶標儀（美國Thermo公司）。
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雌性Sprague Dawley大鼠12只，4～6周齡，體重80～100 g，無特定病原體級。天津醫科大學實驗動物科學部提供；實驗動物的使用符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。大鼠處死后無菌條件下取出雙側股骨、脛骨。Dubecoo改良Eagle（DMEM）培養基/F12培養液沖洗骨髓腔，將沖洗出的骨髓腔內容物室溫下離心，離心半徑10 cm，800 r/min離心5 min，棄上清。加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液重懸細胞，接種至75 CIll2培養瓶中，37℃、5% CO2、飽和濕度下常規培養。48 h后首次換液．之后每72 h換液1次。細胞融合至80%以上后，按1∶2～1∶3傳代。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化。細胞免疫熒光法檢測第4～6代BMSC表面分子CD11、CD44，鑒定BMSC。流式細胞儀檢測4～6代BMSC表面分子CD44、CD19、CD34等，鑒定BMSC。細胞培養至第4～6代時，重懸細胞使其濃度為1×105個/ml，37℃、5% CO2培養12 h后貼壁，在培養液中分別加入終濃度為0.0、0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0 nmol/L的ATV，處理BMSC 12 h；并據此分組，0.0 nmol/L組為對照組，余為不同濃度實驗組。
細胞免疫熒光法檢測不同濃度組細胞中CXCR4蛋白表達情況。收集培養貼壁的BMSC，調整細胞濃度為2×105個/L，加入4%多聚甲醛固定20 min；除去多聚甲醛，0.3%Triton X-100室溫通透20 min；除去Triton X-100，5%牛血清白蛋白封閉1 h；滴加足夠量適宜濃度的一抗CXCR4，4℃孵育過夜；除去一抗，滴加足夠量適宜濃度的二抗，37℃，30 min；除去二抗；滴加一滴含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗熒光淬滅劑染核并封片；熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。
參照文獻[11]方法，實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測對照組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞中CXCR4 mRNA的表達。Trizol一步法提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度，按逆轉錄試劑盒的操作說明逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行擴增，總反應體系為50 μl。采用Primer Premier5.0軟件設計引物。CXCR4：正向引物5’-GCATCGTCATCCTGTCCTGT-3’，反向引物5’-CGACGCTCTCGAACTCACAT-3’，擴增片段長度 204堿基對（bp）；磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）：正向引物5’-CCGCATCTTCTTGTGCAGTG-3’，反向引物5’-ACCAGCTTCCCATTCTCAGC-3’，擴增片段長度239 bp。反應條件：95 ℃15 s，57 ℃30 s，74 ℃30 s；變性、退火、延伸重復45個循環形成擴增曲線，記錄循環閾值（Ct值），以GAPDH為內參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。
參照文獻[12-13]方法，蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞中CXCR4蛋白表達。BMSC中提取總蛋白，加入蛋白上樣緩沖液，95 ℃煮沸5 min。14%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移到聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。加入鼠抗人CXCR4單克隆抗體一抗（1∶500）4 ℃過夜，含吐溫20的洗膜緩沖液（TBST）洗膜3次，10 min/次。加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2000），室溫下振搖2 h，TBST洗膜3次，10 min/次。超敏化學發光試劑盒顯色2 min，X光顯影。對CXCR4蛋白進行定量分析，蛋白條帶的灰度比值一目的蛋白CXCR4條帶灰度值/β-肌動蛋白（β-actin）條帶灰度值。
參照文獻[14]方法，Transwell小室法檢測1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞的遷移能力。收集各組BMSC，每組24孔板下室加入600 μl含SDF-1濃度為100 ng/ml的無血清培養基，各組分別取5×104個BMSC的100 μl培養液注入上室；培養24 h后，去除濾膜上面的未移動細胞，40 g/L多聚甲醛固定，結晶紫染液染色，倒置顯微鏡下隨機選擇5個200倍視野計數遷移到底層的細胞。
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SPSS16.0軟件行統計分析。數據以均數±標準差（
±s）表示。Probability- probability圖顯示各組數據呈近似正態分布，方差齊性檢驗顯示方差齊，組間比較行獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
倒置相差異顯微鏡觀察發現，細胞培養開始時呈圓形，大小均一；4～5 h后部分開始貼壁生長，呈短梭形，散在分布，未貼壁細胞為圓形；5～7d后可見細胞呈長梭形，80%～90%融合，形態相對均一，呈漩渦狀生長（圖1）。免疫熒光檢測結果顯示，經過傳代純化的BMSC不表達CD11，而表達CD44（圖2）。流式細胞儀結果顯示細胞均表達CDl05、CD44和CD90，陽性率＞95%；不表達CD34、CD45、CD11、CDl9和HLA-DR（HLA-Ⅱ），陽性率＜2%。
圖1
培養的BMSC倒置相差顯微鏡像。細胞呈長梭形，80%～90%融合，形態相對均一，呈漩渦狀生長×100
圖2
傳代純化的BMSC熒光顯微鏡像。2A.BMSC成梭型，胞漿豐富，CD44呈陽性表達，標記的胞質呈綠色熒光；2B.DAPI標記的細胞核呈藍色熒光；2C.共定位；2D.CD11呈陰性表達，胞質未見染色；2E.DAPI標記的細胞核呈藍色熒光；2F.共定位 ×200
細胞免疫熒光法檢測結果顯示，ATV處理12 h后，對照組、0.1 nmol/L組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞形態規則，胞質胞核明顯，CXCR4蛋白表達量隨ATV濃度升高而增加；100.0 nmol/L組、1 000.0 nmol/L組細胞可見CRCR4蛋白表達，但部分細胞破裂、死亡（圖3）。對照組和不同濃度組細胞中CXCR4相對熒光度分別為0.08、0.25、0.55、0.58、0.34、0.28；1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞中CXCR4表達量最高。
圖3
對照組和不同濃度組細胞熒光顯微鏡像。3A～3F.分別為對照組、0.1 nmol/L組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組、100.0 nmol/L組、1 000.0 nmol/L組。對照組、0.1 nmol/L組、1.0 nmol/L組細胞形態規則，胞質胞核清晰，胞核藍染與胞漿抗CXCR4蛋白陽性(紅色)，抗CXCR4蛋白依ATV濃度升高呈遞增趨勢。10.0 nmol/L組、100.0 nmol/L組、1 000.0 nmol/L組細胞失去原有形態，部分變圓、破裂 ×200
RT-PCR檢測結果顯示，10.0 nmol/L組細胞中CXCR4 mRNA表達較對照組、1.0 nmol/L組升高，差異有統計學意義（F=20.36，P=0.005）；組間兩兩比較，10.0 nmol/L組與對照組、1.0 nmol/L組差異有統計學意義（t=6.89、5.83，P=0.000，0.003），1.0 nmol/L組與對照組差異無統計學意義（t=1.64，P=0.236）（圖4）。
圖4
對照組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞CXCR4 mRNA表達比較。*P＜0.05
Western blot檢測結果顯示，10.0 nmol/L組細胞中CXCR4 蛋白表達較對照組、1.0 nmol/L組升高，差異有統計學意義（F=33.17，P=0.009）；組間兩兩比較，10.0 nmol/L組與對照組、1.0 nmol/L組差異有統計學意義（t=4.74、5.37，P=0.007，0.011），1.0 nmol/L組與對照組差異無統計學意義（t=1.76，P=0.335）（圖5）。
圖5
對照組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞CXCR4蛋白表達情況。5A. 電泳圖，1～3分別為對照組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組；5B. 對照組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞CXCR4蛋白表達結果。*P＜0.05
細胞遷移檢測結果顯示，10.0 nmol/L組細胞遷移能力較對照組和1.0 nmol/L組明顯增加，差異有統計學意義（F=43.77，P=0.000）；組間兩兩比較，10.0 nmol/L組與對照組、1.0 nmol/L組差異有統計學意義（t=10.08、9.27，P=0.000，0.006），1.0 nmol/L組與對照組差異無統計學意義（t=1.74，P=0.439）（圖6）。
圖6
對照組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞遷移情況。6A～6C. 分別為對照組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞結晶紫染色結果，標尺：200 μm；6D. 細胞遷移結果比較，1～3分別為對照組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組 *P＜0.05
3 討論
BMSC在免疫調節、抗凋亡、抗炎以及促血管生成因子、趨化或刺激組織再生的方面具有顯著效果，并具有分泌多種生物活性分子的能力[15]。目前BMSC是治療視網膜變性類疾病的理想種子細胞，但大多數輸注的BMSC無法到達靶器官，治療效果較差。所以提高干細胞歸巢是應用BMSC治療疾病的關鍵。研究表明，BMSC的遷移主要受SDF-1/CXCR4信號通路調控[16]。組織損傷后，SDF-1在受損部位的表達上調，使局部SDF-1的濃度升高并向周圍擴散，表面表達CXCR4的干細胞順著SDF-1的濃度梯度到達損傷部分定植及修復組織[8]。本研究結果顯示，ATV處理BMSC后，發現其能夠促進BMSC內CRCX4因子表達并提高其遷移能力。此結果證實ATV處理BMSC以增強其遷移歸巢能力的可行性，可為進一步研究BMSC對DR治療作用提供實驗基礎。
他汀類藥物即羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，是目前臨床應用廣泛的降脂藥物，具有抗凋亡、保護內皮功能及抗炎、抗氧化、促進新生血管生成等作用[17]。他汀類藥物可有效提高eNOS活性，Nakanishi等[18]研究顯示，阿托伐他汀通過腺苷酸活化蛋白激酶B、eNOS途徑，保護MSC免受缺氧及脫離血清的損傷，提高生存能力。Li等[19]研究表明，利用ATV處理BMSC，可以提高細胞表面CXCR4的表達，進而增強細胞的遷移和歸巢能力；并通過改善梗死心肌中炎性因子的表達，進一步改善心肌梗死后心功能。本研究結果顯示，ATV處理BMSC最佳處理時間為12 h，與Li等[19]的研究結果一致。本研究顯示處理時間超過12 h，BMSC大量死亡，狀態明顯下降，不適合繼續延長處理時間，ATV的最佳處理濃度為10.0 nmol/L，ATV促使BMSC的CXCR4表達增加呈劑量依賴性，但過高濃度ATV會導致細胞狀態欠佳甚至死亡，也會使CXCR4的表達下降，與張惟等[20]采用辛伐他汀處理內皮祖細胞以提高其黏附、遷移功能的研究結果一致。其原因可能與藥物的雙相效應有關，或過高濃度的他汀類藥物對細胞具有一定的毒副作用。
本研究通過探索ATV處理BMSC，以增強BMSC遷移體外能力，發現ATV處理BMSC后，其與細胞遷移密切相關的CXCR4表達明顯增加，可能是未來治療DR的一種新途徑。但本研究僅為體外實驗，未進行相關體內實驗，且ATV處理BMSC后未進行其增生及凋亡的檢測，對處理后的BMSC細胞質量及細胞安全性等問題均有待進一步探討和研究。
糖尿病視網膜病變（DR）是工作年齡人群致盲的首要原因[1]。間充質干細胞（MSC）具有多向分化潛能、低免疫原性和免疫赦免等特性[2-3]，被廣泛應用于多種疾病的預防和治療。近年來，MSC移植治療DR表現出良好的應用前景[4]，但其存在體內存活率低、分化效率低、歸巢能力差的缺點[5-7]。據報道，基質細胞衍生因子-1（SDF-1）/CXC趨化因子受體4（CXCR4）信號通路在MSC的歸巢、趨化，黏附分子的表達和植入中發揮重要作用[8]。研究表明，阿托伐他汀（ATV）可以使腺苷磷酸（AMP）蛋白激酶磷酸化水平顯著升高，誘導內皮型一氧化氮合酶（eNOS）上調，一氧化氮的合成增加，這可能導致CXCR4的表達增加，促進歸巢[9-10]。本研究應用ATV處理的大鼠骨髓MSC（BMSC），初步探討通過藥物處理BMSC以增強其遷移歸巢能力的可行性，為研究BMSC對DR治療作用提供實驗基礎。現將結果報道如下。
1 材料和方法
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抗原分化簇（CD）（美國BD公司）；Polybrene（美國Santa Cruze公司）；總RNA提取試劑盒（北京賽百盛基因技術有限公司）；CXCR4單克隆抗體（美國Invitrogen公司）；dNTP（美國Invitrogen公司）；聚合酶鏈（PCR）引物（北京奧科生物技術有限公司）；SYBR Premix Ex Taq Ⅰ、RNA酶抑制劑、脫氧核糖核酸Marker DL2000、TaqDNA聚合酶、Oligo Dt primer、DNA marker（日本Takara公司）；M-MLV cDNA合成試劑盒（美國Invitrogen公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；熒光定量PCR儀（德國Eppendorf公司）；酶標儀（美國Thermo公司）。
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雌性Sprague Dawley大鼠12只，4～6周齡，體重80～100 g，無特定病原體級。天津醫科大學實驗動物科學部提供；實驗動物的使用符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。大鼠處死后無菌條件下取出雙側股骨、脛骨。Dubecoo改良Eagle（DMEM）培養基/F12培養液沖洗骨髓腔，將沖洗出的骨髓腔內容物室溫下離心，離心半徑10 cm，800 r/min離心5 min，棄上清。加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液重懸細胞，接種至75 CIll2培養瓶中，37℃、5% CO2、飽和濕度下常規培養。48 h后首次換液．之后每72 h換液1次。細胞融合至80%以上后，按1∶2～1∶3傳代。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化。細胞免疫熒光法檢測第4～6代BMSC表面分子CD11、CD44，鑒定BMSC。流式細胞儀檢測4～6代BMSC表面分子CD44、CD19、CD34等，鑒定BMSC。細胞培養至第4～6代時，重懸細胞使其濃度為1×105個/ml，37℃、5% CO2培養12 h后貼壁，在培養液中分別加入終濃度為0.0、0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0 nmol/L的ATV，處理BMSC 12 h；并據此分組，0.0 nmol/L組為對照組，余為不同濃度實驗組。
細胞免疫熒光法檢測不同濃度組細胞中CXCR4蛋白表達情況。收集培養貼壁的BMSC，調整細胞濃度為2×105個/L，加入4%多聚甲醛固定20 min；除去多聚甲醛，0.3%Triton X-100室溫通透20 min；除去Triton X-100，5%牛血清白蛋白封閉1 h；滴加足夠量適宜濃度的一抗CXCR4，4℃孵育過夜；除去一抗，滴加足夠量適宜濃度的二抗，37℃，30 min；除去二抗；滴加一滴含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗熒光淬滅劑染核并封片；熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。
參照文獻[11]方法，實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測對照組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞中CXCR4 mRNA的表達。Trizol一步法提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度，按逆轉錄試劑盒的操作說明逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行擴增，總反應體系為50 μl。采用Primer Premier5.0軟件設計引物。CXCR4：正向引物5’-GCATCGTCATCCTGTCCTGT-3’，反向引物5’-CGACGCTCTCGAACTCACAT-3’，擴增片段長度 204堿基對（bp）；磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）：正向引物5’-CCGCATCTTCTTGTGCAGTG-3’，反向引物5’-ACCAGCTTCCCATTCTCAGC-3’，擴增片段長度239 bp。反應條件：95 ℃15 s，57 ℃30 s，74 ℃30 s；變性、退火、延伸重復45個循環形成擴增曲線，記錄循環閾值（Ct值），以GAPDH為內參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。
參照文獻[12-13]方法，蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞中CXCR4蛋白表達。BMSC中提取總蛋白，加入蛋白上樣緩沖液，95 ℃煮沸5 min。14%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移到聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。加入鼠抗人CXCR4單克隆抗體一抗（1∶500）4 ℃過夜，含吐溫20的洗膜緩沖液（TBST）洗膜3次，10 min/次。加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2000），室溫下振搖2 h，TBST洗膜3次，10 min/次。超敏化學發光試劑盒顯色2 min，X光顯影。對CXCR4蛋白進行定量分析，蛋白條帶的灰度比值一目的蛋白CXCR4條帶灰度值/β-肌動蛋白（β-actin）條帶灰度值。
參照文獻[14]方法，Transwell小室法檢測1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞的遷移能力。收集各組BMSC，每組24孔板下室加入600 μl含SDF-1濃度為100 ng/ml的無血清培養基，各組分別取5×104個BMSC的100 μl培養液注入上室；培養24 h后，去除濾膜上面的未移動細胞，40 g/L多聚甲醛固定，結晶紫染液染色，倒置顯微鏡下隨機選擇5個200倍視野計數遷移到底層的細胞。
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SPSS16.0軟件行統計分析。數據以均數±標準差（
±s）表示。Probability- probability圖顯示各組數據呈近似正態分布，方差齊性檢驗顯示方差齊，組間比較行獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
倒置相差異顯微鏡觀察發現，細胞培養開始時呈圓形，大小均一；4～5 h后部分開始貼壁生長，呈短梭形，散在分布，未貼壁細胞為圓形；5～7d后可見細胞呈長梭形，80%～90%融合，形態相對均一，呈漩渦狀生長（圖1）。免疫熒光檢測結果顯示，經過傳代純化的BMSC不表達CD11，而表達CD44（圖2）。流式細胞儀結果顯示細胞均表達CDl05、CD44和CD90，陽性率＞95%；不表達CD34、CD45、CD11、CDl9和HLA-DR（HLA-Ⅱ），陽性率＜2%。
圖1
培養的BMSC倒置相差顯微鏡像。細胞呈長梭形，80%～90%融合，形態相對均一，呈漩渦狀生長×100
圖2
傳代純化的BMSC熒光顯微鏡像。2A.BMSC成梭型，胞漿豐富，CD44呈陽性表達，標記的胞質呈綠色熒光；2B.DAPI標記的細胞核呈藍色熒光；2C.共定位；2D.CD11呈陰性表達，胞質未見染色；2E.DAPI標記的細胞核呈藍色熒光；2F.共定位 ×200
細胞免疫熒光法檢測結果顯示，ATV處理12 h后，對照組、0.1 nmol/L組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞形態規則，胞質胞核明顯，CXCR4蛋白表達量隨ATV濃度升高而增加；100.0 nmol/L組、1 000.0 nmol/L組細胞可見CRCR4蛋白表達，但部分細胞破裂、死亡（圖3）。對照組和不同濃度組細胞中CXCR4相對熒光度分別為0.08、0.25、0.55、0.58、0.34、0.28；1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞中CXCR4表達量最高。
圖3
對照組和不同濃度組細胞熒光顯微鏡像。3A～3F.分別為對照組、0.1 nmol/L組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組、100.0 nmol/L組、1 000.0 nmol/L組。對照組、0.1 nmol/L組、1.0 nmol/L組細胞形態規則，胞質胞核清晰，胞核藍染與胞漿抗CXCR4蛋白陽性(紅色)，抗CXCR4蛋白依ATV濃度升高呈遞增趨勢。10.0 nmol/L組、100.0 nmol/L組、1 000.0 nmol/L組細胞失去原有形態，部分變圓、破裂 ×200
RT-PCR檢測結果顯示，10.0 nmol/L組細胞中CXCR4 mRNA表達較對照組、1.0 nmol/L組升高，差異有統計學意義（F=20.36，P=0.005）；組間兩兩比較，10.0 nmol/L組與對照組、1.0 nmol/L組差異有統計學意義（t=6.89、5.83，P=0.000，0.003），1.0 nmol/L組與對照組差異無統計學意義（t=1.64，P=0.236）（圖4）。
圖4
對照組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞CXCR4 mRNA表達比較。*P＜0.05
Western blot檢測結果顯示，10.0 nmol/L組細胞中CXCR4 蛋白表達較對照組、1.0 nmol/L組升高，差異有統計學意義（F=33.17，P=0.009）；組間兩兩比較，10.0 nmol/L組與對照組、1.0 nmol/L組差異有統計學意義（t=4.74、5.37，P=0.007，0.011），1.0 nmol/L組與對照組差異無統計學意義（t=1.76，P=0.335）（圖5）。
圖5
對照組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞CXCR4蛋白表達情況。5A. 電泳圖，1～3分別為對照組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組；5B. 對照組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞CXCR4蛋白表達結果。*P＜0.05
細胞遷移檢測結果顯示，10.0 nmol/L組細胞遷移能力較對照組和1.0 nmol/L組明顯增加，差異有統計學意義（F=43.77，P=0.000）；組間兩兩比較，10.0 nmol/L組與對照組、1.0 nmol/L組差異有統計學意義（t=10.08、9.27，P=0.000，0.006），1.0 nmol/L組與對照組差異無統計學意義（t=1.74，P=0.439）（圖6）。
圖6
對照組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞遷移情況。6A～6C. 分別為對照組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組細胞結晶紫染色結果，標尺：200 μm；6D. 細胞遷移結果比較，1～3分別為對照組、1.0 nmol/L組、10.0 nmol/L組 *P＜0.05
3 討論
BMSC在免疫調節、抗凋亡、抗炎以及促血管生成因子、趨化或刺激組織再生的方面具有顯著效果，并具有分泌多種生物活性分子的能力[15]。目前BMSC是治療視網膜變性類疾病的理想種子細胞，但大多數輸注的BMSC無法到達靶器官，治療效果較差。所以提高干細胞歸巢是應用BMSC治療疾病的關鍵。研究表明，BMSC的遷移主要受SDF-1/CXCR4信號通路調控[16]。組織損傷后，SDF-1在受損部位的表達上調，使局部SDF-1的濃度升高并向周圍擴散，表面表達CXCR4的干細胞順著SDF-1的濃度梯度到達損傷部分定植及修復組織[8]。本研究結果顯示，ATV處理BMSC后，發現其能夠促進BMSC內CRCX4因子表達并提高其遷移能力。此結果證實ATV處理BMSC以增強其遷移歸巢能力的可行性，可為進一步研究BMSC對DR治療作用提供實驗基礎。
他汀類藥物即羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，是目前臨床應用廣泛的降脂藥物，具有抗凋亡、保護內皮功能及抗炎、抗氧化、促進新生血管生成等作用[17]。他汀類藥物可有效提高eNOS活性，Nakanishi等[18]研究顯示，阿托伐他汀通過腺苷酸活化蛋白激酶B、eNOS途徑，保護MSC免受缺氧及脫離血清的損傷，提高生存能力。Li等[19]研究表明，利用ATV處理BMSC，可以提高細胞表面CXCR4的表達，進而增強細胞的遷移和歸巢能力；并通過改善梗死心肌中炎性因子的表達，進一步改善心肌梗死后心功能。本研究結果顯示，ATV處理BMSC最佳處理時間為12 h，與Li等[19]的研究結果一致。本研究顯示處理時間超過12 h，BMSC大量死亡，狀態明顯下降，不適合繼續延長處理時間，ATV的最佳處理濃度為10.0 nmol/L，ATV促使BMSC的CXCR4表達增加呈劑量依賴性，但過高濃度ATV會導致細胞狀態欠佳甚至死亡，也會使CXCR4的表達下降，與張惟等[20]采用辛伐他汀處理內皮祖細胞以提高其黏附、遷移功能的研究結果一致。其原因可能與藥物的雙相效應有關，或過高濃度的他汀類藥物對細胞具有一定的毒副作用。
本研究通過探索ATV處理BMSC，以增強BMSC遷移體外能力，發現ATV處理BMSC后，其與細胞遷移密切相關的CXCR4表達明顯增加，可能是未來治療DR的一種新途徑。但本研究僅為體外實驗，未進行相關體內實驗，且ATV處理BMSC后未進行其增生及凋亡的檢測，對處理后的BMSC細胞質量及細胞安全性等問題均有待進一步探討和研究。
