磷酸鈣骨水泥(CPC)因具有良好的生物活性和生物相容性, 目前已成功應用于臨床。磷酸鈣骨水泥從制備到應用避免了高溫燒結的過程, 是各類藥物和高分子材料的優良載體。本文綜述了近年來微球以及各類載藥微球與磷酸鈣骨水泥相結合的應用, 主要從藥物緩釋、快速降解、形成多孔支架以及改善力學性能這幾個方面論述了微球在磷酸鈣骨水泥臨床應用中的作用。本文通過分析總結微球改善磷酸鈣骨水泥性能的原理及方法, 為今后進一步改進、制備符合臨床使用要求的理想型磷酸鈣骨水泥奠定了理論基礎。
引用本文： 林孫忠, 屈樹新, 薛繼鑫, 林嬋娟, 徐小普, 翁杰. 微球在磷酸鈣骨水泥中的應用. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(4): 806-811. doi: 10.7507/1001-5515.20160130 復制
引言
磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement, CPC)是1986年由Brown和Chow研制的人工骨替代材料，1991年獲得美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration, FDA)的批準開始應用于臨床[1-2]。CPC包括磷酸鈣粉末(固相)和固化液(液相)兩個部分，將兩者混合均勻后能在室溫自固化，制備過程避免了高溫燒結工藝，適合作為藥物和各類高分子的載體材料。但是CPC降解緩慢，且不具備促進新骨組織生成的孔隙結構，引導骨組織生長的能力有限。目前，改善這一性能的方式主要有兩種：①是載入各類促進骨組織生長的藥物，②是制備多孔CPC[2-4]。
藥物微囊化技術已相對成熟，通過改變微球的粒徑、高分子的分子量以及高分子上合成接枝等手段可以調控載藥微球的藥物釋放速度、降解速度和靶向作用等[2, 5-7]。因此針對CPC的結構缺陷，眾多研究者在CPC中載入高分子微球，嘗試從微球降解、藥物緩釋調控等方面來改善CPC的骨修復性能[8-13]。Simon等[8]首次制備了載聚乳酸-羥基乙酸共聚物[Poly(dl-lactic-co-glycolic acid), PLGA]微球的CPC，在骨修復前期，PLGA微球可以提供強度支持；隨著PLGA降解，載微球CPC可為新骨組織的長入提供較大的孔隙，最終被新生骨組織取代。進一步研究表明，載微球的CPC具有良好的生物相容性，可吸收，能成孔，可塑形，是理想的骨修復材料[10-13]。本文主要從藥物緩釋、形成多孔支架以及改善力學性能等幾個方面論述了載微球CPC在臨床骨缺損修復中的作用。
1 微球在CPC藥物釋放體系中的應用
CPC載藥體系的制備大致包括兩部分：首先，將藥物與CPC粉末或固化液通過物理混合的方式使藥物分散均勻；其次，再將固相和液相混合均勻即可制備得到載藥CPC。研究表明，CPC存在大量微小孔隙，可為藥物釋放提供通道，藥物通過溶解擴散迅速釋放，所以CPC載藥體系的藥物釋放基本集中在前兩周[14-15]。然而，臨床許多骨缺損伴隨著骨科疾病，如慢性骨髓炎、骨腫瘤等都需要長期的藥物治療，單純的CPC載藥體系已不能夠滿足臨床治療過程中對于藥物長期供給的需求[15]。許多研究者將藥物通過聚乳酸(polylactic acid, PLA)、PLGA、明膠、殼聚糖等各類高分子微球包裹之后，再通過物理混合的方式將載藥微球載入到CPC之中制備了載微球CPC藥物緩釋體系，微球被骨水泥緊密包裹，藥物釋放則受到微球和CPC的雙重阻礙，成功地延長了藥物釋放時間[2, 10-13]。
Zhong等[11]在CPC中載入載鮭降鈣素的PLGA微球，體外藥物釋放時間超過35 d。Loca等[12]將載萬古霉素的PLA微球載入CPC中，藥物突釋明顯減少，并且藥物釋放延長至43 d時，釋放量才為30.4%±1.3%。因此，載微球CPC能夠有效地延緩藥物釋放，滿足臨床對于藥物長期供給的需求，是理想的藥物緩釋體系。另有研究表明，通過液相直接將骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)載入CPC中，或者先將生長因子通過物理吸附結合到PLGA微球表面，再載入到CPC中，以這兩種方式都可得到長達28 d的藥物釋放曲線，而且非常相似，但是先將BMP-2吸附在PLGA微球表面的情況下，前期的藥物突釋明顯減少[16]。這一研究表明，在載微球CPC這一藥物緩釋體系中，微球不僅可以通過包裹藥物達到緩釋的效果，還可以通過微球對藥物的物理吸附進一步延緩藥物的釋放、減少藥物釋放前期的快速突釋。
Habraken等[17]以牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)為藥物模型，研究了藥物在載微球CPC中的釋放機理。不同于載藥微球或載藥CPC，BSA/PLGA/CPC載藥體系將藥物先行包裹于PLGA微球中形成載藥微球，再將載藥微球載入CPC之中，藥物受到多重包裹，從微球中釋放出來的藥物將受到微球和CPC基體的重新吸附，從而顯著性地延緩藥物的釋放。因此，載微球CPC藥物緩釋體系的藥物釋放前期，只有少量的初始釋放，且后期的藥物緩釋時間也明顯延長。同時，PLA、PLGA等微球降解時將產生酸性單體，導致pH下降、CPC降解加速、進一步使得整體孔隙率增加，而這一系列變化將逐步加速載微球CPC后期的藥物緩釋，使藥物釋放更加徹底、藥物釋放效率更高。Habraken等[18]進一步對比研究了轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、堿性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)以及BMP-2在載微球CPC藥物釋放體系中的藥物釋放，均包括前期突釋和其后較長一段時間的緩慢釋放。而在各種不同的載藥量下，bFGF的藥物突釋量均高于TGF-β1和BMP-2的藥物突釋量，六周后緩慢釋放的藥物量和藥物釋放效率(釋放的藥物占載入總量的百分比)的排序始終為bFGF> BMP-2≥TGF-β1。由此可見，藥物釋放模式及其效率基本取決于生長因子的類型，而與載入量無關，造成這一現象的原因主要有以下兩方面：一是由于各種藥物的分子結構和親疏水性各不相同，導致微球對藥物的包裹效率和吸附性能也存在較大差異；另一方面，CPC對蛋白質具有較強的吸附能力，CPC水化后基本轉化為羥基磷灰石(Hydroxyapatite, HA)，六面晶系的HA晶體具有暴露的鈣離子點，容易與羧基等帶負離子的基團結合、吸附，從而延緩藥物釋放，改變藥物的釋放效率。因此，當載微球CPC固定不變時，是分子結構類型最終決定了藥物在該緩釋體系中釋放模式及釋放效率等方面的不同。
研究表明，載微球CPC體系釋放的藥物，依舊可以保持原有的藥物活性[10-13, 19]。而且，相對于直接載入重組人骨形成蛋白-2(recombinanthuman BMP-2, rhBMP-2)的對照組，載微球CPC緩釋體系可以釋放更多保持原有藥物活性的rhBMP-2[19]。另有研究表明，藥物活性的保持與藥物的載入方式有關，只有將核因子κ B受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand，RANKL)吸附到PLGA微球上，再載入CPC中，才能獲得具有活性的RANKL的緩慢釋放。先將RANKL載入到微球內或直接加入到CPC液相中，釋放出來的RANKL將失去活性[20]。總體而言，載微球CPC是優良的藥物緩釋體系，在各類藥物的釋放機理、藥物活性保持以及CPC的多重載藥等方面需要進一步深入研究。
2 載入微球調節CPC降解并形成多孔結構的研究
CPC植入骨缺損部位后，降解緩慢，無法及時為新生骨組織提供所需的生長空間，為解決這一問題，研究者通過O2或CO2汽泡、CaSO4·2H2O、NaHCO3等造孔劑制備了CPC多孔支架，但是該支架力學強度太低[21-28]。另有研究表明，多孔CPC支架中的孔隙(尤其是大于100 μm的貫通孔隙結構)可以顯著地促進新骨組織生成[2, 10, 13, 21]。
為了提高降解速度，同時引入較大的貫通孔隙結構，許多研究者在CPC中載入可降解高分子微球[8-10, 22-23]。Simon等[8]首次制備了載PLGA微球的CPC，微球可以改善CPC的降解性能，并在保證植入初期具有一定的力學性能的同時，隨著PLGA的降解可為新骨組織的長入提供較大的孔隙。進一步研究表明，從第六周開始，PLGA降解導致樣品質量和浸泡液的pH明顯下降[17, 23]。載入PLGA微球質量百分比達20%時，載微球CPC的降解顯著加快，CPC基體也出現了降解。降解12周后，形成了高孔隙率的支架。成骨細胞可以在樣品上大量黏附、增殖，表明載PLGA微球的CPC具有良好的生物相容性、可吸收、能成孔，是理想的骨修復材料[8, 17, 23]。
PLGA等微球降解會產生乙醇酸等酸性單體，將導致環境中pH下降，促進CPC進一步降解[24-27, 29]。并且最新研究表明在浸泡液不灌注、不攪拌的情況下，液體酸化和降解速度都明顯加快[29]。同時，PLGA的分子量和末端基團是否封閉等對PLGA和CPC的降解都有影響，但是影響主要取決于末端基團的性質，末端基團以酸終止的PLGA微球降解更快、產生的酸性分解物更多、孔隙率更高[25-26]。Lanao等[25-26]進一步從形態特征方面研究了微球載入對CPC體外降解的影響。相比于空心PLGA微球，實心PLGA微球的載入可以顯著提高降解速度，是更加有效的成孔劑。造成這一現象的原因之一可能是實心微球中PLGA的含量更高，分解產生的乙醇酸更多，導致CPC基體降解更快，產生的孔隙率更高。而CPC中載入中空或實心PLGA微球，對于新骨組織的長入并沒有產生明顯的區別[27]。
除了PLGA微球之外，殼聚糖、葡萄糖酸內酯(Glucono-δ-lactone, GDL)和明膠等高分子微球也被廣泛采用[24, 30]。Lanao等[31]通過載入GDL微球來加速CPC的降解，體外浸泡降解1 d即可形成大量孔隙，植入動物體內2周后，相比于載入PLGA微球或明膠微球的對照組，降解速度更快，并可加速新生骨組織的長入，但是不適合作為長期藥物緩釋的載體。綜上所述，可以根據臨床需求載入不同的高分子微球或者按一定比例載入不同類型的高分子微球，調節CPC的降解速度和孔隙的生成速度，也可以根據需要將CPC植入初期所需的抗感染藥物和促進骨修復等功能的長期需求藥物載入到不同類別高分子微球，再同時載入CPC中，達到階段性藥物釋放的效果。目前對載多種微球CPC和載多種藥物CPC的研究尚少，需要進一步深入研究。
3 載入微球改善多孔CPC支架的力學性能的研究
CPC是脆性材料，抗壓強度較低(10~100 MPa)，只適用于非承重骨組織且降解過于緩慢，無法為新骨組織提供所需的生長空間[2, 28, 32]。另外，通過各類造孔劑制備的CPC多孔支架力學強度更低[27, 28]。而研究表明，載微球CPC既能改善CPC的力學強度又能加速降解形成多孔孔隙結構[26-27, 33]。例如，在CPC中載入聚三亞甲基碳酸酯[poly (trimethylene carbonate), PTMC]微球、PLGA微球以及水凝膠微球等均可以明顯改善CPC的脆性，材料的彈性、粘度和屈服強度等隨著載入微球量的增加而增強[28, 32]。Theinhan等[32]通過載入水凝膠微球和殼聚糖纖維制備了非剛性的CPC，其力學強度達到了松質骨的強度，拉伸破壞時的軸向應變從普通CPC的0.05%提高到了10.7%，抗彎強度是剛性CPC的4倍，斷裂功增強了20倍。因此，載入高分子微球可增強CPC整體的韌性，并使CPC在骨修復初期維持應有的力學強度，植入骨缺損部位后，再隨著微球緩慢降解為新生骨組織的長入提供所需的孔隙結構[26-27, 33]。
但是，載入微球對力學強度的影響和變化機理等有待進一步研究，其中影響因素包括：微球的大小、形態、類型、載入量以及CPC的固液比等。Habraken等[23]分別研究了載PLGA微球和PTMC微球的CPC，CPC的抗壓強度均隨微球的載入而減小。載入質量百分比為20%的PLGA微球后，CPC的抗壓強度降至4.3 MPa，體外降解12周后形成了高孔隙率、高強度的支架，其它研究者也得到了類似的結果[23, 28, 34]。Wu等[34]在CPC中載入微球后，其抗壓強度也有一定程度的降低；隨后載入β-磷酸三鈣(Beta tricalcium phosphate，β-TCP)顆粒，可以在提高力學強度的同時縮短凝固時間，消除微球載入帶來的影響。因此我們建議，微球載入對CPC力學強度變化的研究難度較大，除了優化各類變量之外，可以嘗試配合軟件模擬分析等方法多角度探究力學強度的變化機理。
4 微球載入對CPC臨床使用可操作性、骨修復性能的影響
CPC的凝固時間決定了手術的可操作性，時間過短或過長都不利于手術的進行，一般凝固時間要在4~15 min [2, 10]。研究表明，載入各類高分子微球，CPC的凝固時間均有不同程度的延長[23, 28, 31-34]。而載入多糖類的果膠微球或者硫酸鈣二水合物(Calcium sulfate dihydrate，CSD)等可以縮短CPC的凝固時間[20, 28, 34]。因此，需要通過限制微球載入量以及微球載入種類等方式來減弱微球對凝固時間的影響。Cai等[35]在載高分子微球CPC中同時載入質量百分比低于5%的CSD，CSD既可以縮短載微球CPC的凝固時間，同時提高了CPC的抗壓強度。另外，微球載入使CPC的可注射性逐漸變差，但是在微球載入質量百分比不高于20%時，CPC的可注射性不會發生顯著性變化[23, 28]。Qi等[28]研究發現載入質量百分比為20%的PLGA微球時，CPC的可注射性能系數[如式(1)所示]仍高于95%，具有可觀的應用前景。綜上所述，微球載入對CPC的臨床使用并未造成明顯的影響，載微球CPC具有優良的臨床使用可操作性。
CPC的可注射性系數的定義如下[28]：
| $可注射性系數\% = 從注射器中排出的量/注射之前的總重量$ |
各類細胞實驗和動物實驗表明，載微球CPC的骨修復性能更優異，是更加優良的骨修復材料[21, 33-34, 36-37]。Habraken等[13]在兔子脊柱的兩側植入載微球CPC，4周后，骨組織緊密結合處發現有新生骨組織生成；植入12周后，新生骨組織在微球降解產生的孔隙結構中明顯長入。同時，研究表明增加微球的載入量或者載入降解速度更快的微球可以加速CPC復合材料的降解，并進一步提高新生骨組織的長入量[22, 31]。除了載入量之外，Lanao等[38]從微球形態學方面對比研究了載中空PLGA微球、實心PLGA微球的CPC。不論有無載入藥物，載實心微球CPC植入后生成的新生骨組織的量都顯著提高，在載入中空微球的情況下，同時載入血小板衍生生長因子(Platelet derived growth factor, PDGF)和胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor, IGF)，兩種藥物聯合使用才可以促進骨組織的生長。由此可見，相比于空白CPC，載微球CPC在促進骨缺損修復方面具有明顯的優勢，是更加優良的骨修復材料；另外，可以通過控制微球載入量、載入藥物以及控制微球形態等方式來調節載微球CPC的骨修復性能。
5 展望
載微球CPC是理想的骨修復材料，具有生物相容性良好、可吸收、能成孔、可塑形、可載藥并可實現長期緩釋，同時在植入前期具有較高的力學強度等優點，必將成為一個新的發展方向。但是，微球載入后CPC力學強度變化的機理、CPC和各類微球同時作為藥物載體載入多組份藥物以及如何高效地保持載入生長因子的活性等大量涉及多重變量的課題尚需要進一步深入研究。
引言
磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement, CPC)是1986年由Brown和Chow研制的人工骨替代材料，1991年獲得美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration, FDA)的批準開始應用于臨床[1-2]。CPC包括磷酸鈣粉末(固相)和固化液(液相)兩個部分，將兩者混合均勻后能在室溫自固化，制備過程避免了高溫燒結工藝，適合作為藥物和各類高分子的載體材料。但是CPC降解緩慢，且不具備促進新骨組織生成的孔隙結構，引導骨組織生長的能力有限。目前，改善這一性能的方式主要有兩種：①是載入各類促進骨組織生長的藥物，②是制備多孔CPC[2-4]。
藥物微囊化技術已相對成熟，通過改變微球的粒徑、高分子的分子量以及高分子上合成接枝等手段可以調控載藥微球的藥物釋放速度、降解速度和靶向作用等[2, 5-7]。因此針對CPC的結構缺陷，眾多研究者在CPC中載入高分子微球，嘗試從微球降解、藥物緩釋調控等方面來改善CPC的骨修復性能[8-13]。Simon等[8]首次制備了載聚乳酸-羥基乙酸共聚物[Poly(dl-lactic-co-glycolic acid), PLGA]微球的CPC，在骨修復前期，PLGA微球可以提供強度支持；隨著PLGA降解，載微球CPC可為新骨組織的長入提供較大的孔隙，最終被新生骨組織取代。進一步研究表明，載微球的CPC具有良好的生物相容性，可吸收，能成孔，可塑形，是理想的骨修復材料[10-13]。本文主要從藥物緩釋、形成多孔支架以及改善力學性能等幾個方面論述了載微球CPC在臨床骨缺損修復中的作用。
1 微球在CPC藥物釋放體系中的應用
CPC載藥體系的制備大致包括兩部分：首先，將藥物與CPC粉末或固化液通過物理混合的方式使藥物分散均勻；其次，再將固相和液相混合均勻即可制備得到載藥CPC。研究表明，CPC存在大量微小孔隙，可為藥物釋放提供通道，藥物通過溶解擴散迅速釋放，所以CPC載藥體系的藥物釋放基本集中在前兩周[14-15]。然而，臨床許多骨缺損伴隨著骨科疾病，如慢性骨髓炎、骨腫瘤等都需要長期的藥物治療，單純的CPC載藥體系已不能夠滿足臨床治療過程中對于藥物長期供給的需求[15]。許多研究者將藥物通過聚乳酸(polylactic acid, PLA)、PLGA、明膠、殼聚糖等各類高分子微球包裹之后，再通過物理混合的方式將載藥微球載入到CPC之中制備了載微球CPC藥物緩釋體系，微球被骨水泥緊密包裹，藥物釋放則受到微球和CPC的雙重阻礙，成功地延長了藥物釋放時間[2, 10-13]。
Zhong等[11]在CPC中載入載鮭降鈣素的PLGA微球，體外藥物釋放時間超過35 d。Loca等[12]將載萬古霉素的PLA微球載入CPC中，藥物突釋明顯減少，并且藥物釋放延長至43 d時，釋放量才為30.4%±1.3%。因此，載微球CPC能夠有效地延緩藥物釋放，滿足臨床對于藥物長期供給的需求，是理想的藥物緩釋體系。另有研究表明，通過液相直接將骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)載入CPC中，或者先將生長因子通過物理吸附結合到PLGA微球表面，再載入到CPC中，以這兩種方式都可得到長達28 d的藥物釋放曲線，而且非常相似，但是先將BMP-2吸附在PLGA微球表面的情況下，前期的藥物突釋明顯減少[16]。這一研究表明，在載微球CPC這一藥物緩釋體系中，微球不僅可以通過包裹藥物達到緩釋的效果，還可以通過微球對藥物的物理吸附進一步延緩藥物的釋放、減少藥物釋放前期的快速突釋。
Habraken等[17]以牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)為藥物模型，研究了藥物在載微球CPC中的釋放機理。不同于載藥微球或載藥CPC，BSA/PLGA/CPC載藥體系將藥物先行包裹于PLGA微球中形成載藥微球，再將載藥微球載入CPC之中，藥物受到多重包裹，從微球中釋放出來的藥物將受到微球和CPC基體的重新吸附，從而顯著性地延緩藥物的釋放。因此，載微球CPC藥物緩釋體系的藥物釋放前期，只有少量的初始釋放，且后期的藥物緩釋時間也明顯延長。同時，PLA、PLGA等微球降解時將產生酸性單體，導致pH下降、CPC降解加速、進一步使得整體孔隙率增加，而這一系列變化將逐步加速載微球CPC后期的藥物緩釋，使藥物釋放更加徹底、藥物釋放效率更高。Habraken等[18]進一步對比研究了轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、堿性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)以及BMP-2在載微球CPC藥物釋放體系中的藥物釋放，均包括前期突釋和其后較長一段時間的緩慢釋放。而在各種不同的載藥量下，bFGF的藥物突釋量均高于TGF-β1和BMP-2的藥物突釋量，六周后緩慢釋放的藥物量和藥物釋放效率(釋放的藥物占載入總量的百分比)的排序始終為bFGF> BMP-2≥TGF-β1。由此可見，藥物釋放模式及其效率基本取決于生長因子的類型，而與載入量無關，造成這一現象的原因主要有以下兩方面：一是由于各種藥物的分子結構和親疏水性各不相同，導致微球對藥物的包裹效率和吸附性能也存在較大差異；另一方面，CPC對蛋白質具有較強的吸附能力，CPC水化后基本轉化為羥基磷灰石(Hydroxyapatite, HA)，六面晶系的HA晶體具有暴露的鈣離子點，容易與羧基等帶負離子的基團結合、吸附，從而延緩藥物釋放，改變藥物的釋放效率。因此，當載微球CPC固定不變時，是分子結構類型最終決定了藥物在該緩釋體系中釋放模式及釋放效率等方面的不同。
研究表明，載微球CPC體系釋放的藥物，依舊可以保持原有的藥物活性[10-13, 19]。而且，相對于直接載入重組人骨形成蛋白-2(recombinanthuman BMP-2, rhBMP-2)的對照組，載微球CPC緩釋體系可以釋放更多保持原有藥物活性的rhBMP-2[19]。另有研究表明，藥物活性的保持與藥物的載入方式有關，只有將核因子κ B受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand，RANKL)吸附到PLGA微球上，再載入CPC中，才能獲得具有活性的RANKL的緩慢釋放。先將RANKL載入到微球內或直接加入到CPC液相中，釋放出來的RANKL將失去活性[20]。總體而言，載微球CPC是優良的藥物緩釋體系，在各類藥物的釋放機理、藥物活性保持以及CPC的多重載藥等方面需要進一步深入研究。
2 載入微球調節CPC降解并形成多孔結構的研究
CPC植入骨缺損部位后，降解緩慢，無法及時為新生骨組織提供所需的生長空間，為解決這一問題，研究者通過O2或CO2汽泡、CaSO4·2H2O、NaHCO3等造孔劑制備了CPC多孔支架，但是該支架力學強度太低[21-28]。另有研究表明，多孔CPC支架中的孔隙(尤其是大于100 μm的貫通孔隙結構)可以顯著地促進新骨組織生成[2, 10, 13, 21]。
為了提高降解速度，同時引入較大的貫通孔隙結構，許多研究者在CPC中載入可降解高分子微球[8-10, 22-23]。Simon等[8]首次制備了載PLGA微球的CPC，微球可以改善CPC的降解性能，并在保證植入初期具有一定的力學性能的同時，隨著PLGA的降解可為新骨組織的長入提供較大的孔隙。進一步研究表明，從第六周開始，PLGA降解導致樣品質量和浸泡液的pH明顯下降[17, 23]。載入PLGA微球質量百分比達20%時，載微球CPC的降解顯著加快，CPC基體也出現了降解。降解12周后，形成了高孔隙率的支架。成骨細胞可以在樣品上大量黏附、增殖，表明載PLGA微球的CPC具有良好的生物相容性、可吸收、能成孔，是理想的骨修復材料[8, 17, 23]。
PLGA等微球降解會產生乙醇酸等酸性單體，將導致環境中pH下降，促進CPC進一步降解[24-27, 29]。并且最新研究表明在浸泡液不灌注、不攪拌的情況下，液體酸化和降解速度都明顯加快[29]。同時，PLGA的分子量和末端基團是否封閉等對PLGA和CPC的降解都有影響，但是影響主要取決于末端基團的性質，末端基團以酸終止的PLGA微球降解更快、產生的酸性分解物更多、孔隙率更高[25-26]。Lanao等[25-26]進一步從形態特征方面研究了微球載入對CPC體外降解的影響。相比于空心PLGA微球，實心PLGA微球的載入可以顯著提高降解速度，是更加有效的成孔劑。造成這一現象的原因之一可能是實心微球中PLGA的含量更高，分解產生的乙醇酸更多，導致CPC基體降解更快，產生的孔隙率更高。而CPC中載入中空或實心PLGA微球，對于新骨組織的長入并沒有產生明顯的區別[27]。
除了PLGA微球之外，殼聚糖、葡萄糖酸內酯(Glucono-δ-lactone, GDL)和明膠等高分子微球也被廣泛采用[24, 30]。Lanao等[31]通過載入GDL微球來加速CPC的降解，體外浸泡降解1 d即可形成大量孔隙，植入動物體內2周后，相比于載入PLGA微球或明膠微球的對照組，降解速度更快，并可加速新生骨組織的長入，但是不適合作為長期藥物緩釋的載體。綜上所述，可以根據臨床需求載入不同的高分子微球或者按一定比例載入不同類型的高分子微球，調節CPC的降解速度和孔隙的生成速度，也可以根據需要將CPC植入初期所需的抗感染藥物和促進骨修復等功能的長期需求藥物載入到不同類別高分子微球，再同時載入CPC中，達到階段性藥物釋放的效果。目前對載多種微球CPC和載多種藥物CPC的研究尚少，需要進一步深入研究。
3 載入微球改善多孔CPC支架的力學性能的研究
CPC是脆性材料，抗壓強度較低(10~100 MPa)，只適用于非承重骨組織且降解過于緩慢，無法為新骨組織提供所需的生長空間[2, 28, 32]。另外，通過各類造孔劑制備的CPC多孔支架力學強度更低[27, 28]。而研究表明，載微球CPC既能改善CPC的力學強度又能加速降解形成多孔孔隙結構[26-27, 33]。例如，在CPC中載入聚三亞甲基碳酸酯[poly (trimethylene carbonate), PTMC]微球、PLGA微球以及水凝膠微球等均可以明顯改善CPC的脆性，材料的彈性、粘度和屈服強度等隨著載入微球量的增加而增強[28, 32]。Theinhan等[32]通過載入水凝膠微球和殼聚糖纖維制備了非剛性的CPC，其力學強度達到了松質骨的強度，拉伸破壞時的軸向應變從普通CPC的0.05%提高到了10.7%，抗彎強度是剛性CPC的4倍，斷裂功增強了20倍。因此，載入高分子微球可增強CPC整體的韌性，并使CPC在骨修復初期維持應有的力學強度，植入骨缺損部位后，再隨著微球緩慢降解為新生骨組織的長入提供所需的孔隙結構[26-27, 33]。
但是，載入微球對力學強度的影響和變化機理等有待進一步研究，其中影響因素包括：微球的大小、形態、類型、載入量以及CPC的固液比等。Habraken等[23]分別研究了載PLGA微球和PTMC微球的CPC，CPC的抗壓強度均隨微球的載入而減小。載入質量百分比為20%的PLGA微球后，CPC的抗壓強度降至4.3 MPa，體外降解12周后形成了高孔隙率、高強度的支架，其它研究者也得到了類似的結果[23, 28, 34]。Wu等[34]在CPC中載入微球后，其抗壓強度也有一定程度的降低；隨后載入β-磷酸三鈣(Beta tricalcium phosphate，β-TCP)顆粒，可以在提高力學強度的同時縮短凝固時間，消除微球載入帶來的影響。因此我們建議，微球載入對CPC力學強度變化的研究難度較大，除了優化各類變量之外，可以嘗試配合軟件模擬分析等方法多角度探究力學強度的變化機理。
4 微球載入對CPC臨床使用可操作性、骨修復性能的影響
CPC的凝固時間決定了手術的可操作性，時間過短或過長都不利于手術的進行，一般凝固時間要在4~15 min [2, 10]。研究表明，載入各類高分子微球，CPC的凝固時間均有不同程度的延長[23, 28, 31-34]。而載入多糖類的果膠微球或者硫酸鈣二水合物(Calcium sulfate dihydrate，CSD)等可以縮短CPC的凝固時間[20, 28, 34]。因此，需要通過限制微球載入量以及微球載入種類等方式來減弱微球對凝固時間的影響。Cai等[35]在載高分子微球CPC中同時載入質量百分比低于5%的CSD，CSD既可以縮短載微球CPC的凝固時間，同時提高了CPC的抗壓強度。另外，微球載入使CPC的可注射性逐漸變差，但是在微球載入質量百分比不高于20%時，CPC的可注射性不會發生顯著性變化[23, 28]。Qi等[28]研究發現載入質量百分比為20%的PLGA微球時，CPC的可注射性能系數[如式(1)所示]仍高于95%，具有可觀的應用前景。綜上所述，微球載入對CPC的臨床使用并未造成明顯的影響，載微球CPC具有優良的臨床使用可操作性。
CPC的可注射性系數的定義如下[28]：
| $可注射性系數\% = 從注射器中排出的量/注射之前的總重量$ |
各類細胞實驗和動物實驗表明，載微球CPC的骨修復性能更優異，是更加優良的骨修復材料[21, 33-34, 36-37]。Habraken等[13]在兔子脊柱的兩側植入載微球CPC，4周后，骨組織緊密結合處發現有新生骨組織生成；植入12周后，新生骨組織在微球降解產生的孔隙結構中明顯長入。同時，研究表明增加微球的載入量或者載入降解速度更快的微球可以加速CPC復合材料的降解，并進一步提高新生骨組織的長入量[22, 31]。除了載入量之外，Lanao等[38]從微球形態學方面對比研究了載中空PLGA微球、實心PLGA微球的CPC。不論有無載入藥物，載實心微球CPC植入后生成的新生骨組織的量都顯著提高，在載入中空微球的情況下，同時載入血小板衍生生長因子(Platelet derived growth factor, PDGF)和胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor, IGF)，兩種藥物聯合使用才可以促進骨組織的生長。由此可見，相比于空白CPC，載微球CPC在促進骨缺損修復方面具有明顯的優勢，是更加優良的骨修復材料；另外，可以通過控制微球載入量、載入藥物以及控制微球形態等方式來調節載微球CPC的骨修復性能。
5 展望
載微球CPC是理想的骨修復材料，具有生物相容性良好、可吸收、能成孔、可塑形、可載藥并可實現長期緩釋，同時在植入前期具有較高的力學強度等優點，必將成為一個新的發展方向。但是，微球載入后CPC力學強度變化的機理、CPC和各類微球同時作為藥物載體載入多組份藥物以及如何高效地保持載入生長因子的活性等大量涉及多重變量的課題尚需要進一步深入研究。