骨形態形成蛋白(BMPs)是目前已知的誘導骨生成能力最強的因子之一。重組人骨形態形成蛋白(rhBMPs)的產品已經在骨科、口腔醫學等領域得到廣泛應用。臨床使用時, 需要將其與具有緩釋作用的載體復合, 保持作用部位的濃度以持續誘導成骨。本文就BMPs載體及其釋放系統的研究進展作一綜述。
引用本文： 李樹祎, 周苗. 骨形態形成蛋白載體與可控釋放系統的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(4): 812-815. doi: 10.7507/1001-5515.20160131 復制
引言
自1965年M.R.Urist首次發現骨形態形成蛋白((bone morphogenetic proteins, BMPs)以來，大量研究已證實BMPs在骨再生分子信號調控中發揮著重要作用。在BMPs家族中，BMP-2、4、7具有強大的骨誘導能力[1]。其中，重組人骨形態形成蛋白2, 7(recombinant human bone morphogenetic protein-2, 7, rhBMP-2, 7)被美國食品藥品管理局(U. S. Food and Drug Administration, FDA)批準應用于治療骨不連、脛骨開放性骨折及牙槽骨再生等[2-4]。在應用rhBMPs誘導成骨時，蛋白很容易被局部組織液或血液稀釋，或被蛋白酶分解，造成局部有效濃度不足，作用時間有限[5-7]。為達到較好的修復效果，臨床上常使用大劑量rhBMPs(毫克級)，這很可能會對其他組織、器官產生不必要的副作用，如過度成骨或異位成骨等[8-9]。因此，人們將因子研究的焦點轉移到低劑量、高成效地利用生長因子上來。大量研究表明BMP-2緩慢釋放可提高因子利用效率，更有利于新骨形成[10-12]。
1 BMPs的載體材料
理想的BMPs載體至少應具備以下四個方面的功能：①具有很好的生物相容性，降解產物應無毒無害；較佳的抗壓、抗拉性能，并可特異性輸送BMPs到其作用位點；②調節和保持有效濃度的BMPs釋放；③適宜的孔隙率以促進周圍骨細胞和血管生成以及相關細胞的增殖和長入；④載體降解速度與骨組織再生速度保持動態一致性[13-14]。目前主要有4類，如表 1所示。
表1
BMPs載體的分類及其優缺點
Table1.
Classification of BMPs carriers & merits and demerits
1.1 無機鹽類
無機材料如羥基磷灰石、磷酸三鈣等都具有較好的生物相容性、骨傳導性、生物可降解性以及優良的機械性能，是良好的骨缺損填充材料。但這類材料也存在塑形難、脆性大、降解時間長等缺點，目前仍是臨床上最常用的骨再生產品之一。Abarrategi等[15]采用三維打印技術制作個性化磷酸三鈣支架材料，實驗組采用表面涂層方式復合rhBMP-2，原位及異位植入新西蘭兔體內觀察其成骨效能。實驗證明，由于該種支架良好的孔隙結構，新生骨組織及纖維結締組織等均可長入支架內部。Ziegler等[16]將rhBMP-2和重組人堿性成纖維細胞生長因子(recombinant human basic fibroblast growth factor, rh-bFGF)吸附到無機材料羥基磷灰石、磷酸三鈣和玻璃陶瓷上，發現這兩種生長因子的活性均逐漸遞減。作者認為需要尋求一種可加強生長因子與支架結合的方法，延長其骨誘導活性。
雙相磷酸鹽沉積和磷酸鈣共沉積技術利用離子間電荷作用可形成三維立體網狀晶格結構儲存蛋白，在保持蛋白活性和降低早期突釋方面表現出極大潛力。Liu等[17]采用仿生BMP-2磷酸鈣共沉淀技術，制作出仿生骨形態形成蛋白2-共沉積鈣磷(biomimetic BMP2-coprecipitated calcium phosphate, BMP2-cop.BioCaP)顆粒，其骨誘導性是單純物理吸附作用的十倍。將異硫氰酸熒光素標記牛血清白蛋白(bovine serum albumin-fluoresceine isothiocyanate, BSA-FITC)作為模型蛋白體外釋放實驗表明，3 d突釋期后可持續穩定釋放達35 d，同時早期突釋清除量少于50.1%[18]。此種復合方法形成層層沉積的鈣磷結晶和BMP-2共聚層，隨著表面鈣磷結晶的逐漸溶出，BMP-2隨之釋放，因而達到蛋白緩釋的目的。
1.2 天然高分子聚合物
天然來源的高分子聚合物主要有膠原、明膠、殼聚糖、透明質酸等。其生物相容性優良，而且可吸收。由于來源天然，這種材料是否會引起病原體傳播及免疫排斥反應是長久以來備受關注的問題。
1.2.1 膠原
膠原是促進細胞黏附最重要的細胞外基質成分，是最常見的組織工程支架材料，已被FDA批準為rhBMP-2, 7的載體。Hollinger等[19]研究表明：BMPs直接應用時，只有不到5%的活性蛋白可在局部發揮作用，而與明膠或者膠原聯合應用時，15%~55%的原始劑量可以發揮作用。膠原復合BMP-2后利用膠原材料的包裹作用，減慢BMP-2的溶出，并降低游離狀態下BMP-2的含量，減少早期突釋。膠原作為rhBMPs的載體，存在強度不足、易降解、因子早期爆釋量大等缺點[20]。Chen等[21]通過將“TKKTLRT”膠原結合區與rhBMP-2的N-末端特異性結合以實現其緩慢釋放，不僅能保留rhBMP-2蛋白活性，而且其修復兔下頜骨缺損及異位成骨的能力優于常規快速釋放組。
1.2.2 明膠
明膠是膠原的變性產物，具有較好的降解性能、凝膠-溶膠的可逆性轉變性以及更高的化學反應性。單獨利用明膠作為載體材料時，也存在早期爆釋量大及力學性能欠佳的缺點。將明膠與交聯劑等發生交聯反應后，可降低其降解速度，達到因子的梯度釋放。
京尼平是傳統中藥杜仲的活性成分之一，可與蛋白質、多糖等生物聚合物發生交聯反應[22]。有人采用天然低毒的交聯劑京尼平(是傳統交聯劑毒性的1/5 000~1/10 000)來降低因子酶解速率，并提高其抗張強度及彈性模量等力學性能[23]。Zhang等[2]將京尼平交聯的明膠復合BMP-2后，包裹于三維打印的PCL支架，不僅改變該支架的親水性能，而且提高其抗壓模量。同時，體外釋放實驗檢測發現，BMP-2在短暫的突釋期后呈現一種持續緩慢的釋放，0~20 h內，10%明膠濃度組蛋白釋放僅為總量的12.55%。緩釋出的蛋白具有很好的成骨活性。相較于單純PCL支架加載BMP-2組，京尼平改性明膠組其BMP-2的骨誘導能力更強，新骨分布更均一，外周成骨效果更佳。
1.3 合成高分子材料
可作為BMPs載體的合成高分子材料種類繁多，如PLA、PGA、聚乙二醇[poly(ethylene glycol), PEG]以及它們的共聚物材料等。這些材料制備工藝簡單，理化性能和機械性能穩定，已廣泛應用于骨組織工程。該類材料對因子釋放速率的影響有賴于材料的包裹作用，通過高分子材料逐步降解實現因子的緩慢釋放。Wink等[11]采用膠原支架負載包裹BMP-2的PLGA，探究BMP-2釋放動力學等。研究發現，蛋白在體外釋放呈對數型，早期突釋量僅為30%。Rahman等[24]采用熱壓縮技術，在37 ℃將PLGA/PEG顆粒與BMP-2溶液共混獲得多孔支架材料。體外釋放實驗發現12 h突釋13%，其后平均每天以0.01%~8%速率緩慢釋放長達23 d。
1.4 復合材料
將以上3種生物材料采用物理或化學方法混合，取長補短，充分發揮材料優勢，避免其缺陷，成為BMPs載體研究的熱點和方向[25]。He等[26]采用殼聚糖/海藻酸鹽/羥基磷灰石復合材料復合BMP-2，與單純膠原/羥基磷灰石載體相比，7 d內釋放總量僅為膠原/羥基磷灰石組的7/10，14 d后上清液活性BMP-2濃度為3.2 ng/mL。
2 BMPs與載體結合方式
2.1 非共價結合BMPs
非共價固定BMPs常見方式有：物理包裹、表面吸附或離子絡合[27]。其中，物理包裹法的常見載體有：聚合物微粒、脂質體、水凝膠、骨水泥等，主要利用物理屏障作用阻礙生長因子釋放。另外，表面吸附也是因子固定的常用手段，如BMPs與可吸收明膠海綿結合。BMP-2由于具有半胱氨酸和脯氨酸，其等電點在5~6范圍內。它可以與帶有電荷的大分子，如藻酸鹽、明膠等形成離子絡合物，但是，非可逆的離子絡合會導致蛋白失去活性。
2.2 共價結合BMPs
載體與BMPs共價結合可減少游離態蛋白含量，降低早期突釋量，同時由于蛋白與載體結合更緊密，緩釋效果更顯著。但是共價固定生長因子可能會影響因子與受體結合，進而影響生長因子活性。設計合理的共軛生長因子可在載體基質中形成可控劑量的梯度分布。例如，BMPs的氨基團可通過N-羥基琥珀酰亞胺/N-乙基碳二亞胺、N，N-羰基二咪唑、還原胺反應[28]，或者與明膠、肝素共價結合到材料表面。Hannink等[29]采用肝素結合的Ⅰ型膠原作為涂層材料復合BMP-2，較單純膠原復合組因子包埋率提高48%~56%，而膠原復合組因子包埋率僅提高3%。同時，肝素結合組因子釋放可持續21 d。硅烷化反應也是將生長因子共價結合到陶瓷材料表面的常用方法[30]。
3 展望
rhBMPs在骨缺損修復臨床應用方面適應證廣泛，然而其價格昂貴，使用量遠超出生理劑量(納克級)，因此如何有效提高其利用效率、降低使用劑量，成為目前研究的熱點。通過改良載體材料的結構、生物學性能，并結合緩釋技術可以實現活性材料多功能骨缺損修復與再生。將生物材料與細胞因子結合可降低傳統骨填充材料的缺陷，改善單一材料的成骨性能、骨傳導性及骨誘導性，為更多的患者創造福音。
引言
自1965年M.R.Urist首次發現骨形態形成蛋白((bone morphogenetic proteins, BMPs)以來，大量研究已證實BMPs在骨再生分子信號調控中發揮著重要作用。在BMPs家族中，BMP-2、4、7具有強大的骨誘導能力[1]。其中，重組人骨形態形成蛋白2, 7(recombinant human bone morphogenetic protein-2, 7, rhBMP-2, 7)被美國食品藥品管理局(U. S. Food and Drug Administration, FDA)批準應用于治療骨不連、脛骨開放性骨折及牙槽骨再生等[2-4]。在應用rhBMPs誘導成骨時，蛋白很容易被局部組織液或血液稀釋，或被蛋白酶分解，造成局部有效濃度不足，作用時間有限[5-7]。為達到較好的修復效果，臨床上常使用大劑量rhBMPs(毫克級)，這很可能會對其他組織、器官產生不必要的副作用，如過度成骨或異位成骨等[8-9]。因此，人們將因子研究的焦點轉移到低劑量、高成效地利用生長因子上來。大量研究表明BMP-2緩慢釋放可提高因子利用效率，更有利于新骨形成[10-12]。
1 BMPs的載體材料
理想的BMPs載體至少應具備以下四個方面的功能：①具有很好的生物相容性，降解產物應無毒無害；較佳的抗壓、抗拉性能，并可特異性輸送BMPs到其作用位點；②調節和保持有效濃度的BMPs釋放；③適宜的孔隙率以促進周圍骨細胞和血管生成以及相關細胞的增殖和長入；④載體降解速度與骨組織再生速度保持動態一致性[13-14]。目前主要有4類，如表 1所示。
表1
BMPs載體的分類及其優缺點
Table1.
Classification of BMPs carriers & merits and demerits
1.1 無機鹽類
無機材料如羥基磷灰石、磷酸三鈣等都具有較好的生物相容性、骨傳導性、生物可降解性以及優良的機械性能，是良好的骨缺損填充材料。但這類材料也存在塑形難、脆性大、降解時間長等缺點，目前仍是臨床上最常用的骨再生產品之一。Abarrategi等[15]采用三維打印技術制作個性化磷酸三鈣支架材料，實驗組采用表面涂層方式復合rhBMP-2，原位及異位植入新西蘭兔體內觀察其成骨效能。實驗證明，由于該種支架良好的孔隙結構，新生骨組織及纖維結締組織等均可長入支架內部。Ziegler等[16]將rhBMP-2和重組人堿性成纖維細胞生長因子(recombinant human basic fibroblast growth factor, rh-bFGF)吸附到無機材料羥基磷灰石、磷酸三鈣和玻璃陶瓷上，發現這兩種生長因子的活性均逐漸遞減。作者認為需要尋求一種可加強生長因子與支架結合的方法，延長其骨誘導活性。
雙相磷酸鹽沉積和磷酸鈣共沉積技術利用離子間電荷作用可形成三維立體網狀晶格結構儲存蛋白，在保持蛋白活性和降低早期突釋方面表現出極大潛力。Liu等[17]采用仿生BMP-2磷酸鈣共沉淀技術，制作出仿生骨形態形成蛋白2-共沉積鈣磷(biomimetic BMP2-coprecipitated calcium phosphate, BMP2-cop.BioCaP)顆粒，其骨誘導性是單純物理吸附作用的十倍。將異硫氰酸熒光素標記牛血清白蛋白(bovine serum albumin-fluoresceine isothiocyanate, BSA-FITC)作為模型蛋白體外釋放實驗表明，3 d突釋期后可持續穩定釋放達35 d，同時早期突釋清除量少于50.1%[18]。此種復合方法形成層層沉積的鈣磷結晶和BMP-2共聚層，隨著表面鈣磷結晶的逐漸溶出，BMP-2隨之釋放，因而達到蛋白緩釋的目的。
1.2 天然高分子聚合物
天然來源的高分子聚合物主要有膠原、明膠、殼聚糖、透明質酸等。其生物相容性優良，而且可吸收。由于來源天然，這種材料是否會引起病原體傳播及免疫排斥反應是長久以來備受關注的問題。
1.2.1 膠原
膠原是促進細胞黏附最重要的細胞外基質成分，是最常見的組織工程支架材料，已被FDA批準為rhBMP-2, 7的載體。Hollinger等[19]研究表明：BMPs直接應用時，只有不到5%的活性蛋白可在局部發揮作用，而與明膠或者膠原聯合應用時，15%~55%的原始劑量可以發揮作用。膠原復合BMP-2后利用膠原材料的包裹作用，減慢BMP-2的溶出，并降低游離狀態下BMP-2的含量，減少早期突釋。膠原作為rhBMPs的載體，存在強度不足、易降解、因子早期爆釋量大等缺點[20]。Chen等[21]通過將“TKKTLRT”膠原結合區與rhBMP-2的N-末端特異性結合以實現其緩慢釋放，不僅能保留rhBMP-2蛋白活性，而且其修復兔下頜骨缺損及異位成骨的能力優于常規快速釋放組。
1.2.2 明膠
明膠是膠原的變性產物，具有較好的降解性能、凝膠-溶膠的可逆性轉變性以及更高的化學反應性。單獨利用明膠作為載體材料時，也存在早期爆釋量大及力學性能欠佳的缺點。將明膠與交聯劑等發生交聯反應后，可降低其降解速度，達到因子的梯度釋放。
京尼平是傳統中藥杜仲的活性成分之一，可與蛋白質、多糖等生物聚合物發生交聯反應[22]。有人采用天然低毒的交聯劑京尼平(是傳統交聯劑毒性的1/5 000~1/10 000)來降低因子酶解速率，并提高其抗張強度及彈性模量等力學性能[23]。Zhang等[2]將京尼平交聯的明膠復合BMP-2后，包裹于三維打印的PCL支架，不僅改變該支架的親水性能，而且提高其抗壓模量。同時，體外釋放實驗檢測發現，BMP-2在短暫的突釋期后呈現一種持續緩慢的釋放，0~20 h內，10%明膠濃度組蛋白釋放僅為總量的12.55%。緩釋出的蛋白具有很好的成骨活性。相較于單純PCL支架加載BMP-2組，京尼平改性明膠組其BMP-2的骨誘導能力更強，新骨分布更均一，外周成骨效果更佳。
1.3 合成高分子材料
可作為BMPs載體的合成高分子材料種類繁多，如PLA、PGA、聚乙二醇[poly(ethylene glycol), PEG]以及它們的共聚物材料等。這些材料制備工藝簡單，理化性能和機械性能穩定，已廣泛應用于骨組織工程。該類材料對因子釋放速率的影響有賴于材料的包裹作用，通過高分子材料逐步降解實現因子的緩慢釋放。Wink等[11]采用膠原支架負載包裹BMP-2的PLGA，探究BMP-2釋放動力學等。研究發現，蛋白在體外釋放呈對數型，早期突釋量僅為30%。Rahman等[24]采用熱壓縮技術，在37 ℃將PLGA/PEG顆粒與BMP-2溶液共混獲得多孔支架材料。體外釋放實驗發現12 h突釋13%，其后平均每天以0.01%~8%速率緩慢釋放長達23 d。
1.4 復合材料
將以上3種生物材料采用物理或化學方法混合，取長補短，充分發揮材料優勢，避免其缺陷，成為BMPs載體研究的熱點和方向[25]。He等[26]采用殼聚糖/海藻酸鹽/羥基磷灰石復合材料復合BMP-2，與單純膠原/羥基磷灰石載體相比，7 d內釋放總量僅為膠原/羥基磷灰石組的7/10，14 d后上清液活性BMP-2濃度為3.2 ng/mL。
2 BMPs與載體結合方式
2.1 非共價結合BMPs
非共價固定BMPs常見方式有：物理包裹、表面吸附或離子絡合[27]。其中，物理包裹法的常見載體有：聚合物微粒、脂質體、水凝膠、骨水泥等，主要利用物理屏障作用阻礙生長因子釋放。另外，表面吸附也是因子固定的常用手段，如BMPs與可吸收明膠海綿結合。BMP-2由于具有半胱氨酸和脯氨酸，其等電點在5~6范圍內。它可以與帶有電荷的大分子，如藻酸鹽、明膠等形成離子絡合物，但是，非可逆的離子絡合會導致蛋白失去活性。
2.2 共價結合BMPs
載體與BMPs共價結合可減少游離態蛋白含量，降低早期突釋量，同時由于蛋白與載體結合更緊密，緩釋效果更顯著。但是共價固定生長因子可能會影響因子與受體結合，進而影響生長因子活性。設計合理的共軛生長因子可在載體基質中形成可控劑量的梯度分布。例如，BMPs的氨基團可通過N-羥基琥珀酰亞胺/N-乙基碳二亞胺、N，N-羰基二咪唑、還原胺反應[28]，或者與明膠、肝素共價結合到材料表面。Hannink等[29]采用肝素結合的Ⅰ型膠原作為涂層材料復合BMP-2，較單純膠原復合組因子包埋率提高48%~56%，而膠原復合組因子包埋率僅提高3%。同時，肝素結合組因子釋放可持續21 d。硅烷化反應也是將生長因子共價結合到陶瓷材料表面的常用方法[30]。
3 展望
rhBMPs在骨缺損修復臨床應用方面適應證廣泛，然而其價格昂貴，使用量遠超出生理劑量(納克級)，因此如何有效提高其利用效率、降低使用劑量，成為目前研究的熱點。通過改良載體材料的結構、生物學性能，并結合緩釋技術可以實現活性材料多功能骨缺損修復與再生。將生物材料與細胞因子結合可降低傳統骨填充材料的缺陷，改善單一材料的成骨性能、骨傳導性及骨誘導性，為更多的患者創造福音。
