針對傳統超聲設備存在的交叉污染、樣本破碎不均勻等問題，本文研制了一種小型化、低成本的高強度聚焦超聲裝置。該裝置通過凹球面自聚焦型壓電陶瓷片產生超聲波，在聚焦區域形成空化效應，實現樣本裂解。首先，本文通過物理仿真證明裝置的可行性，然后制作功率可調的驅動電路，實現0～22.4 W聲功率輸出，最后進行石蠟包埋樣本脫蠟實驗驗證裝置的有效性。實驗結果表明，高強度聚焦超聲裝置的脫蠟效率和安全性明顯優于傳統化學方法，與商用超聲儀器具有可比性。綜上，本文研發的高強度聚焦超聲裝置有望應用于自動化核酸提取和純化設備中，在樣本前處理領域具有廣闊的應用前景。
引用本文： 雷祝兵, 龐欣佩, 李力, 梅茜, 董文飛. 用于生物樣品處理的高強度聚焦超聲裝置開發研究. 生物醫學工程學雜志, 2024, 41(1): 152-159. doi: 10.7507/1001-5515.202304061 復制
0 引言
超聲波是指頻率超過20 kHz的機械波，被廣泛應用于疾病診斷、癌癥治療、藥物遞送等醫學領域[1-5]。利用超聲波產生的空化效應，可實現細胞破碎、組織勻漿等功能，因此超聲技術可用于處理復雜的生物樣本[6]。目前市場上的超聲波破碎儀大多屬于接觸式，需要將換能器浸入樣本溶液。該方式存在以下缺陷：每次實驗需要清洗換能器，無法徹底規避交叉污染的風險；樣本溶液中聲壓分布不均勻，不利于實驗的可重復性；換能器工作產生的熱量直接傳遞到樣本溶液中，影響實驗結果。
由于傳統接觸式超聲儀器存在以上不足，非接觸式超聲技術開始受到研究者重視。喬龍學等[7]設計了一種非接觸式超聲裂解系統，但是該系統機械結構復雜，體積較大。Holmes等[8]在凹球面上固定多個換能器，產生聚焦超聲，實現從組織中快速提取核酸。Bigelow等[9]通過高強度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound，HIFU）技術裂解微藻。Bomsztyk等[10]將HIFU技術應用于表觀遺傳學。目前，市面上的聚焦超聲儀器較少，且價格昂貴，如非接觸式超聲波破碎儀M220（Covaris Inc.，美國）（以下全文簡稱M220），不利于集成到自動化、便攜式設備中。
針對以上問題，本文研制了一種小型化、低成本的HIFU裝置。該裝置通過凹球面自聚焦型壓電陶瓷片發射超聲波，在聚焦區域產生空化效應，實現樣本裂解。本研究通過物理場仿真驗證該裝置的可行性，并設計了能夠穩定驅動換能器的功率放大電路。最后利用HIFU裝置處理小鼠肺部的石蠟包埋福爾馬林浸泡（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）樣本，并與二甲苯脫蠟法、商用儀器M220進行對比，測試裝置的有效性。
1 方法
1.1 換能器選型
HIFU換能器的工作頻率通常在100 kHz～10 MHz，為選擇合適的換能器，本文通過聲學頻域仿真，定性分析聲場與頻率之間的關系。首先建立HIFU聲場的二維對稱仿真模型，如圖1所示，R軸為徑向軸，Z軸為垂直軸；仿真區域為換能器、水域，模型外圍添加完美匹配層，匹配層的邊界設置為硬聲場邊界；固定頻率以外的條件，設換能器的聚焦半徑r為38 mm，外半徑r’為19 mm，向內法向位移為100 nm；分別設置頻率f為100 kHz、500 kHz、1 MHz、2 MHz，仿真計算得到的結果如圖1所示。聚焦區域呈梭形分布，其范圍大小與頻率呈負相關；f=100 kHz時，最大絕對壓強僅0.3 MPa；而f=2 MHz時，最大絕對壓強為80.0 MPa；該結果表明，頻率越高，能量越集中。因此，使用HIFU技術處理生物樣品時，需根據樣品和容器的體積與結構，選擇合適的換能器。
圖1
不同工作頻率下HIFU換能器的聲場仿真
Figure1.
Acoustic field simulation of HIFU transducers with different operating frequencies
本研究的生物樣品處理實驗中，樣品體積為0.5～1.5 mL，容器采用2.0 mL離心管(T2-EP0200-B-N-S-ZX，上海泰坦科技股份有限公司，中國)，其底部直徑約10 mm。市面上工作頻率高于2 MHz的換能器的尺寸比仿真模型更小，聚焦區域偏小，不適用于本研究。由于需同時考慮到換能器裝配、防水等問題，故選用中心無開孔、凹面電極引至凸面的換能器。綜合以上因素，本文采用諧振頻率為500 kHz的換能器，其聚焦半徑為67 mm，外半徑為30 mm。
1.2 HIFU裝置
本研究設計的HIFU裝置的結構和實物如圖2所示，主要包括頂蓋、水槽、換能器和底蓋，長、寬、高分別為75、87、120 mm。水槽通過三維打印技術加工，頂蓋作為試管的夾具，容器為2.0 mL離心管，內部裝有待處理的生物樣本；水槽內部裝有去離子水，作為超聲波傳輸的媒介；側邊有矩形窗口，粘貼透明亞克力板，便于觀察實驗現象；下方接口處安裝卡扣配合型連接器（bayonet nut connector，BNC）母座；用防水密封膠將換能器固定于水槽底部，正負電極與BNC母座連接，最后經射頻傳輸線連接到電路板。
圖2
HIFU裝置的示意圖
Figure2.
The diagram of HIFU device
對上述裝置進行物理場仿真，定性分析結構的可行性。首先建立二維仿真模型，如圖3所示，底部的曲線為換能器，向內法向位移為100 nm；聚焦區域放置2.0 mL離心管，材質為聚丙烯；其余部分均為水；模型邊界添加完美匹配層；環境的初始溫度設為20 ℃。
圖3
HIFU裝置的物理場仿真
Figure3.
The physics field simulation of HIFU device
通過聲學頻域仿真，計算絕對壓強，結果如圖3所示，試管中間區域的絕對壓強較大，最大約9.6 MPa，然而試管底部同樣具有較高的壓強。然后，進行固體和流體傳熱的時域仿真，熱源Q的計算，如式(1)所示：
 |
其中，I為聲學仿真計算的聲強，α為材料的吸聲系數[11]。熱源持續5 min，得到如圖3所示的溫度分布圖。試管底部溫度最高，升高約10 ℃，試管內部溫度上升3～9 ℃。
通過仿真實驗可知，超聲波主要聚集在試管內部，能夠用于樣本處理。試管內部溫升較小，有利于生物實驗，如保持酶的活性、核酸完整性等。但是2.0 mL離心管底部吸收聲能發熱，因此會對儀器的性能有所限制。
1.3 驅動電路
1.3.1 電路設計
HIFU換能器為容性器件，在諧振頻率點處的阻抗幅值最小[12]。換能器的驅動電路可分為線性型和開關型，由于線性型放大電路工作效率低[13]，故大功率應用中基本采用開關型電路，主要有以下幾種：雙極性半橋型D類功放[14-17]、多極性階梯型D類功放[18-22]、變壓器耦合型D類功放[23]和E類功率放大電路[24-25]。本文基于變壓器耦合型D類功率放大電路進行設計，開發的驅動電路如圖4所示。
圖4
驅動電路與相關波形
Figure4.
Driving circuit and related waveforms
功率放大部分采用推挽式結構，其中數字可調電源供電電壓（volt current condenser，VCC）為電路提供能量，型號為DKP6012（深圳寰球信瑞電子科技有限公司，中國）；Q1和Q2（IRF610, Infineon Technologies Inc., 德國）為具有低導通電阻、低輸入電容和高耐壓值的N型金屬氧化物半導體場效應晶體管（metal oxide semiconductor field effect transistor，MOSFET）；柵極驅動器1和2用于驅動MOSFET，可提高開關速率，降低功率損耗；瞬態抑制二極管D1和D2用于吸收因變壓器漏感引起的電壓尖峰，保護Q1和Q2；T1為高頻環形變壓器，磁環材質為鎳鋅鐵氧體，兩初級線圈和次級線圈的匝數比為5:5:10。
電路的基本工作原理為：Q2導通，Q1關閉時，電流從VCC經變壓器流向Q2，負載兩端產生正感應電壓；Q1導通，Q2關閉時，負載兩端產生負感應電壓；以500 kHz頻率交替導通Q1和Q2，即可在負載兩端產生500 kHz的方波。
1.3.2 諧波抑制
直接用方波驅動HIFU換能器會產生較大的奇數次諧波，Tang等[23]提出了一種抑制三次諧波的方法，并指出更高階次的諧波會因換能器的帶通特性被濾除，然而Tang等[23]設計的電路需兩套推挽電路配合工作，結構復雜、成本高。本文基于STM32單片機（STM32F103C8T6，意法半導體，意大利），以低成本方案實現諧波抑制功能。
本文設計的信號源如圖4所示，單片機的高級定時器1產生互補輸出的一對脈沖寬度調制（pulse width modulation，PWM）波形，記作SigA和SigB，其中定時器1的配置參數如表1所示。普通定時器產生的PWM信號分別與SigA和SigB進行與運算，得到的Sig1和Sig2作為柵極驅動器的輸入信號。當PWM信號為高電平時，Sig1、Sig2信號如圖4所示，理論上輸出波形的三次諧波分量為0；當PWM為低電平時，Sig1和Sig2為低電平，電路無輸出。因此可通過修改PWM信號的占空比，調節電路輸出的有效功率。
表1
單片機高級定時器1的配置參數
Table1.
Configuration parameters for advanced timer 1 of microcontroller
2 結果
2.1 電路測試
2.1.1 諧波抑制功能
對有無諧波抑制功能的實際電路分別進行測試，并固定電源VCC為8 V。無諧波抑制的電路中，為防止Q1和Q2同時導通，添加了約40 ns的死區保護時間。通過示波器（PicoScope 6404D，Pico Technology Inc.，英國）測量輸出波形，同時記錄相應的頻譜分布情況。結果如圖5所示，無諧波抑制時，輸出波形具有較大的諧波分量，從頻譜圖可知主要為三次諧波；經過諧波抑制的輸出波形接近三角波，其中三次諧波分量降低9.59 dB。因此，經過諧波抑制方法改進后的電路，能夠更穩定地驅動HIFU換能器。
圖5
有無諧波抑制功能時電路的輸出波形及其頻譜分布
Figure5.
Output waveforms and spectrum distribution of the circuit with or without harmonic suppression
2.1.2 輸出功率
用HIFU技術處理各類生物樣品時，需要使用不同的聲功率進行實驗，以得到最優的結果。通過調節本文電路的峰值電功率和有效電功率，可使HIFU換能器輸出不同的聲功率。為研究電功率與聲功率之間的關系，本文采用輻射力天平（RFB-LF，Precision Acoustics Ltd，英國）測量不同電功率下的聲功率。測量過程中，每種條件均測三組數據，取均值作為結果。受限于輻射力天平的測量功率范圍，實驗中僅測量低于10 W的聲功率。
峰值電功率調節：單片機通過串口與數字可調電源建立通信，調節功放的輸入電源VCC，從而改變輸出波形的峰峰值，實現峰值電功率調節。結果如表2所示，以二次多項式進行擬合，如式(2)所示：
表2
峰值電功率調節的結果
Table2.
The result of peak electrical power regulation
 |
式中，P聲代表測量的聲功率，u為電源VCC的電壓值，擬合結果的決定系數R2=0.999 45，擬合效果較好。而實際電路中電源VCC的最大輸出電壓為24 V，計算可知最大聲功率約為22.4 W。
有效電功率調節：設置電源VCC為10 V，調節PWM信號的占空比，測量相應的聲功率，結果如表3所示。以一次函數進行擬合，如式(3)所示：
表3
有效電功率調節的結果
Table3.
The result of effective electrical power regulation
 |
其中，
為PWM信號的占空比，擬合結果的決定系數R2 = 0.998 28，表明聲功率與占空比 
具有較好的線性相關性。
綜上所述，輸出聲功率P聲與VCC電壓u和PWM信號占空比λ的關系如式(4)所示：
 |
計算聲功率與電功率的比值，可知系統的總電聲轉換效率約19%，影響因素主要有換能器的機電耦合系數、功率放大電路的工作效率等。
2.1.3 工作頻率
通過STM32的高級定時器1產生不同頻率的信號源，并用示波器獲取負載兩端的波形，根據波形的振鈴、失真等情況，判斷電路是否正常工作，從而確定電路的工作頻率。由于超聲換能器的阻抗隨頻率在變化，因此以50 Ω金屬膜電阻作為負載。測試結果如下：
無諧波抑制功能時，電路的工作頻率為20 kHz～2 MHz。低于20 kHz時，輸出波形出現較大振鈴，原因是變壓器無法在此頻率內工作，需更換磁環材料，且增加繞線匝數；而高于2 MHz時，電路受限于MOSFET的開關速率。
添加諧波抑制功能后，工作頻率為100 kHz～1 MHz。低于100 kHz時，單片機的定時器無法產生足夠長的死區時間，需采取其他方案制作信號源；而諧波抑制功能要求電路具有更快的開關頻率，因此上限頻率下降至1 MHz。
2.2 石蠟包埋樣品脫蠟實驗
2.2.1 FFPE樣本脫蠟
為驗證本文HIFU裝置的有效性，本研究進行了FFPE脫蠟實驗，并與傳統的二甲苯脫蠟法和商用儀器M220進行對比。FFPE技術是一種常用的組織樣品保存方法，在醫學研究、臨床診斷等領域具有重要意義[26-27]。然而，從FFPE樣本中提取高質量的核酸分子具有較高難度，因為石蠟對組織的保護作用，阻礙了試劑的滲透[28-29]。傳統的脫蠟方法采用二甲苯溶劑，然而二甲苯具有毒性，威脅實驗人員的健康和自然環境，且脫蠟時間較長[30]。
本研究進行了以下對比實驗：分別采用本文HIFU裝置、二甲苯和商用儀器M220，對多份厚度為10 μm的小鼠肺部FFPE切片進行脫蠟處理，然后進行核酸提取與純化，以及擴增實驗，比較各方法的優劣。每種方法進行三組獨立實驗。
本文HIFU裝置的脫蠟過程如下：將2塊FFPE切片放置于含有組織裂解緩沖液和蛋白酶K的2.0 mL離心管中，在本文HIFU裝置上超聲6 min。其中，電源VCC設為15 V，PWM信號的周期為100 ms，占空比為20%，輸出電功率約8.9 W，輸出聲功率約1.7 W。
二甲苯脫蠟步驟如下：將2塊FFPE切片浸泡在二甲苯溶液中，劇烈渦旋10 s；離心棄上清，保留組織沉淀；加入無水乙醇，劇烈渦旋10 s；離心棄上清，保留組織沉淀；全過程約15 min。
商用儀器M220的脫蠟過程如下：將2塊FFPE切片裝入含有組織裂解緩沖液和蛋白酶K的試管microTUBE-500（Covaris Inc.，美國）中，在M220儀器上超聲6 min。其中，儀器的峰值電功率為75 W，占空比為20%，平均電功率約15 W，聲功率未知。
脫蠟后采用FFPE核酸提取純化試劑盒（truXTRAC FFPE NA，Covaris Inc.，美國），按照說明書分別提取DNA和RNA。
2.2.2 核酸濃度與純度分析
核酸的濃度和純度分別用熒光儀（Qubit 4，Thermo Fisher Scientific Inc.，美國）和分光光度計（NanoDrop 2000，Thermo Fisher Scientific Inc.，美國）測得，結果如表4所示。對于DNA，三種方法得到的A260/280比值和A260/230比值均在1.8～2.2之間，說明DNA純度較高，幾乎沒有蛋白和化學試劑殘留。對比RNA的濃度，本文HIFU裝置的脫蠟效果優于另外兩種方法。對比RNA的純度，本文HIFU裝置和商用儀器M220對應的A260/280比值都在1.8～2.2之間，而二甲苯脫蠟法對應的A260/280比值低于1.8，雖然三種提取方法對應的A260/230比值都低于1.8，但二甲苯脫蠟法的A260/230比值最低，說明本文HIFU裝置和商用儀器M220有助于去除后續核酸純化過程中的殘留蛋白和化學試劑。
表4
DNA和RNA的濃度和純度
Table4.
Concentration and purity of DNA and RNA
2.2.3 核酸擴增
對小鼠管家基因β-actin進行聚合酶鏈式反應，設計引物擴增207 bp長度的DNA片段，擴增后進行凝膠電泳實驗，結果如圖6所示。DNA擴增產物電泳圖中的標號1、2、3分別對應三種脫蠟方式：本文HIFU裝置、二甲苯脫蠟法和商用儀器M220；“—”表示陰性對照組；“M”為標記（marker）。使用科學圖像分析軟件ImageJ 1.53（National Institutes of Health，美國）對條帶積分灰度值進行歸一化，可以看出，采用三種脫蠟方式所提取出的DNA均具備良好的可擴增性，且電泳條帶積分灰度值之間無肉眼可見差異。
圖6
DNA擴增產物的電泳結果
Figure6.
Electrophoresis results of DNA amplification products
3 討論
超聲技術可應用于生物樣本處理，相對于傳統的水浴式和探頭式超聲，HIFU將超聲波聚焦在試管內部，能夠無接觸地處理樣本，具有功耗低、重復性好等優勢。目前商用的聚焦超聲儀器較少，且體積大、價格昂貴，不利于集成到自動化設備中。本研究設計的HIFU裝置體積小、成本低，可以實現樣品快速破碎，易于集成到便攜式設備、自動化平臺。
本文通過物理場仿真，對HIFU換能器的聲場進行了定性分析。換能器的工作頻率越高，聚焦范圍越小，能量越集中。針對不同的使用場景，應根據換能器的頻率、聚焦半徑、外直徑等參數進行選型。本文HIFU裝置適配實驗室常用的2.0 mL離心管，能夠完成FFPE脫蠟實驗。然而，仿真發現其錐形底部會吸收聲能而發熱，對超聲的功率會有一定限制。為規避該影響，應根據換能器尺寸設計合適的容器，使得容器底部的切平面與聲波的入射方向保持垂直，從而降低聲能損耗。
為高效、穩定地驅動HIFU換能器，本研究采用變壓器耦合的D類功率放大電路，并通過諧波抑制方法對電路進行改進，有效降低了輸出的三次諧波分量。本文通過調節電路輸出的峰值電功率和有效電功率，使超聲換能器輸出0～22.4 W的聲功率，滿足不同參數的超聲處理需求。
通過本文HIFU裝置、二甲苯和商用儀器M220對小鼠肺部FFPE樣品進行脫蠟實驗，結果如下：對比脫蠟效果，三種方式均能成功脫蠟，且提取的核酸具有可擴增性，能夠用于分子生物學檢測；對比DNA的濃度和純度，三種方法未見明顯差異；對比RNA的純度和濃度，本文HIFU裝置明顯優于二甲苯脫蠟法，與商用儀器M220的結果接近。對比擴增產物的電泳條帶，三種脫蠟方式無肉眼可見差異；對比脫蠟效率，二甲苯脫蠟過程中需要離心、渦旋等操作，而本文HIFU裝置和商用儀器M220操作流程簡單，減小了因操作人員所導致的實驗誤差，同時縮短了脫蠟時間；對比安全性，二甲苯具有毒性，不利于實驗人員的健康和環境保護。對比裝置體積：本文HIFU裝置體積較小，既可以作為獨立設備使用，也可以作為樣品前處理模塊，集成到核酸一體檢測設備中。
4 結論
為解決傳統超聲儀器存在交叉污染、樣本破碎不均勻等問題，本研究設計了一種小型化、低成本的HIFU裝置。首先通過物理仿真證明裝置的可行性，然后制作功率可調的HIFU換能器驅動電路，最后通過FFPE樣本脫蠟實驗測試裝置的有效性。實驗結果表明：相比于二甲苯脫蠟法，本文HIFU裝置具有更好的脫蠟效果、效率和安全性；而與商用儀器M220相比，本文HIFU裝置體積小、成本低。綜上所述，本文設計的小型化HIFU裝置有望應用于自動化核酸提取和純化設備中，在樣本前處理領域具有廣闊的應用前景。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：雷祝兵主要負責聲場仿真、機械、電路、編程和論文撰寫；龐欣佩負責生物實驗和論文修改；李力主要負責生物實驗設計與指導；梅茜指導工程設計和論文審閱修訂；董文飛主要負責項目整體指導和論文修訂。
0 引言
超聲波是指頻率超過20 kHz的機械波，被廣泛應用于疾病診斷、癌癥治療、藥物遞送等醫學領域[1-5]。利用超聲波產生的空化效應，可實現細胞破碎、組織勻漿等功能，因此超聲技術可用于處理復雜的生物樣本[6]。目前市場上的超聲波破碎儀大多屬于接觸式，需要將換能器浸入樣本溶液。該方式存在以下缺陷：每次實驗需要清洗換能器，無法徹底規避交叉污染的風險；樣本溶液中聲壓分布不均勻，不利于實驗的可重復性；換能器工作產生的熱量直接傳遞到樣本溶液中，影響實驗結果。
由于傳統接觸式超聲儀器存在以上不足，非接觸式超聲技術開始受到研究者重視。喬龍學等[7]設計了一種非接觸式超聲裂解系統，但是該系統機械結構復雜，體積較大。Holmes等[8]在凹球面上固定多個換能器，產生聚焦超聲，實現從組織中快速提取核酸。Bigelow等[9]通過高強度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound，HIFU）技術裂解微藻。Bomsztyk等[10]將HIFU技術應用于表觀遺傳學。目前，市面上的聚焦超聲儀器較少，且價格昂貴，如非接觸式超聲波破碎儀M220（Covaris Inc.，美國）（以下全文簡稱M220），不利于集成到自動化、便攜式設備中。
針對以上問題，本文研制了一種小型化、低成本的HIFU裝置。該裝置通過凹球面自聚焦型壓電陶瓷片發射超聲波，在聚焦區域產生空化效應，實現樣本裂解。本研究通過物理場仿真驗證該裝置的可行性，并設計了能夠穩定驅動換能器的功率放大電路。最后利用HIFU裝置處理小鼠肺部的石蠟包埋福爾馬林浸泡（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）樣本，并與二甲苯脫蠟法、商用儀器M220進行對比，測試裝置的有效性。
1 方法
1.1 換能器選型
HIFU換能器的工作頻率通常在100 kHz～10 MHz，為選擇合適的換能器，本文通過聲學頻域仿真，定性分析聲場與頻率之間的關系。首先建立HIFU聲場的二維對稱仿真模型，如圖1所示，R軸為徑向軸，Z軸為垂直軸；仿真區域為換能器、水域，模型外圍添加完美匹配層，匹配層的邊界設置為硬聲場邊界；固定頻率以外的條件，設換能器的聚焦半徑r為38 mm，外半徑r’為19 mm，向內法向位移為100 nm；分別設置頻率f為100 kHz、500 kHz、1 MHz、2 MHz，仿真計算得到的結果如圖1所示。聚焦區域呈梭形分布，其范圍大小與頻率呈負相關；f=100 kHz時，最大絕對壓強僅0.3 MPa；而f=2 MHz時，最大絕對壓強為80.0 MPa；該結果表明，頻率越高，能量越集中。因此，使用HIFU技術處理生物樣品時，需根據樣品和容器的體積與結構，選擇合適的換能器。
圖1
不同工作頻率下HIFU換能器的聲場仿真
Figure1.
Acoustic field simulation of HIFU transducers with different operating frequencies
本研究的生物樣品處理實驗中，樣品體積為0.5～1.5 mL，容器采用2.0 mL離心管(T2-EP0200-B-N-S-ZX，上海泰坦科技股份有限公司，中國)，其底部直徑約10 mm。市面上工作頻率高于2 MHz的換能器的尺寸比仿真模型更小，聚焦區域偏小，不適用于本研究。由于需同時考慮到換能器裝配、防水等問題，故選用中心無開孔、凹面電極引至凸面的換能器。綜合以上因素，本文采用諧振頻率為500 kHz的換能器，其聚焦半徑為67 mm，外半徑為30 mm。
1.2 HIFU裝置
本研究設計的HIFU裝置的結構和實物如圖2所示，主要包括頂蓋、水槽、換能器和底蓋，長、寬、高分別為75、87、120 mm。水槽通過三維打印技術加工，頂蓋作為試管的夾具，容器為2.0 mL離心管，內部裝有待處理的生物樣本；水槽內部裝有去離子水，作為超聲波傳輸的媒介；側邊有矩形窗口，粘貼透明亞克力板，便于觀察實驗現象；下方接口處安裝卡扣配合型連接器（bayonet nut connector，BNC）母座；用防水密封膠將換能器固定于水槽底部，正負電極與BNC母座連接，最后經射頻傳輸線連接到電路板。
圖2
HIFU裝置的示意圖
Figure2.
The diagram of HIFU device
對上述裝置進行物理場仿真，定性分析結構的可行性。首先建立二維仿真模型，如圖3所示，底部的曲線為換能器，向內法向位移為100 nm；聚焦區域放置2.0 mL離心管，材質為聚丙烯；其余部分均為水；模型邊界添加完美匹配層；環境的初始溫度設為20 ℃。
圖3
HIFU裝置的物理場仿真
Figure3.
The physics field simulation of HIFU device
通過聲學頻域仿真，計算絕對壓強，結果如圖3所示，試管中間區域的絕對壓強較大，最大約9.6 MPa，然而試管底部同樣具有較高的壓強。然后，進行固體和流體傳熱的時域仿真，熱源Q的計算，如式(1)所示：
|
其中，I為聲學仿真計算的聲強，α為材料的吸聲系數[11]。熱源持續5 min，得到如圖3所示的溫度分布圖。試管底部溫度最高，升高約10 ℃，試管內部溫度上升3～9 ℃。
通過仿真實驗可知，超聲波主要聚集在試管內部，能夠用于樣本處理。試管內部溫升較小，有利于生物實驗，如保持酶的活性、核酸完整性等。但是2.0 mL離心管底部吸收聲能發熱，因此會對儀器的性能有所限制。
1.3 驅動電路
1.3.1 電路設計
HIFU換能器為容性器件，在諧振頻率點處的阻抗幅值最小[12]。換能器的驅動電路可分為線性型和開關型，由于線性型放大電路工作效率低[13]，故大功率應用中基本采用開關型電路，主要有以下幾種：雙極性半橋型D類功放[14-17]、多極性階梯型D類功放[18-22]、變壓器耦合型D類功放[23]和E類功率放大電路[24-25]。本文基于變壓器耦合型D類功率放大電路進行設計，開發的驅動電路如圖4所示。
圖4
驅動電路與相關波形
Figure4.
Driving circuit and related waveforms
功率放大部分采用推挽式結構，其中數字可調電源供電電壓（volt current condenser，VCC）為電路提供能量，型號為DKP6012（深圳寰球信瑞電子科技有限公司，中國）；Q1和Q2（IRF610, Infineon Technologies Inc., 德國）為具有低導通電阻、低輸入電容和高耐壓值的N型金屬氧化物半導體場效應晶體管（metal oxide semiconductor field effect transistor，MOSFET）；柵極驅動器1和2用于驅動MOSFET，可提高開關速率，降低功率損耗；瞬態抑制二極管D1和D2用于吸收因變壓器漏感引起的電壓尖峰，保護Q1和Q2；T1為高頻環形變壓器，磁環材質為鎳鋅鐵氧體，兩初級線圈和次級線圈的匝數比為5:5:10。
電路的基本工作原理為：Q2導通，Q1關閉時，電流從VCC經變壓器流向Q2，負載兩端產生正感應電壓；Q1導通，Q2關閉時，負載兩端產生負感應電壓；以500 kHz頻率交替導通Q1和Q2，即可在負載兩端產生500 kHz的方波。
1.3.2 諧波抑制
直接用方波驅動HIFU換能器會產生較大的奇數次諧波，Tang等[23]提出了一種抑制三次諧波的方法，并指出更高階次的諧波會因換能器的帶通特性被濾除，然而Tang等[23]設計的電路需兩套推挽電路配合工作，結構復雜、成本高。本文基于STM32單片機（STM32F103C8T6，意法半導體，意大利），以低成本方案實現諧波抑制功能。
本文設計的信號源如圖4所示，單片機的高級定時器1產生互補輸出的一對脈沖寬度調制（pulse width modulation，PWM）波形，記作SigA和SigB，其中定時器1的配置參數如表1所示。普通定時器產生的PWM信號分別與SigA和SigB進行與運算，得到的Sig1和Sig2作為柵極驅動器的輸入信號。當PWM信號為高電平時，Sig1、Sig2信號如圖4所示，理論上輸出波形的三次諧波分量為0；當PWM為低電平時，Sig1和Sig2為低電平，電路無輸出。因此可通過修改PWM信號的占空比，調節電路輸出的有效功率。
表1
單片機高級定時器1的配置參數
Table1.
Configuration parameters for advanced timer 1 of microcontroller
2 結果
2.1 電路測試
2.1.1 諧波抑制功能
對有無諧波抑制功能的實際電路分別進行測試，并固定電源VCC為8 V。無諧波抑制的電路中，為防止Q1和Q2同時導通，添加了約40 ns的死區保護時間。通過示波器（PicoScope 6404D，Pico Technology Inc.，英國）測量輸出波形，同時記錄相應的頻譜分布情況。結果如圖5所示，無諧波抑制時，輸出波形具有較大的諧波分量，從頻譜圖可知主要為三次諧波；經過諧波抑制的輸出波形接近三角波，其中三次諧波分量降低9.59 dB。因此，經過諧波抑制方法改進后的電路，能夠更穩定地驅動HIFU換能器。
圖5
有無諧波抑制功能時電路的輸出波形及其頻譜分布
Figure5.
Output waveforms and spectrum distribution of the circuit with or without harmonic suppression
2.1.2 輸出功率
用HIFU技術處理各類生物樣品時，需要使用不同的聲功率進行實驗，以得到最優的結果。通過調節本文電路的峰值電功率和有效電功率，可使HIFU換能器輸出不同的聲功率。為研究電功率與聲功率之間的關系，本文采用輻射力天平（RFB-LF，Precision Acoustics Ltd，英國）測量不同電功率下的聲功率。測量過程中，每種條件均測三組數據，取均值作為結果。受限于輻射力天平的測量功率范圍，實驗中僅測量低于10 W的聲功率。
峰值電功率調節：單片機通過串口與數字可調電源建立通信，調節功放的輸入電源VCC，從而改變輸出波形的峰峰值，實現峰值電功率調節。結果如表2所示，以二次多項式進行擬合，如式(2)所示：
表2
峰值電功率調節的結果
Table2.
The result of peak electrical power regulation
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式中，P聲代表測量的聲功率，u為電源VCC的電壓值，擬合結果的決定系數R2=0.999 45，擬合效果較好。而實際電路中電源VCC的最大輸出電壓為24 V，計算可知最大聲功率約為22.4 W。
有效電功率調節：設置電源VCC為10 V，調節PWM信號的占空比，測量相應的聲功率，結果如表3所示。以一次函數進行擬合，如式(3)所示：
表3
有效電功率調節的結果
Table3.
The result of effective electrical power regulation
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其中， 為PWM信號的占空比，擬合結果的決定系數R2 = 0.998 28，表明聲功率與占空比 具有較好的線性相關性。
綜上所述，輸出聲功率P聲與VCC電壓u和PWM信號占空比λ的關系如式(4)所示：
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計算聲功率與電功率的比值，可知系統的總電聲轉換效率約19%，影響因素主要有換能器的機電耦合系數、功率放大電路的工作效率等。
2.1.3 工作頻率
通過STM32的高級定時器1產生不同頻率的信號源，并用示波器獲取負載兩端的波形，根據波形的振鈴、失真等情況，判斷電路是否正常工作，從而確定電路的工作頻率。由于超聲換能器的阻抗隨頻率在變化，因此以50 Ω金屬膜電阻作為負載。測試結果如下：
無諧波抑制功能時，電路的工作頻率為20 kHz～2 MHz。低于20 kHz時，輸出波形出現較大振鈴，原因是變壓器無法在此頻率內工作，需更換磁環材料，且增加繞線匝數；而高于2 MHz時，電路受限于MOSFET的開關速率。
添加諧波抑制功能后，工作頻率為100 kHz～1 MHz。低于100 kHz時，單片機的定時器無法產生足夠長的死區時間，需采取其他方案制作信號源；而諧波抑制功能要求電路具有更快的開關頻率，因此上限頻率下降至1 MHz。
2.2 石蠟包埋樣品脫蠟實驗
2.2.1 FFPE樣本脫蠟
為驗證本文HIFU裝置的有效性，本研究進行了FFPE脫蠟實驗，并與傳統的二甲苯脫蠟法和商用儀器M220進行對比。FFPE技術是一種常用的組織樣品保存方法，在醫學研究、臨床診斷等領域具有重要意義[26-27]。然而，從FFPE樣本中提取高質量的核酸分子具有較高難度，因為石蠟對組織的保護作用，阻礙了試劑的滲透[28-29]。傳統的脫蠟方法采用二甲苯溶劑，然而二甲苯具有毒性，威脅實驗人員的健康和自然環境，且脫蠟時間較長[30]。
本研究進行了以下對比實驗：分別采用本文HIFU裝置、二甲苯和商用儀器M220，對多份厚度為10 μm的小鼠肺部FFPE切片進行脫蠟處理，然后進行核酸提取與純化，以及擴增實驗，比較各方法的優劣。每種方法進行三組獨立實驗。
本文HIFU裝置的脫蠟過程如下：將2塊FFPE切片放置于含有組織裂解緩沖液和蛋白酶K的2.0 mL離心管中，在本文HIFU裝置上超聲6 min。其中，電源VCC設為15 V，PWM信號的周期為100 ms，占空比為20%，輸出電功率約8.9 W，輸出聲功率約1.7 W。
二甲苯脫蠟步驟如下：將2塊FFPE切片浸泡在二甲苯溶液中，劇烈渦旋10 s；離心棄上清，保留組織沉淀；加入無水乙醇，劇烈渦旋10 s；離心棄上清，保留組織沉淀；全過程約15 min。
商用儀器M220的脫蠟過程如下：將2塊FFPE切片裝入含有組織裂解緩沖液和蛋白酶K的試管microTUBE-500（Covaris Inc.，美國）中，在M220儀器上超聲6 min。其中，儀器的峰值電功率為75 W，占空比為20%，平均電功率約15 W，聲功率未知。
脫蠟后采用FFPE核酸提取純化試劑盒（truXTRAC FFPE NA，Covaris Inc.，美國），按照說明書分別提取DNA和RNA。
2.2.2 核酸濃度與純度分析
核酸的濃度和純度分別用熒光儀（Qubit 4，Thermo Fisher Scientific Inc.，美國）和分光光度計（NanoDrop 2000，Thermo Fisher Scientific Inc.，美國）測得，結果如表4所示。對于DNA，三種方法得到的A260/280比值和A260/230比值均在1.8～2.2之間，說明DNA純度較高，幾乎沒有蛋白和化學試劑殘留。對比RNA的濃度，本文HIFU裝置的脫蠟效果優于另外兩種方法。對比RNA的純度，本文HIFU裝置和商用儀器M220對應的A260/280比值都在1.8～2.2之間，而二甲苯脫蠟法對應的A260/280比值低于1.8，雖然三種提取方法對應的A260/230比值都低于1.8，但二甲苯脫蠟法的A260/230比值最低，說明本文HIFU裝置和商用儀器M220有助于去除后續核酸純化過程中的殘留蛋白和化學試劑。
表4
DNA和RNA的濃度和純度
Table4.
Concentration and purity of DNA and RNA
2.2.3 核酸擴增
對小鼠管家基因β-actin進行聚合酶鏈式反應，設計引物擴增207 bp長度的DNA片段，擴增后進行凝膠電泳實驗，結果如圖6所示。DNA擴增產物電泳圖中的標號1、2、3分別對應三種脫蠟方式：本文HIFU裝置、二甲苯脫蠟法和商用儀器M220；“—”表示陰性對照組；“M”為標記（marker）。使用科學圖像分析軟件ImageJ 1.53（National Institutes of Health，美國）對條帶積分灰度值進行歸一化，可以看出，采用三種脫蠟方式所提取出的DNA均具備良好的可擴增性，且電泳條帶積分灰度值之間無肉眼可見差異。
圖6
DNA擴增產物的電泳結果
Figure6.
Electrophoresis results of DNA amplification products
3 討論
超聲技術可應用于生物樣本處理，相對于傳統的水浴式和探頭式超聲，HIFU將超聲波聚焦在試管內部，能夠無接觸地處理樣本，具有功耗低、重復性好等優勢。目前商用的聚焦超聲儀器較少，且體積大、價格昂貴，不利于集成到自動化設備中。本研究設計的HIFU裝置體積小、成本低，可以實現樣品快速破碎，易于集成到便攜式設備、自動化平臺。
本文通過物理場仿真，對HIFU換能器的聲場進行了定性分析。換能器的工作頻率越高，聚焦范圍越小，能量越集中。針對不同的使用場景，應根據換能器的頻率、聚焦半徑、外直徑等參數進行選型。本文HIFU裝置適配實驗室常用的2.0 mL離心管，能夠完成FFPE脫蠟實驗。然而，仿真發現其錐形底部會吸收聲能而發熱，對超聲的功率會有一定限制。為規避該影響，應根據換能器尺寸設計合適的容器，使得容器底部的切平面與聲波的入射方向保持垂直，從而降低聲能損耗。
為高效、穩定地驅動HIFU換能器，本研究采用變壓器耦合的D類功率放大電路，并通過諧波抑制方法對電路進行改進，有效降低了輸出的三次諧波分量。本文通過調節電路輸出的峰值電功率和有效電功率，使超聲換能器輸出0～22.4 W的聲功率，滿足不同參數的超聲處理需求。
通過本文HIFU裝置、二甲苯和商用儀器M220對小鼠肺部FFPE樣品進行脫蠟實驗，結果如下：對比脫蠟效果，三種方式均能成功脫蠟，且提取的核酸具有可擴增性，能夠用于分子生物學檢測；對比DNA的濃度和純度，三種方法未見明顯差異；對比RNA的純度和濃度，本文HIFU裝置明顯優于二甲苯脫蠟法，與商用儀器M220的結果接近。對比擴增產物的電泳條帶，三種脫蠟方式無肉眼可見差異；對比脫蠟效率，二甲苯脫蠟過程中需要離心、渦旋等操作，而本文HIFU裝置和商用儀器M220操作流程簡單，減小了因操作人員所導致的實驗誤差，同時縮短了脫蠟時間；對比安全性，二甲苯具有毒性，不利于實驗人員的健康和環境保護。對比裝置體積：本文HIFU裝置體積較小，既可以作為獨立設備使用，也可以作為樣品前處理模塊，集成到核酸一體檢測設備中。
4 結論
為解決傳統超聲儀器存在交叉污染、樣本破碎不均勻等問題，本研究設計了一種小型化、低成本的HIFU裝置。首先通過物理仿真證明裝置的可行性，然后制作功率可調的HIFU換能器驅動電路，最后通過FFPE樣本脫蠟實驗測試裝置的有效性。實驗結果表明：相比于二甲苯脫蠟法，本文HIFU裝置具有更好的脫蠟效果、效率和安全性；而與商用儀器M220相比，本文HIFU裝置體積小、成本低。綜上所述，本文設計的小型化HIFU裝置有望應用于自動化核酸提取和純化設備中，在樣本前處理領域具有廣闊的應用前景。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：雷祝兵主要負責聲場仿真、機械、電路、編程和論文撰寫；龐欣佩負責生物實驗和論文修改；李力主要負責生物實驗設計與指導；梅茜指導工程設計和論文審閱修訂；董文飛主要負責項目整體指導和論文修訂。
