為了認識行角膜切削手術后兔眼角膜生物力學特性隨修復時間如何變化，本研究選取21只健康成年兔，左眼作為實驗眼，右眼作為對照眼，進行對比實驗。首先，對所有兔的左眼采用板層刀移除角膜前表面部分組織（原角膜厚度的30%～50%），作為模擬角膜屈光手術的動物模型。其次，將實驗兔分別飼養1個月、3個月、6個月后處死，利用其體外角膜制作條狀試樣，進行加卸載速率平均約為0.16 mm/s的單軸拉伸實驗；最后，利用黏—超彈性本構模型，對加卸載數據進行擬合。結果顯示，模擬手術后1個月、3個月，實驗眼與對照眼角膜的黏彈性參數差異具有統計學意義；術后3個月，實驗眼角膜與對照眼角膜，在應變水平分別為0.02、0.05時，其切向模量差異具有統計學意義；術后6個月組的實驗眼角膜與對照眼角膜，生物力學參數差異無統計學意義。上述結果表明，與對照眼相比，實驗眼角膜生物力學特性隨術后時間有所變化，術后3個月實驗眼與對照眼之間角膜的切向模量的比值增大，隨后減小；這為基于臨床上獲取的快速測試數據認識角膜屈光手術術后角膜生物力學特性奠定了前期基礎。
引用本文： 張迪, 張海霞, 李林. 基于快速加卸載的單軸拉伸識別屈光術后兔角膜的生物力學特性. 生物醫學工程學雜志, 2024, 41(1): 136-143. doi: 10.7507/1001-5515.202306041 復制
0 引言
我國是近視的高發國家，行角膜屈光手術的患者數量龐大。目前的角膜屈光手術（下文簡稱為手術）主要是通過移除部分角膜組織，以使角膜的形態發生改變，進而矯正屈光不正。臨床的隨訪發現，手術后有些患者會出現屈光回退[1-2]、甚至角膜膨隆[3-4]，上述問題的發生可能與手術后角膜生物力學特性密切相關。
目前，臨床上可用于測試角膜生物力學信息的設備有眼反應分析儀（ocular response analyzer，ORA）和可視化角膜生物力學分析儀（corneal visualization Scheimpflug technology，CVS）。兩種設備都是利用空氣脈沖使角膜發生快速變形，從而獲得角膜的生物力學相關性參數。對手術后患者隨訪結果顯示，生物力學相關性參數隨術后時間的延長產生波動性變化[5]；手術后1個月、3個月相對于手術后 1 周時的角膜，其頂點最大變形幅度與位于距離角膜頂點2 mm 處點的變形幅度的比值會下降[6-7]。然而，也有研究顯示，角膜生物力學相關性參數手術后基本維持在相對穩定的狀態[8]。動物眼手術后1個月時，體外正常速率加載的單軸拉伸實驗表明，施行手術后的手術眼角膜的彈性模量大于未施手術的原始對照眼[9-10]，且手術眼角膜的應力松弛極限較對照眼有增大的趨勢[9]。研究表明，手術后角膜生物力學特性較術前有所改變，但其隨術后恢復時間變化的規律尚不清晰。由于角膜是具有黏彈性的生物軟組織，加載速率會對角膜力學行為產生影響[11]，為了充分利用臨床上ORA和CVS的測試數據，認識角膜生物力學特性隨手術后時間的變化規律，因此有必要探索在快速加載速率下，手術后角膜生物力學特性的識別方法，這對手術后療效評估、康復手段的調整，以及手術前手術方案的設計都具有重要意義。
本研究利用板層刀移除實驗兔眼角膜前表面部分組織，對角膜屈光手術進行模擬（以下簡稱為模擬手術），分別將實驗兔飼養1個月、3個月、6個月后處死，將其體外角膜制作成條狀試樣，并在快速加載速率下進行單軸拉伸實驗，基于黏—超彈性本構模型和實驗數據確定模擬手術后角膜的非線性、黏彈性特性，探討模擬手術后角膜生物力學特性隨時間的變化情況，以期更好地認識基于臨床上快速變形下的數據，為確定手術后角膜生物力學特性提供前期研究基礎。
1 材料和方法
1.1 動物模型的構建
本研究自首都醫科大學實驗動物中心選取了21只健康無眼疾的7月齡新西蘭大白兔進行模擬手術，以構建本研究所需的動物模型。根據術前兔的體重，從小到大依次編號為1、2、…、21，根據編號除以3的余數，將兔隨機均分為3組：① 術后1個月組（余數為1）；② 術后3個月組（余數為2）；③ 術后6個月組（余數為0）。模擬手術的術前準備、模擬手術過程及術后護理，本課題組前期已有詳細的描述，具體詳情請參見文獻[12]，現簡述如下：術前使用裂隙燈對兔眼進行眼前節檢查，排除眼前節病變；使用超聲角膜測厚儀（SP3000，TOMEY Corp.，日本）測量中央角膜厚度（central corneal thickness，CCT）。
模擬手術采用機械板層刀（KM-5000，無錫康寧醫療器械有限公司，中國）將兔角膜前表面的部分組織移除，移除的角膜組織直徑為6 mm，厚度為術前角膜厚度的30%～50%。本文實驗將左眼作為實驗眼，右眼作為自身對照的對照眼。術后，對實驗兔進行護理，分別飼養1個月、3個月和6個月。本研究經過首都醫科大學倫理委員會批準（批文編號：AEEI-2014-066），實驗過程中的相關處理符合動物福利。
1.2 單軸拉伸測試
關于角膜條狀試樣的制備、單軸拉伸實驗的過程詳見本課題組之前的研究文獻[9, 12]。現簡述如下：將兔飼養至術后指定時間，利用超聲角膜測厚儀測量角膜厚度。之后沿兔耳緣靜脈注射濃度為25%的烏拉坦，將其麻醉致死，半小時內完成角膜取材與角膜條狀試樣的制備。其中角膜條狀試樣是利用自制的雙刃刀，沿眼球上下方向制作而成。之后，利用游標卡尺測量試樣的長度和寬度。所制備的角膜條狀試樣尺寸如表1所示。
表1
角膜條狀試樣的尺寸
Table1.
Size of corneal strip specimens
在室溫下進行單軸拉伸實驗，所用設備為生物原位疲勞試驗機測試系統（IBTC-50，凱爾測控試驗系統有限公司，中國）。為了使試樣保持水潤，在測試過程中采用了水浴裝置。每個試樣進行以10 s為1個循環，平均加載速率約為0.16 mm/s、最大拉伸幅度為角膜條狀試樣原長10%的預載，共進行6個循環。之后，選取第6個遲滯環的數據進行后續分析。
1.3 數據分析
關于快速加載速率下單軸拉伸實驗獲得的應力—應變數據的處理與分析，可參見本課題組前期已發表文獻[13]，現簡述如下。角膜是一種具有高度非線性彈性行為和一定黏度的幾乎不可壓縮的生物軟組織材料[14]。基于應變能密度函數的黏—超彈性模型如式(1)所示，已被證明能夠描述角膜的非線性和黏彈性特性[15-17]：
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其中，G、U分別是應力松弛函數和應變能密度函數，分別由2階普羅尼（Prony）級數模型和不可壓縮的1階奧格登（Ogden）模型給出，如式(2)～式(3)所示；t時刻的柯西應力σ = σnomλ，其中名義應力σnom = F/A（F為單軸拉伸實驗過程中的拉力，A為初始狀態下角膜條狀試樣的橫截面積）；沿試樣長度方向的伸長比λ = (l0 + ?l)/l0，?l、l0 分別為單軸拉伸測試中沿試樣長度方向的位移與試樣的原長；s是積分變量，表示時間。
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式(2)中，A1、A2、τ1、τ2為應力松弛參數，e為指數函數的底數，t表示時間。式(3)中μ、α為彈性參數，λ1、λ2、λ3分別表示在單軸拉伸實驗過程中沿試樣長度、寬度和厚度方向的伸長比。將角膜視為不可壓縮性材料，即λ1·λ2·λ3 = 1，假設在實驗過程中沿試樣厚度與寬度方向的伸長比相等，用λ表示拉伸方向的伸長比，就有λ2 = λ3 = λ?1/2，因此式(3)可以用式(4)表示：
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采用科學計算軟件MATLAB（R2020b，MathWorks Inc.，美國）中的遺傳算法，通過計算目標函數RM的最小值，進而識別黏—超彈性模型中的參數（彈性參數μ、α，應力松弛參數A1、A2、τ1、τ2），參數范圍的選取參見本課題組前期已發表文獻[13]，RM的計算公式如式(5)所示：
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式(5)中，σiex、σic分別表示在第i個時間點的單軸拉伸實驗獲取的應力值和式(1)計算的應力值，95表示在1個周期中均勻選擇的總時間點數。
將角膜視為不可壓縮性材料，基于1階奧格登模型所對應的應變能密度函數，可以獲得角膜的切向模量Et，如式(6)所示：
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應變能為物體發生變形的過程中貯存在其內部的勢能。軟組織在加卸載過程中會有應變能的損失[18]。本文通過計算第6個遲滯環的應力—應變曲線所圍成的面積，即損失的應變能密度，來表示角膜的黏彈性特性。
1.4 統計分析
所有數據均在統計分析軟件SPSS（V 23.0，IBM Corp.，美國）中進行。用夏皮羅-威爾克（Shapiro-Wilk，S-W）檢驗，對參數進行正態性檢驗。所有參數采用均數±標準差進行表示。采用單因素方差分析或克魯斯卡爾-沃利斯（Kruskal-Wallis，K-W）檢驗比較識別的模擬手術后1個月、3個月和6個月角膜的黏—超彈性模型參數的差異性；采用配對t檢驗或威爾科克森（Wilcoxon）符號秩和檢驗，分析比較識別的模擬手術后每個時間點上實驗眼與對照眼之間的黏—超彈性模型參數的差異性，檢驗水準為0.05。
2 結果
2.1 快速加卸載的遲滯環曲線
快速加卸載速率下的單軸拉伸實驗獲得的應力—應變曲線，所構成的遲滯環如圖1所示。可以看出遲滯環的最后兩環基本重合，這表明遲滯環已達到穩定狀態。由圖1可知，模擬手術后3個月，實驗眼與對照眼之間損失的應變能密度差距有增大的趨勢。
圖1
遲滯環與損失的應變能密度
Figure1.
Hysteresis loop and strain energy density
2.2 確定的模擬手術后不同時間角膜的黏—超彈性模型的參數
識別的術后1個月、3個月和6個月角膜的黏—超彈性模型參數如表2、表3所示，其中擬合優度R2 > 0.98，*代表實驗眼與對照眼之間差異有統計學意義。經配對t檢驗知，實驗眼與對照眼相比，術后1個月，應力松弛參數A2減小［MD = ? 0.093（? 0.137，? 0.048），P < 0.01］；術后3個月，彈性參數μ增大［MD = 0.039（0.018，0.060），P < 0.01］，應力松弛參數A2減小［MD = ? 0.007（? 0.137，? 0.048），P = 0.035］。在術后各時間點上其他參數差異均無統計學意義。
表2
確定的角膜的非線性彈性參數
Table2.
Determined nonlinear elastic parameters of the cornea
表3
確定的角膜的應力松弛參數
Table3.
Determined stress relaxation parameters of the cornea
2.3 模擬手術后不同時間角膜的切向模量
在應變水平分別為0.02、0.05時，角膜的切向模量如圖2所示。經配對t檢驗知，在相同的應變水平下，模擬手術后3個月，實驗眼與對照眼之間角膜的切向模量差異有統計學意義{應變水平為0.02時：［MD = 0.265（0.111，0.418），P < 0.01］，應變水平為0.05時：［MD = 1.341（0.379，2.304），P = 0.014］}，表現為實驗眼角膜的切向模量大于對照眼。
圖2
模擬手術后不同時間角膜的切向模量
Figure2.
Tangential modulus of cornea at the different time points after simulating surgery
實驗眼與對照眼之間角膜切向模量的比值如圖3所示。經K-W檢驗知，應變水平為0.02時，在術后的1個月與3個月之間角膜切向模量的比值差異有統計學意義（檢驗統計量H = ? 8.857，P = 0.023）；應變水平為0.05時，在術后各時間點之間，角膜切向模量的比值差異無統計學意義（P = 0.126）。但在兩個應變水平下，隨術后時間的推移實驗眼與對照眼之間角膜切向模量的比值均表現為先增大后減小的變化趨勢。
圖3
模擬手術后不同時間實驗眼與對照眼之間角膜切向模量的比值
Figure3.
The ratio of corneal tangential modulus between the experimental and the control eyes at the different time points after simulating surgery
2.4 模擬手術后不同時間角膜的應力松弛參數
根據確定的應力松弛參數，獲得了術后不同時間實驗眼與對照眼之間角膜應力松弛極限（1-A1-A2）的比值，如圖4所示。經Wilcoxon符號秩和檢驗知，術后1個月和3個月，實驗眼角膜的應力松弛極限均大于對照眼（術后1個月：檢驗統計量Z = 2.366，P = 0.018；術后3個月：檢驗統計量Z = 2.028，P = 0.043）；術后6個月，實驗眼與對照眼之間角膜的應力松弛極限差異無統計學意義（P = 0.176）；經K-W檢驗知，在術后各時間點之間，角膜應力松弛極限的比值差異無統計學意義（P = 0.530）。
圖4
模擬手術后角膜的應力松弛極限
Figure4.
Stress relaxation limits of cornea after simulating surgery
3 討論
臨床上實施角膜屈光手術后，角膜變薄和角膜生物力學特性的改變是手術后屈光回退與醫源性角膜膨隆的重要危險因素[19-20]。手術后的過矯或欠矯等問題，也可能與手術前以及手術后對角膜生物力學特性認識不足密切相關[21]。研究者期望利用ORA或CVS在快速空氣脈沖下測試的臨床數據獲取角膜生物力學特性。由于不同加卸載速率下的力學測試得到的角膜力學特性不同[11, 13]，因此基于臨床測試數據獲得的角膜生物力學特性，與體外力學測試結果差異的原因也與加載速率不同相關。為了更好地認識基于快速變形信息識別的手術后角膜生物力學特性隨術后時間的變化情況，本研究基于黏—超彈性本構模型，分析模擬手術后1個月、3個月和6個月，兔眼角膜條狀試樣在快速加載速率下的單軸拉伸實驗數據，探討了快速加載速率下識別的模擬手術后角膜生物力學特性隨時間的變化情況。結果顯示術后1個月、3個月，實驗眼角膜的黏—超彈性模型參數與對照眼相比明顯不同，并且實驗眼與對照眼之間角膜切向模量的比值隨術后時間有所變化。
本研究結果顯示模擬手術后1個月、3個月、6個月，實驗眼角膜的切向模量分別為（2.380 ± 0.596）MPa、（3.135 ± 0.756）MPa、（2.421 ± 0.724）MPa，與文獻[12]慢速加載速率下獲得的實驗眼角膜彈性模量的比值分別為1.35、1.50、1.33；而未施手術的原始對照眼角膜條狀試樣在快、慢速加載速率下所獲得的切向模量的比值為1.76[13]。在快、慢速加載速率下，角膜切向模量或彈性模量的比值均大于1，說明快速加卸載測試所得彈性模量均大于慢速情況。比值不同，說明實驗眼角膜生物力學特性隨術后時間發生變化。進一步，考察實驗眼與對照眼之間角膜切向模量的比值隨術后時間的變化情況。本文圖3顯示，這一比值在術后1個月時略大于1，術后3個月時明顯增大，術后6個月時回落。慢速加載情況下實驗眼與對照眼之間角膜切向模量的比值在術后1個月、3個月、6個月時均增大明顯，但增大程度逐漸降低。由于本文與本課題組前期研究（文獻[12]）慢速加載實驗采用的是同一角膜試樣，因此，快、慢速加載速率下識別的模擬手術后角膜生物力學特性隨術后時間表現出的不同變化趨勢，可能源于加載速率的不同。
模擬手術后不同時間角膜的應力松弛極限的結果顯示，術后1個月、3個月，實驗眼角膜的應力松弛極限均大于對照眼；術后6個月，兩者之間應力松弛極限的差異無統計學意義，這與文獻[9]提及的手術后1個月實驗眼角膜的應力松弛極限增大的結果相符。此外，本研究還發現術后3個月，實驗眼角膜損失的應變能密度與對照眼相比有增大的趨勢。本文的研究結果表明，隨術后時間的持續，角膜的黏彈性特性會發生改變。
綜合考慮前期研究（文獻[10，12]）及本研究結果，可以看出角膜屈光手術后角膜生物力學特性隨術后時間有一定的改變。手術后角膜生物力學特性的這種改變，可以在一定程度上解釋手術后角膜形態、經ORA或CVS測試的力學相關性參數隨術后時間的持續而發生改變。例如手術后6個月內角膜中央后表面高度[22]、角膜生物力學相關性參數隨術后時間持續會發生波動[23]。事實上，由于手術后3個月與6個月之間角膜的CCT、眼壓（intraocular pressure，IOP）維持相對穩定[24-25]，因此，角膜生物力學特性的改變導致了在相對穩定IOP狀態下角膜形態的細微變化。
根據拉普拉斯定律，在IOP作用下手術后角膜的應力會增大，角膜應力狀態的改變可能會影響角膜上皮細胞的增殖和遷移[26]。有研究已證實，手術后角膜上皮會發生重塑[27-28]。此外，手術中移除的角膜組織主要位于角膜基質層，角膜基質層作為角膜的主要承載部分，主要由規則排列的膠原纖維板層構成，手術后角膜應力狀態的改變，也可能會影響角膜膠原纖維的卷曲狀態[29]，進而影響角膜生物力學特性。
目前臨床上可用于測試角膜生物力學信息的兩種設備ORA和CVS，均是利用空氣脈沖使角膜發生快速變形。研究者期望利用兩者獲取的角膜變形的數據，識別角膜在體生物力學特性，進而將角膜生物力學特性應用于手術術后療效評估、康復手段調整，以及手術方案設計當中。作為生物軟組織的角膜，加載速率對其力學行為會產生影響[11]，通過實驗測試獲得的力學特性也具有應變率依賴性。本研究進一步揭示了快、慢速加載速率下獲得的角膜的生物力學特性具有差異性。將來需要進一步構建快速與慢速加載速率下識別的角膜生物力學特性之間的定量關系，為進一步基于臨床上獲取的快速測試條件下角膜的變形數據識別手術后角膜生物力學特性奠定研究基礎。
本研究存在一些局限性：① 樣本量較少，需要進一步進行相關探索，包括適當的增加樣本量和延長觀察時間來證實以上的研究結果。② 在生理狀態下角膜的應變較小，本研究所采用的應變比生理狀態大。受限于目前的試驗機，在較小的應變范圍內無法做到快速的加載。為了探索快速加載識別的材料參數，本研究設定了在較大應變情況下，利用快速加載獲得的實驗數據來識別角膜的生物力學特性。③ 為了降低因角膜方向的不同所產生的差異性，本研究所制備的角膜條試樣均源于眼球同一方向。今后應進一步考察沿角膜其他方向時的生物力學特性，以便更加全面地認識手術后角膜生物力學特性是如何變化的，以期更好地為角膜屈光手術的優化設計提供指導。
4 結論
實驗眼與對照眼相比，角膜生物力學特性隨術后時間持續有所變化，其角膜切向模量的比值略大于1，黏彈性特性有所減弱。實驗眼與對照眼之間角膜的切向模量在術后3個月時的差異有統計學意義。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：張迪主要負責實驗設計、數據收集與分析、論文撰寫及資金支持；張海霞主要負責提供實驗與數據分析指導、論文審閱修訂及資金支持；李林主要負責實驗思路構思及論文審閱修訂。
倫理聲明：本研究通過了首都醫科大學倫理委員會批準（批文編號：AEEI-2014-066）。
0 引言
我國是近視的高發國家，行角膜屈光手術的患者數量龐大。目前的角膜屈光手術（下文簡稱為手術）主要是通過移除部分角膜組織，以使角膜的形態發生改變，進而矯正屈光不正。臨床的隨訪發現，手術后有些患者會出現屈光回退[1-2]、甚至角膜膨隆[3-4]，上述問題的發生可能與手術后角膜生物力學特性密切相關。
目前，臨床上可用于測試角膜生物力學信息的設備有眼反應分析儀（ocular response analyzer，ORA）和可視化角膜生物力學分析儀（corneal visualization Scheimpflug technology，CVS）。兩種設備都是利用空氣脈沖使角膜發生快速變形，從而獲得角膜的生物力學相關性參數。對手術后患者隨訪結果顯示，生物力學相關性參數隨術后時間的延長產生波動性變化[5]；手術后1個月、3個月相對于手術后 1 周時的角膜，其頂點最大變形幅度與位于距離角膜頂點2 mm 處點的變形幅度的比值會下降[6-7]。然而，也有研究顯示，角膜生物力學相關性參數手術后基本維持在相對穩定的狀態[8]。動物眼手術后1個月時，體外正常速率加載的單軸拉伸實驗表明，施行手術后的手術眼角膜的彈性模量大于未施手術的原始對照眼[9-10]，且手術眼角膜的應力松弛極限較對照眼有增大的趨勢[9]。研究表明，手術后角膜生物力學特性較術前有所改變，但其隨術后恢復時間變化的規律尚不清晰。由于角膜是具有黏彈性的生物軟組織，加載速率會對角膜力學行為產生影響[11]，為了充分利用臨床上ORA和CVS的測試數據，認識角膜生物力學特性隨手術后時間的變化規律，因此有必要探索在快速加載速率下，手術后角膜生物力學特性的識別方法，這對手術后療效評估、康復手段的調整，以及手術前手術方案的設計都具有重要意義。
本研究利用板層刀移除實驗兔眼角膜前表面部分組織，對角膜屈光手術進行模擬（以下簡稱為模擬手術），分別將實驗兔飼養1個月、3個月、6個月后處死，將其體外角膜制作成條狀試樣，并在快速加載速率下進行單軸拉伸實驗，基于黏—超彈性本構模型和實驗數據確定模擬手術后角膜的非線性、黏彈性特性，探討模擬手術后角膜生物力學特性隨時間的變化情況，以期更好地認識基于臨床上快速變形下的數據，為確定手術后角膜生物力學特性提供前期研究基礎。
1 材料和方法
1.1 動物模型的構建
本研究自首都醫科大學實驗動物中心選取了21只健康無眼疾的7月齡新西蘭大白兔進行模擬手術，以構建本研究所需的動物模型。根據術前兔的體重，從小到大依次編號為1、2、…、21，根據編號除以3的余數，將兔隨機均分為3組：① 術后1個月組（余數為1）；② 術后3個月組（余數為2）；③ 術后6個月組（余數為0）。模擬手術的術前準備、模擬手術過程及術后護理，本課題組前期已有詳細的描述，具體詳情請參見文獻[12]，現簡述如下：術前使用裂隙燈對兔眼進行眼前節檢查，排除眼前節病變；使用超聲角膜測厚儀（SP3000，TOMEY Corp.，日本）測量中央角膜厚度（central corneal thickness，CCT）。
模擬手術采用機械板層刀（KM-5000，無錫康寧醫療器械有限公司，中國）將兔角膜前表面的部分組織移除，移除的角膜組織直徑為6 mm，厚度為術前角膜厚度的30%～50%。本文實驗將左眼作為實驗眼，右眼作為自身對照的對照眼。術后，對實驗兔進行護理，分別飼養1個月、3個月和6個月。本研究經過首都醫科大學倫理委員會批準（批文編號：AEEI-2014-066），實驗過程中的相關處理符合動物福利。
1.2 單軸拉伸測試
關于角膜條狀試樣的制備、單軸拉伸實驗的過程詳見本課題組之前的研究文獻[9, 12]。現簡述如下：將兔飼養至術后指定時間，利用超聲角膜測厚儀測量角膜厚度。之后沿兔耳緣靜脈注射濃度為25%的烏拉坦，將其麻醉致死，半小時內完成角膜取材與角膜條狀試樣的制備。其中角膜條狀試樣是利用自制的雙刃刀，沿眼球上下方向制作而成。之后，利用游標卡尺測量試樣的長度和寬度。所制備的角膜條狀試樣尺寸如表1所示。
表1
角膜條狀試樣的尺寸
Table1.
Size of corneal strip specimens
在室溫下進行單軸拉伸實驗，所用設備為生物原位疲勞試驗機測試系統（IBTC-50，凱爾測控試驗系統有限公司，中國）。為了使試樣保持水潤，在測試過程中采用了水浴裝置。每個試樣進行以10 s為1個循環，平均加載速率約為0.16 mm/s、最大拉伸幅度為角膜條狀試樣原長10%的預載，共進行6個循環。之后，選取第6個遲滯環的數據進行后續分析。
1.3 數據分析
關于快速加載速率下單軸拉伸實驗獲得的應力—應變數據的處理與分析，可參見本課題組前期已發表文獻[13]，現簡述如下。角膜是一種具有高度非線性彈性行為和一定黏度的幾乎不可壓縮的生物軟組織材料[14]。基于應變能密度函數的黏—超彈性模型如式(1)所示，已被證明能夠描述角膜的非線性和黏彈性特性[15-17]：
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其中，G、U分別是應力松弛函數和應變能密度函數，分別由2階普羅尼（Prony）級數模型和不可壓縮的1階奧格登（Ogden）模型給出，如式(2)～式(3)所示；t時刻的柯西應力σ = σnomλ，其中名義應力σnom = F/A（F為單軸拉伸實驗過程中的拉力，A為初始狀態下角膜條狀試樣的橫截面積）；沿試樣長度方向的伸長比λ = (l0 + ?l)/l0，?l、l0 分別為單軸拉伸測試中沿試樣長度方向的位移與試樣的原長；s是積分變量，表示時間。
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式(2)中，A1、A2、τ1、τ2為應力松弛參數，e為指數函數的底數，t表示時間。式(3)中μ、α為彈性參數，λ1、λ2、λ3分別表示在單軸拉伸實驗過程中沿試樣長度、寬度和厚度方向的伸長比。將角膜視為不可壓縮性材料，即λ1·λ2·λ3 = 1，假設在實驗過程中沿試樣厚度與寬度方向的伸長比相等，用λ表示拉伸方向的伸長比，就有λ2 = λ3 = λ?1/2，因此式(3)可以用式(4)表示：
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采用科學計算軟件MATLAB（R2020b，MathWorks Inc.，美國）中的遺傳算法，通過計算目標函數RM的最小值，進而識別黏—超彈性模型中的參數（彈性參數μ、α，應力松弛參數A1、A2、τ1、τ2），參數范圍的選取參見本課題組前期已發表文獻[13]，RM的計算公式如式(5)所示：
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式(5)中，σiex、σic分別表示在第i個時間點的單軸拉伸實驗獲取的應力值和式(1)計算的應力值，95表示在1個周期中均勻選擇的總時間點數。
將角膜視為不可壓縮性材料，基于1階奧格登模型所對應的應變能密度函數，可以獲得角膜的切向模量Et，如式(6)所示：
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應變能為物體發生變形的過程中貯存在其內部的勢能。軟組織在加卸載過程中會有應變能的損失[18]。本文通過計算第6個遲滯環的應力—應變曲線所圍成的面積，即損失的應變能密度，來表示角膜的黏彈性特性。
1.4 統計分析
所有數據均在統計分析軟件SPSS（V 23.0，IBM Corp.，美國）中進行。用夏皮羅-威爾克（Shapiro-Wilk，S-W）檢驗，對參數進行正態性檢驗。所有參數采用均數±標準差進行表示。采用單因素方差分析或克魯斯卡爾-沃利斯（Kruskal-Wallis，K-W）檢驗比較識別的模擬手術后1個月、3個月和6個月角膜的黏—超彈性模型參數的差異性；采用配對t檢驗或威爾科克森（Wilcoxon）符號秩和檢驗，分析比較識別的模擬手術后每個時間點上實驗眼與對照眼之間的黏—超彈性模型參數的差異性，檢驗水準為0.05。
2 結果
2.1 快速加卸載的遲滯環曲線
快速加卸載速率下的單軸拉伸實驗獲得的應力—應變曲線，所構成的遲滯環如圖1所示。可以看出遲滯環的最后兩環基本重合，這表明遲滯環已達到穩定狀態。由圖1可知，模擬手術后3個月，實驗眼與對照眼之間損失的應變能密度差距有增大的趨勢。
圖1
遲滯環與損失的應變能密度
Figure1.
Hysteresis loop and strain energy density
2.2 確定的模擬手術后不同時間角膜的黏—超彈性模型的參數
識別的術后1個月、3個月和6個月角膜的黏—超彈性模型參數如表2、表3所示，其中擬合優度R2 > 0.98，*代表實驗眼與對照眼之間差異有統計學意義。經配對t檢驗知，實驗眼與對照眼相比，術后1個月，應力松弛參數A2減小［MD = ? 0.093（? 0.137，? 0.048），P < 0.01］；術后3個月，彈性參數μ增大［MD = 0.039（0.018，0.060），P < 0.01］，應力松弛參數A2減小［MD = ? 0.007（? 0.137，? 0.048），P = 0.035］。在術后各時間點上其他參數差異均無統計學意義。
表2
確定的角膜的非線性彈性參數
Table2.
Determined nonlinear elastic parameters of the cornea
表3
確定的角膜的應力松弛參數
Table3.
Determined stress relaxation parameters of the cornea
2.3 模擬手術后不同時間角膜的切向模量
在應變水平分別為0.02、0.05時，角膜的切向模量如圖2所示。經配對t檢驗知，在相同的應變水平下，模擬手術后3個月，實驗眼與對照眼之間角膜的切向模量差異有統計學意義{應變水平為0.02時：［MD = 0.265（0.111，0.418），P < 0.01］，應變水平為0.05時：［MD = 1.341（0.379，2.304），P = 0.014］}，表現為實驗眼角膜的切向模量大于對照眼。
圖2
模擬手術后不同時間角膜的切向模量
Figure2.
Tangential modulus of cornea at the different time points after simulating surgery
實驗眼與對照眼之間角膜切向模量的比值如圖3所示。經K-W檢驗知，應變水平為0.02時，在術后的1個月與3個月之間角膜切向模量的比值差異有統計學意義（檢驗統計量H = ? 8.857，P = 0.023）；應變水平為0.05時，在術后各時間點之間，角膜切向模量的比值差異無統計學意義（P = 0.126）。但在兩個應變水平下，隨術后時間的推移實驗眼與對照眼之間角膜切向模量的比值均表現為先增大后減小的變化趨勢。
圖3
模擬手術后不同時間實驗眼與對照眼之間角膜切向模量的比值
Figure3.
The ratio of corneal tangential modulus between the experimental and the control eyes at the different time points after simulating surgery
2.4 模擬手術后不同時間角膜的應力松弛參數
根據確定的應力松弛參數，獲得了術后不同時間實驗眼與對照眼之間角膜應力松弛極限（1-A1-A2）的比值，如圖4所示。經Wilcoxon符號秩和檢驗知，術后1個月和3個月，實驗眼角膜的應力松弛極限均大于對照眼（術后1個月：檢驗統計量Z = 2.366，P = 0.018；術后3個月：檢驗統計量Z = 2.028，P = 0.043）；術后6個月，實驗眼與對照眼之間角膜的應力松弛極限差異無統計學意義（P = 0.176）；經K-W檢驗知，在術后各時間點之間，角膜應力松弛極限的比值差異無統計學意義（P = 0.530）。
圖4
模擬手術后角膜的應力松弛極限
Figure4.
Stress relaxation limits of cornea after simulating surgery
3 討論
臨床上實施角膜屈光手術后，角膜變薄和角膜生物力學特性的改變是手術后屈光回退與醫源性角膜膨隆的重要危險因素[19-20]。手術后的過矯或欠矯等問題，也可能與手術前以及手術后對角膜生物力學特性認識不足密切相關[21]。研究者期望利用ORA或CVS在快速空氣脈沖下測試的臨床數據獲取角膜生物力學特性。由于不同加卸載速率下的力學測試得到的角膜力學特性不同[11, 13]，因此基于臨床測試數據獲得的角膜生物力學特性，與體外力學測試結果差異的原因也與加載速率不同相關。為了更好地認識基于快速變形信息識別的手術后角膜生物力學特性隨術后時間的變化情況，本研究基于黏—超彈性本構模型，分析模擬手術后1個月、3個月和6個月，兔眼角膜條狀試樣在快速加載速率下的單軸拉伸實驗數據，探討了快速加載速率下識別的模擬手術后角膜生物力學特性隨時間的變化情況。結果顯示術后1個月、3個月，實驗眼角膜的黏—超彈性模型參數與對照眼相比明顯不同，并且實驗眼與對照眼之間角膜切向模量的比值隨術后時間有所變化。
本研究結果顯示模擬手術后1個月、3個月、6個月，實驗眼角膜的切向模量分別為（2.380 ± 0.596）MPa、（3.135 ± 0.756）MPa、（2.421 ± 0.724）MPa，與文獻[12]慢速加載速率下獲得的實驗眼角膜彈性模量的比值分別為1.35、1.50、1.33；而未施手術的原始對照眼角膜條狀試樣在快、慢速加載速率下所獲得的切向模量的比值為1.76[13]。在快、慢速加載速率下，角膜切向模量或彈性模量的比值均大于1，說明快速加卸載測試所得彈性模量均大于慢速情況。比值不同，說明實驗眼角膜生物力學特性隨術后時間發生變化。進一步，考察實驗眼與對照眼之間角膜切向模量的比值隨術后時間的變化情況。本文圖3顯示，這一比值在術后1個月時略大于1，術后3個月時明顯增大，術后6個月時回落。慢速加載情況下實驗眼與對照眼之間角膜切向模量的比值在術后1個月、3個月、6個月時均增大明顯，但增大程度逐漸降低。由于本文與本課題組前期研究（文獻[12]）慢速加載實驗采用的是同一角膜試樣，因此，快、慢速加載速率下識別的模擬手術后角膜生物力學特性隨術后時間表現出的不同變化趨勢，可能源于加載速率的不同。
模擬手術后不同時間角膜的應力松弛極限的結果顯示，術后1個月、3個月，實驗眼角膜的應力松弛極限均大于對照眼；術后6個月，兩者之間應力松弛極限的差異無統計學意義，這與文獻[9]提及的手術后1個月實驗眼角膜的應力松弛極限增大的結果相符。此外，本研究還發現術后3個月，實驗眼角膜損失的應變能密度與對照眼相比有增大的趨勢。本文的研究結果表明，隨術后時間的持續，角膜的黏彈性特性會發生改變。
綜合考慮前期研究（文獻[10，12]）及本研究結果，可以看出角膜屈光手術后角膜生物力學特性隨術后時間有一定的改變。手術后角膜生物力學特性的這種改變，可以在一定程度上解釋手術后角膜形態、經ORA或CVS測試的力學相關性參數隨術后時間的持續而發生改變。例如手術后6個月內角膜中央后表面高度[22]、角膜生物力學相關性參數隨術后時間持續會發生波動[23]。事實上，由于手術后3個月與6個月之間角膜的CCT、眼壓（intraocular pressure，IOP）維持相對穩定[24-25]，因此，角膜生物力學特性的改變導致了在相對穩定IOP狀態下角膜形態的細微變化。
根據拉普拉斯定律，在IOP作用下手術后角膜的應力會增大，角膜應力狀態的改變可能會影響角膜上皮細胞的增殖和遷移[26]。有研究已證實，手術后角膜上皮會發生重塑[27-28]。此外，手術中移除的角膜組織主要位于角膜基質層，角膜基質層作為角膜的主要承載部分，主要由規則排列的膠原纖維板層構成，手術后角膜應力狀態的改變，也可能會影響角膜膠原纖維的卷曲狀態[29]，進而影響角膜生物力學特性。
目前臨床上可用于測試角膜生物力學信息的兩種設備ORA和CVS，均是利用空氣脈沖使角膜發生快速變形。研究者期望利用兩者獲取的角膜變形的數據，識別角膜在體生物力學特性，進而將角膜生物力學特性應用于手術術后療效評估、康復手段調整，以及手術方案設計當中。作為生物軟組織的角膜，加載速率對其力學行為會產生影響[11]，通過實驗測試獲得的力學特性也具有應變率依賴性。本研究進一步揭示了快、慢速加載速率下獲得的角膜的生物力學特性具有差異性。將來需要進一步構建快速與慢速加載速率下識別的角膜生物力學特性之間的定量關系，為進一步基于臨床上獲取的快速測試條件下角膜的變形數據識別手術后角膜生物力學特性奠定研究基礎。
本研究存在一些局限性：① 樣本量較少，需要進一步進行相關探索，包括適當的增加樣本量和延長觀察時間來證實以上的研究結果。② 在生理狀態下角膜的應變較小，本研究所采用的應變比生理狀態大。受限于目前的試驗機，在較小的應變范圍內無法做到快速的加載。為了探索快速加載識別的材料參數，本研究設定了在較大應變情況下，利用快速加載獲得的實驗數據來識別角膜的生物力學特性。③ 為了降低因角膜方向的不同所產生的差異性，本研究所制備的角膜條試樣均源于眼球同一方向。今后應進一步考察沿角膜其他方向時的生物力學特性，以便更加全面地認識手術后角膜生物力學特性是如何變化的，以期更好地為角膜屈光手術的優化設計提供指導。
4 結論
實驗眼與對照眼相比，角膜生物力學特性隨術后時間持續有所變化，其角膜切向模量的比值略大于1，黏彈性特性有所減弱。實驗眼與對照眼之間角膜的切向模量在術后3個月時的差異有統計學意義。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：張迪主要負責實驗設計、數據收集與分析、論文撰寫及資金支持；張海霞主要負責提供實驗與數據分析指導、論文審閱修訂及資金支持；李林主要負責實驗思路構思及論文審閱修訂。
倫理聲明：本研究通過了首都醫科大學倫理委員會批準（批文編號：AEEI-2014-066）。
