引用本文： 鐘武, 榮華, 陳睦虎, 余平貴, 王亮, 何延政. 動脈粥樣硬化大鼠動脈的基因芯片分析. 華西醫學, 2014, 29(5): 867-870. doi: 10.7507/1002-0179.20140264 復制
動脈粥樣硬化是嚴重危害人類健康的一種疾病，其病理改變主要為動脈壁的脂質和鈣鹽沉積以及膠原蛋白和蛋白聚糖合成增多，導致動脈管壁硬化變性、管腔狹窄，動脈功能退化、順應性降低[1, 2]。重要組織器官供血不足，最終引起多器官功能障礙等嚴重并發癥。其發病機制一直是學術界研究熱點，但仍未徹底闡明，一般認為系遺傳基礎與環境等因素協同作用的結果。基因芯片是20世紀90年代中后期興起的一項前沿技術，其突出優勢是能大規模、高通量地研究多種密切相關基因的表達情況[3]。本實驗用基因芯片技術，檢測了正常大鼠與動脈粥樣硬化大鼠腹主動脈內差異性表達的基因，旨在了解動脈粥樣硬化時大尺度上基因表達水平的變化，為進一步從分子生物學角度探討動脈粥樣硬化病理過程奠定一定的理論基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和儀器
分析純膽固醇（上海康捷生物科技公司），膽鹽（北京奧博星生物技術公司），維生素D3（上海第六制藥廠），基因芯片（Rat Oligo Microarray G4130A）購于美國安捷倫公司。
1.2 實驗動物模型建立
選取健康Wistar大鼠18只，雌雄各半，隨機分為兩組，每組9只。模型組即高脂（加維生素D3）+球囊損傷組：每只大鼠按7 000 000 U/kg的總劑量腹腔注射維生素D3，分3 d給予，之后給予高脂飼料20 g/d （高脂飼料成分：3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基飼料），連續喂養4 d，在第8天行大鼠頸外動脈穿刺經主動脈至髂動脈，來回拉動3次，繼續給予高脂飼料20 g，連續喂養共90 d；正常喂養組：予以標準飼料20 g/d，同時腹腔注射等劑量生理鹽水，不進行球囊導管內膜損傷操作，連續喂養90 d[4]。
1.3 標本采集
90 d后各組動物禁食過夜，戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉，開腹分離腹主動脈，在腎靜脈分叉處下方，穿刺下腔靜脈采血，分離血清；分離腹主動脈用4%多聚甲醛固定，蘇木精-伊紅（HE）染色后用于形態學觀察。
1.4 血脂檢測
采用酶法測定大鼠血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）濃度。
1.5 總RNA抽提及基因芯片檢測差異性表達基因
用Trizol試劑盒提取主動脈組織總RNA，在紫外分光光度儀下測定RNA的濃度和純度，同時進行凝膠電泳分析。以提取的RNA作為模板，根據Super ScriptⅡ試劑盒操作說明反轉錄成cDNA，用RNA轉錄標記試劑盒進行體外轉錄合成cRNA探針，與基因芯片雜交。雜交后的芯片置于GeneArray掃描儀掃描雜交信號。所得的數據用Affymetrix公司的Microarray Suite 5.0軟件進行分析。對單個樣本表達分析，P＜0.04為表達，0.04～0.06為臨界，P＞0.06為不表達，進行差異表達基因分析，將R值（模型組熒光信號強度/正常組熒光信號強度）按照差異等級分類，當R≥2.0時，表示在動脈粥樣硬化時該基因表達上調；R≤0.5時，表示該基因表達下調；當0.5＜R＜2.0時，則認為該基因表達無變化。
1.6 統計學方法
用SPSS 11.0統計軟件進行數據處理，所有數據均用均數±標準差表示，兩樣本均數比較用t檢驗，P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 血脂水平
90 d后正常喂養組TC為（1.25 ± 0.2）mmol/L，TG為（0.86 ± 0.32）mmol/L；模型組TC為（10.02 ± 1.21）mmol/L，TG為（2.05 ± 0.28）mmol/L，與正常喂養組相比，模型組TC及TG均顯著增高，兩組之間差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表 1。
表1
兩組大鼠血清TC、TG的對比（n=6，2.2 病理學觀察
光鏡下HE染色顯示正常飼養組腹主動脈管壁各層正常，內膜光滑，中膜彈力纖維正常。模型組動脈管腔縮小，內膜增厚明顯，內膜下大量平滑肌細胞增生，可見泡沫細胞積聚，斑塊底部泡沫細胞發生變性壞死，內彈力層發生變性、崩裂，在內膜和中膜均出現了大量的硬化斑塊，伴有炎性細胞浸潤，表明該動脈粥樣硬化模型建立成功（圖 1）。
圖1
大鼠腹主動脈顯微圖像（HE×200） a.正常組b. 模型組
2.3 基因芯片技術檢測動脈粥樣硬化大鼠與正常大鼠動脈組織差異表達基因
本實驗采用美國安捷倫公司大鼠Oligo Microarray G4130A芯片（共包括22 575個樣點，其中覆蓋大鼠基因20 500個）檢測實驗第90天后模型組與正常喂養組組織中基因差異性表達，結果顯示有1 730條基因差異表達，其中下調基因1 219條，上調基因511條，表 2列出了部分差異表達基因。
表2
動脈粥樣硬化大鼠動脈組織中差異表達的部分基因
3 討論
大量研究表明，人類動脈硬化的血管壁中大量鈣鹽沉積，其含量與動脈粥樣硬化的嚴重程度呈正相關。由于大劑量的維生素D3可使動脈發生鈣化，所以，在此理論基礎之上許多學者用大劑量維生素D3作為誘導劑建立動物模型[5]。本實驗中給予大鼠高脂飼料及維生素D負荷的同時，予球囊損傷動脈，形成與人類動脈粥樣硬化相似的動脈粥樣硬化斑塊模型。
自1999年Ross[6]試圖用炎癥學說闡釋動脈粥樣硬化的病理機制，炎癥學說逐漸被廣大學者接受，并在動脈粥樣硬化的病因學研究中占據了指導地位。為了進一步驗證這一理論，Zhao等[7]分別用白細胞介素（IL）-1β和腫瘤壞死因子（TNF）-α刺激人臍靜脈內皮細胞后，用約4 000個基因的微陣列檢測內皮細胞mRNA的表達差異性，對比發現在兩種炎癥因子作用下，各有33個和58個基因表達出現明顯差異，其編碼產物包括IL-8、VCAM-1、Pal-1、基質金屬蛋白酶和內皮素等。此外，在動脈粥樣硬化重要靶器官研究中，Satterthwaite等[8]采集了人冠狀動脈粥樣硬化樣本后，用含9 206個人基因的DNA微陣列檢測基因表達的量化差異，分析發現IL-1受體相關激酶（IRAK）及信號傳導子轉錄激活子6（STAT6）的表達量與動脈粥樣硬化關系非常密切。本實驗中，與對照組相比，模型組肥大細胞羧肽酶A、Fc受體、抗乙酰膽堿受體抗體、半乳糖凝集素9、IL-2抗體、溶菌酶等表達量增加，提示炎癥反應參與動脈組織病變的各個環節。
近年的基礎研究分析認為，動脈粥樣硬化病變發生的過程中，低密度脂蛋白（LDL）在體內氧化應激作用下，進而生成氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL），這一變化可能是關鍵因素[9]。Shiffman等[10]選用佛波酯培養THP-1細胞，使之逐漸分化為巨噬細胞樣表型，并用含9 808個人基因的微陣列檢測巨噬細胞向泡沫細胞轉化過程中基因的表達變化，與對照組相比，268個相關的關鍵基因表達增加了至少2倍。這些基因涉及細胞的生長、遷移、基質重構、炎癥反應等功能，為動脈粥樣硬化的發生提供了間接證據。我國學者盧次勇等[11]首次發現在ox-LDL誘導作用下，內皮細胞泛肽激活酶、血清和糖皮質激素誘導的蛋白激酶基因表達發生改變。本實驗從整體動物模型出發，分析了腹主動脈粥樣硬化組織整體的基因表達水平變化，模型組載脂蛋白D、脂肪酸結合蛋白等與脂肪代謝有關的基因表達增高。
近年來對內皮細胞功能的研究表明，同型半胱氨酸對內皮細胞的功能的干預是引發動脈粥樣硬化病變的又一因素[12]。Li等[13]建立體外高同型半胱氨酸環境下的人臍靜脈內皮細胞的模型，隨后用cDNA微陣列遴選內皮細胞相關基因表達的改變，結果發現編碼3-甲基戊二酸輔酶A還原酶、3-羥基的基因表達量明顯上調。此外，另有研究表明，某些組織蛋白酶（Cat）可能與動脈粥樣硬化發病過程關系密切[14]，Vivanco等[15]在對急性冠狀動脈綜合征研究中發現患者巨噬細胞中Cat-D增加，它可能作為一種新的心血管疾病的標志物用于臨床監測。Bengtsson等[16]研究發現半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Cystatin C）能下調Cat的活性，并參與重塑粥樣斑塊基質，對穩定斑塊的形成起促進作用。本實驗中應用基因片技術篩選與動脈粥樣硬化發病相關的基因，同樣發現模型組動脈Cat-D、Cat-L、Cat-B的表達較對照組上調，而內源性抑制劑Cystatin C表達下調，支持血漿同型半胱氨酸水平及半胱氨酸蛋白酶表達與動脈粥樣硬化發病相關。
動脈粥樣硬化發病過程中，血管平滑肌細胞和炎癥細胞產生包括基質半胱氨酸蛋白酶族、金屬蛋白酶族、天冬氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶族等一系列蛋白酶。正是由于這些蛋白因子的協同作用，打破細胞外基質的形成與降解的動態平衡，促使平滑肌細胞遷移，進一步導致不穩定斑塊的形成。在后續實驗中，我們擬用免疫組織化學技術比較這些相關酶類在正常大鼠血管壁組織中和動脈粥樣硬化大鼠動脈中表達差異，期望為臨床治療動脈粥樣硬化提供新的思路。
動脈粥樣硬化是嚴重危害人類健康的一種疾病，其病理改變主要為動脈壁的脂質和鈣鹽沉積以及膠原蛋白和蛋白聚糖合成增多，導致動脈管壁硬化變性、管腔狹窄，動脈功能退化、順應性降低[1, 2]。重要組織器官供血不足，最終引起多器官功能障礙等嚴重并發癥。其發病機制一直是學術界研究熱點，但仍未徹底闡明，一般認為系遺傳基礎與環境等因素協同作用的結果。基因芯片是20世紀90年代中后期興起的一項前沿技術，其突出優勢是能大規模、高通量地研究多種密切相關基因的表達情況[3]。本實驗用基因芯片技術，檢測了正常大鼠與動脈粥樣硬化大鼠腹主動脈內差異性表達的基因，旨在了解動脈粥樣硬化時大尺度上基因表達水平的變化，為進一步從分子生物學角度探討動脈粥樣硬化病理過程奠定一定的理論基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和儀器
分析純膽固醇（上海康捷生物科技公司），膽鹽（北京奧博星生物技術公司），維生素D3（上海第六制藥廠），基因芯片（Rat Oligo Microarray G4130A）購于美國安捷倫公司。
1.2 實驗動物模型建立
選取健康Wistar大鼠18只，雌雄各半，隨機分為兩組，每組9只。模型組即高脂（加維生素D3）+球囊損傷組：每只大鼠按7 000 000 U/kg的總劑量腹腔注射維生素D3，分3 d給予，之后給予高脂飼料20 g/d （高脂飼料成分：3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基飼料），連續喂養4 d，在第8天行大鼠頸外動脈穿刺經主動脈至髂動脈，來回拉動3次，繼續給予高脂飼料20 g，連續喂養共90 d；正常喂養組：予以標準飼料20 g/d，同時腹腔注射等劑量生理鹽水，不進行球囊導管內膜損傷操作，連續喂養90 d[4]。
1.3 標本采集
90 d后各組動物禁食過夜，戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉，開腹分離腹主動脈，在腎靜脈分叉處下方，穿刺下腔靜脈采血，分離血清；分離腹主動脈用4%多聚甲醛固定，蘇木精-伊紅（HE）染色后用于形態學觀察。
1.4 血脂檢測
采用酶法測定大鼠血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）濃度。
1.5 總RNA抽提及基因芯片檢測差異性表達基因
用Trizol試劑盒提取主動脈組織總RNA，在紫外分光光度儀下測定RNA的濃度和純度，同時進行凝膠電泳分析。以提取的RNA作為模板，根據Super ScriptⅡ試劑盒操作說明反轉錄成cDNA，用RNA轉錄標記試劑盒進行體外轉錄合成cRNA探針，與基因芯片雜交。雜交后的芯片置于GeneArray掃描儀掃描雜交信號。所得的數據用Affymetrix公司的Microarray Suite 5.0軟件進行分析。對單個樣本表達分析，P＜0.04為表達，0.04～0.06為臨界，P＞0.06為不表達，進行差異表達基因分析，將R值（模型組熒光信號強度/正常組熒光信號強度）按照差異等級分類，當R≥2.0時，表示在動脈粥樣硬化時該基因表達上調；R≤0.5時，表示該基因表達下調；當0.5＜R＜2.0時，則認為該基因表達無變化。
1.6 統計學方法
用SPSS 11.0統計軟件進行數據處理，所有數據均用均數±標準差表示，兩樣本均數比較用t檢驗，P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 血脂水平
90 d后正常喂養組TC為（1.25 ± 0.2）mmol/L，TG為（0.86 ± 0.32）mmol/L；模型組TC為（10.02 ± 1.21）mmol/L，TG為（2.05 ± 0.28）mmol/L，與正常喂養組相比，模型組TC及TG均顯著增高，兩組之間差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表 1。
表1
兩組大鼠血清TC、TG的對比（n=6，2.2 病理學觀察
光鏡下HE染色顯示正常飼養組腹主動脈管壁各層正常，內膜光滑，中膜彈力纖維正常。模型組動脈管腔縮小，內膜增厚明顯，內膜下大量平滑肌細胞增生，可見泡沫細胞積聚，斑塊底部泡沫細胞發生變性壞死，內彈力層發生變性、崩裂，在內膜和中膜均出現了大量的硬化斑塊，伴有炎性細胞浸潤，表明該動脈粥樣硬化模型建立成功（圖 1）。
圖1
大鼠腹主動脈顯微圖像（HE×200） a.正常組b. 模型組
2.3 基因芯片技術檢測動脈粥樣硬化大鼠與正常大鼠動脈組織差異表達基因
本實驗采用美國安捷倫公司大鼠Oligo Microarray G4130A芯片（共包括22 575個樣點，其中覆蓋大鼠基因20 500個）檢測實驗第90天后模型組與正常喂養組組織中基因差異性表達，結果顯示有1 730條基因差異表達，其中下調基因1 219條，上調基因511條，表 2列出了部分差異表達基因。
表2
動脈粥樣硬化大鼠動脈組織中差異表達的部分基因
3 討論
大量研究表明，人類動脈硬化的血管壁中大量鈣鹽沉積，其含量與動脈粥樣硬化的嚴重程度呈正相關。由于大劑量的維生素D3可使動脈發生鈣化，所以，在此理論基礎之上許多學者用大劑量維生素D3作為誘導劑建立動物模型[5]。本實驗中給予大鼠高脂飼料及維生素D負荷的同時，予球囊損傷動脈，形成與人類動脈粥樣硬化相似的動脈粥樣硬化斑塊模型。
自1999年Ross[6]試圖用炎癥學說闡釋動脈粥樣硬化的病理機制，炎癥學說逐漸被廣大學者接受，并在動脈粥樣硬化的病因學研究中占據了指導地位。為了進一步驗證這一理論，Zhao等[7]分別用白細胞介素（IL）-1β和腫瘤壞死因子（TNF）-α刺激人臍靜脈內皮細胞后，用約4 000個基因的微陣列檢測內皮細胞mRNA的表達差異性，對比發現在兩種炎癥因子作用下，各有33個和58個基因表達出現明顯差異，其編碼產物包括IL-8、VCAM-1、Pal-1、基質金屬蛋白酶和內皮素等。此外，在動脈粥樣硬化重要靶器官研究中，Satterthwaite等[8]采集了人冠狀動脈粥樣硬化樣本后，用含9 206個人基因的DNA微陣列檢測基因表達的量化差異，分析發現IL-1受體相關激酶（IRAK）及信號傳導子轉錄激活子6（STAT6）的表達量與動脈粥樣硬化關系非常密切。本實驗中，與對照組相比，模型組肥大細胞羧肽酶A、Fc受體、抗乙酰膽堿受體抗體、半乳糖凝集素9、IL-2抗體、溶菌酶等表達量增加，提示炎癥反應參與動脈組織病變的各個環節。
近年的基礎研究分析認為，動脈粥樣硬化病變發生的過程中，低密度脂蛋白（LDL）在體內氧化應激作用下，進而生成氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL），這一變化可能是關鍵因素[9]。Shiffman等[10]選用佛波酯培養THP-1細胞，使之逐漸分化為巨噬細胞樣表型，并用含9 808個人基因的微陣列檢測巨噬細胞向泡沫細胞轉化過程中基因的表達變化，與對照組相比，268個相關的關鍵基因表達增加了至少2倍。這些基因涉及細胞的生長、遷移、基質重構、炎癥反應等功能，為動脈粥樣硬化的發生提供了間接證據。我國學者盧次勇等[11]首次發現在ox-LDL誘導作用下，內皮細胞泛肽激活酶、血清和糖皮質激素誘導的蛋白激酶基因表達發生改變。本實驗從整體動物模型出發，分析了腹主動脈粥樣硬化組織整體的基因表達水平變化，模型組載脂蛋白D、脂肪酸結合蛋白等與脂肪代謝有關的基因表達增高。
近年來對內皮細胞功能的研究表明，同型半胱氨酸對內皮細胞的功能的干預是引發動脈粥樣硬化病變的又一因素[12]。Li等[13]建立體外高同型半胱氨酸環境下的人臍靜脈內皮細胞的模型，隨后用cDNA微陣列遴選內皮細胞相關基因表達的改變，結果發現編碼3-甲基戊二酸輔酶A還原酶、3-羥基的基因表達量明顯上調。此外，另有研究表明，某些組織蛋白酶（Cat）可能與動脈粥樣硬化發病過程關系密切[14]，Vivanco等[15]在對急性冠狀動脈綜合征研究中發現患者巨噬細胞中Cat-D增加，它可能作為一種新的心血管疾病的標志物用于臨床監測。Bengtsson等[16]研究發現半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Cystatin C）能下調Cat的活性，并參與重塑粥樣斑塊基質，對穩定斑塊的形成起促進作用。本實驗中應用基因片技術篩選與動脈粥樣硬化發病相關的基因，同樣發現模型組動脈Cat-D、Cat-L、Cat-B的表達較對照組上調，而內源性抑制劑Cystatin C表達下調，支持血漿同型半胱氨酸水平及半胱氨酸蛋白酶表達與動脈粥樣硬化發病相關。
動脈粥樣硬化發病過程中，血管平滑肌細胞和炎癥細胞產生包括基質半胱氨酸蛋白酶族、金屬蛋白酶族、天冬氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶族等一系列蛋白酶。正是由于這些蛋白因子的協同作用，打破細胞外基質的形成與降解的動態平衡，促使平滑肌細胞遷移，進一步導致不穩定斑塊的形成。在后續實驗中，我們擬用免疫組織化學技術比較這些相關酶類在正常大鼠血管壁組織中和動脈粥樣硬化大鼠動脈中表達差異，期望為臨床治療動脈粥樣硬化提供新的思路。
