引用本文： 楊青, 徐益鳴, 李曉宇. 激光多普勒血流儀監測C57BL/6小鼠永久性大腦中動脈閉塞模型. 華西醫學, 2014, 29(5): 863-866. doi: 10.7507/1002-0179.20140263 復制
腦卒中又稱中風，是一種高發病率、高死亡率、高致殘率的疾病，其中缺血性腦卒中占患者總數的60%～70%左右[1]。因此我們需建立穩定的實驗性腦缺血模型以研究缺血性腦卒中的病理機制和治療方法。目前，一般采用線栓法大腦中動脈閉塞（MCAO）復制大鼠永久性腦缺血模型[2-4]。在活體動物中，評價該模型復制成功的手段一般為術后神經功能學評分，評價手段有一定主觀性，因此需要更為客觀的指標來評價手術是否成功。激光多普勒血流儀（LDF）能夠實時監測手術前和手術后腦血流水平，近年來成為大鼠腦缺血再灌注模型的實時監測和評價模型成功與否的重要方法[5, 6]。C57BL/6小鼠作為多種轉基因模型被更多地運用于科研，在小鼠MCAO的模型制作過程中，手術難度更大、手術的不穩定因素更多，因此采用LDF實時監測腦血流，來客觀的判斷小鼠MCAO模型復制成功與否成為必要。
在臨床上，腦缺血患者血栓溶解需要一定的時間才能建立側支循環，只有較少病例經組織纖溶酶原激活物才能夠實現缺血后再灌注[7, 8]。在基礎實驗研究中，C57BL/6小鼠是進行免疫藥物篩選，復制病理模型較常用的實驗動物。因此我們復制C57BL/6小鼠永久性的MCAO模型以模擬患者腦缺血后24 h內的疾病狀態，手術中采用激光多普勒持續監測小鼠的腦血流變化，并在術后結合神經功能學評分等評價以LDF在活體水平實時監測的模型是否成功。
1 材料與方法
1.1 材料
健康雄性C57BL/6小鼠，體質量25～28 g，由南京醫科大學實驗動物中心購買，所有實驗操作符合Guide for the Care and Use of Laboratory Animals（美國國立衛生研究院頒布，No.85-23）要求，獲得南京醫科大學動物保護委員會批準。2，3，52氯化三苯基四氮唑（TTC）（美國Sigma公司），栓線購自北京沙東技術有限公司，型號1620-100。腦立體定位儀（上海奧爾科特公司）、激光多普勒血流儀（瑞典Perimed公司），體式顯微鏡（日本Olympus公司）。
1.2 方法
1.2.1 模型構建方法：
選用C57BL/6小鼠，用栓線對小鼠進行大腦中動脈永久性閉塞構建MCAO模型。實驗分組：① C57BL/6假手術組12只；② C57BL/6 MCAO組12只。
術前以5%水合氯醛（0.07 mL/10 g體質量）麻醉后，小鼠俯臥于立體定位儀，頭部脫毛后常規消毒，矢狀位剪開頂部皮膚約1 cm，分離皮下筋膜，用棉簽輕輕摩擦暴露的筋膜，直至暴露出前囟和顱骨。將激光多普勒血流儀的探頭固定于右側顱骨，開始記錄右側大腦中動脈供血區域血流變化值，當所示數值平穩后開始制作MCAO模型。將小鼠仰臥固定于37℃恒溫手術臺上，脫毛后正中切開頸前皮膚，顯微鏡下暴露右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，結扎頸總動脈，在頸總動脈距頸外動脈分叉部約2～3 mm處剪一小口，經該切口將8.0的線栓插入頸內動脈約11～12 mm，阻塞大腦中動脈起始部。假手術組小鼠除不插入線栓以外，其余同模型動物。
1.2.2 腦血流監測
LDF實時監測，用瑞典Perimed 公司提供的數據記錄軟件PSW記錄并分析監測期間腦血流變化情況。對每只小鼠術前術后行LDF實時監測腦血流變化。
1.2.3 神經功能學評分
參照Longa等[9]的5級4分法標準，于小鼠清醒后進行神經功能評分：0分，無神經功能缺損癥狀；1分，輕微神經功能缺損，不能完全伸展左側前爪；2分，中度局灶性神經功能缺損，行走時向左側轉圈；3分，重度局灶性神經功能缺損，向左側傾倒；4分，不能自發行走，意識水平下降。
1.2.4 腦梗死面積測定
腦缺血24 h后，斷頭取腦，用生理鹽水沖洗大腦表面血污，放置在-80℃冰箱內冷凍5 min使之變硬，取出后按2 mm厚度由前向后冠狀切片，置2% TTC溶液中，于37℃避光孵育20 min，生理鹽水漂洗，用數碼相機照片后Image-Pro Plus軟件計算分析梗死面積。
1.3 統計學方法
用統計軟件Prism 5.0進行統計分析，各組計量資料以均數±標準差表示，兩兩比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 LDF實時監測腦血流
在栓線插入前，小鼠腦血流圖顯示其基礎血流波動，小鼠右側腦血流基礎值為（186.78 ± 52.50）PU，在栓線插入后，右側大腦中動脈血流阻塞，肉眼透過顱骨即可見到小鼠右腦變白，腦血流降至（25.80 ± 7.66）PU，血流降低絕對值達168.98 PU，降幅達到90.4%（P＜0.05）。12例模型組中降幅達到85%以上者達到10例。另外2例，其中1例因小鼠血管畸形，栓線不能進入到位，手術失敗。另1例由于栓線插入過深，小鼠在腦血流儀監測，血流降至10 PU后10 min內死亡。而假手術組腦血流圖未見明顯改變，腦血流始終在基礎值波動。典型的腦血流圖見圖 1、2。
圖1
MCAO過程中腦血流的變化
圖2
假手術過程中腦血流變化
2.2 神經功能學評分
對所有MCAO模型組和假手術組小鼠在其麻醉清醒后，采用雙盲法評價其神經功能，發現大腦中動脈閉塞后腦血流降幅達85%以上的小鼠神經功能學評分在（2.48 ± 0.36）分，假手術組神經功能學評分為0分（P＜0.01）。
2.3 TTC染色驗證腦梗死面積
MCAO術后24 h，小鼠經斷頭取腦，TTC染色后，發現永久性MCAO模型導致小鼠右側腦組織紋狀體和海馬部位出現大面積梗死發白區域。本研究中模型成功的小鼠腦組織梗死面積達39.79%，假手術組和模型不成功的小鼠均未出現梗死病灶。見圖 3。
圖3
TTC染色觀察腦梗死面積 3a. 假手術組3b. MCAO模型組
3 討論
線栓法復制MCAO病理模型已經是一個應用較廣泛的技術，首次使用是用于復制大鼠腦缺血模型[9]，之后由于轉基因技術的出現，該模型漸漸用于小鼠。這種技術的優點是：經頸動脈插入線栓閉塞一側大腦中動脈血流，避免了去骨瓣，消除了對血腦屏障通透性和開顱后手術操作對顱內壓的影響[10]。然而，許多因素如實驗鼠體質量的差異、不同品系和不同小鼠間血管Willis環的解剖差異，術中血管的痙攣、栓線直徑與血管的匹配程度、體溫、手術者的技巧、線栓閉塞時間以及一些其他因素，可能導致梗死體積在模型本身的不夠穩定[11, 12]。術后的神經功能學評分作為常用的判斷模型成功與否的一種手段，需要研究者嚴格執行雙盲，但依然可能會出現假陽性或者假陰性結果。因此，想要得到穩定的模型，除了在造模時注意操作上的技術細節，嚴格執行雙盲，我們更需要一種在活體水平的、有效的、更客觀的評估手段以判斷模型的穩定性。
LDF可以實時監測特定的解剖區域的血流量，可以較準確地反映局部微循環的血量[13]。近年來，國外研究者把LDF作為一個極好的篩選方法來評價大鼠腦缺血模型是否成功。小鼠的MCAO模型，因體質量更小，手術難度更大，更需要以一種更客觀的手段在活體水平衡量模型是否可以入組。C57BL/6小鼠作為“標準”的近交系小鼠，基于C57BL/6遺傳背景的多種基因敲除小鼠近年來更多地用于復制多種疾病模型研究，我們在實驗中發現，基于C57BL/6小鼠復制的MCAO模型穩定性優于ICR等遺傳背景小鼠[14]。因此，以 C57BL/6小鼠為背景的MCAO模型，我們尚需要摸索一個相對穩定、確切的腦血流下降率作為參考值以便下一步更準確地篩選出手術成功的模型。
我們首先通過立體定位儀預設好所需監測的解剖區域，此后的實驗鼠檢測的腦血流水平即是預設的大腦區域的血液流動。相對于大鼠檢測LDF的定位，C57BL/6小鼠腦部定位的精度和要求難度更大，要求更為嚴格，只有嚴格定位才可以獲得較一致、更可靠的結果。術前我們發現，C57BL/6小鼠的腦血流量基礎值波動與大鼠MCAO相比受體溫影響較大，之后，我們將術前術后小鼠都置于恒溫毯操作。我們發現，栓線成功插入到11～12 mm的小鼠患側腦血流即下降明顯，下降幅度均達到85%以上，與文獻中大鼠MCAO后血流下降程度類似[13]。我們對這部分模型小鼠進行神經功能學評分，配合TTC組織學檢查，發現均有較為恒定的腦梗死體積。在預實驗中，我們發現神經功能學評分在1～3分時小鼠的腦梗死體積較為恒定，但也有部分小鼠神經功能學評分在0～1分時即有較明顯的腦梗死。因此，我們認為為了減少珍貴小鼠模型的浪費（尤其是一些基因敲除背景的小鼠模型），為了實現實驗的標準化，術前術后LDF監測和神經功能學評分相互驗證，對判斷MCAO模型更敏感，更有效，更可靠，并能加強后續實驗結果的說服力。因此，我們實驗室在建立MCAO模型時，把LDF的實時監測納入建模體系中，同時與神經功能學評分反復驗證，將腦血流量降幅達到85%以上的模型小鼠納入下一步研究，在研究中建立了更可靠的基礎模型，對進一步研究腦缺血的病理機制打下更為堅實的基礎[14]。
綜上，我們建議有必要將LDF在活體水平實時監測腦血流作為一種常規的監測手段和神經功能學評分相互驗證，共同納入小鼠MCAO模型建立體系中。也有研究者將LDF用于大鼠腦梗死后組織纖溶酶原激活物介導的再灌注的效率預測評估，但結果顯示其對再灌注效率的評估作用比較有限，尤其是對大面積梗死灶的再灌效果評估效率不夠確切，因此，LDF在腦缺血研究中更廣泛的使用還有待進一步研究[15]。
腦卒中又稱中風，是一種高發病率、高死亡率、高致殘率的疾病，其中缺血性腦卒中占患者總數的60%～70%左右[1]。因此我們需建立穩定的實驗性腦缺血模型以研究缺血性腦卒中的病理機制和治療方法。目前，一般采用線栓法大腦中動脈閉塞（MCAO）復制大鼠永久性腦缺血模型[2-4]。在活體動物中，評價該模型復制成功的手段一般為術后神經功能學評分，評價手段有一定主觀性，因此需要更為客觀的指標來評價手術是否成功。激光多普勒血流儀（LDF）能夠實時監測手術前和手術后腦血流水平，近年來成為大鼠腦缺血再灌注模型的實時監測和評價模型成功與否的重要方法[5, 6]。C57BL/6小鼠作為多種轉基因模型被更多地運用于科研，在小鼠MCAO的模型制作過程中，手術難度更大、手術的不穩定因素更多，因此采用LDF實時監測腦血流，來客觀的判斷小鼠MCAO模型復制成功與否成為必要。
在臨床上，腦缺血患者血栓溶解需要一定的時間才能建立側支循環，只有較少病例經組織纖溶酶原激活物才能夠實現缺血后再灌注[7, 8]。在基礎實驗研究中，C57BL/6小鼠是進行免疫藥物篩選，復制病理模型較常用的實驗動物。因此我們復制C57BL/6小鼠永久性的MCAO模型以模擬患者腦缺血后24 h內的疾病狀態，手術中采用激光多普勒持續監測小鼠的腦血流變化，并在術后結合神經功能學評分等評價以LDF在活體水平實時監測的模型是否成功。
1 材料與方法
1.1 材料
健康雄性C57BL/6小鼠，體質量25～28 g，由南京醫科大學實驗動物中心購買，所有實驗操作符合Guide for the Care and Use of Laboratory Animals（美國國立衛生研究院頒布，No.85-23）要求，獲得南京醫科大學動物保護委員會批準。2，3，52氯化三苯基四氮唑（TTC）（美國Sigma公司），栓線購自北京沙東技術有限公司，型號1620-100。腦立體定位儀（上海奧爾科特公司）、激光多普勒血流儀（瑞典Perimed公司），體式顯微鏡（日本Olympus公司）。
1.2 方法
1.2.1 模型構建方法：
選用C57BL/6小鼠，用栓線對小鼠進行大腦中動脈永久性閉塞構建MCAO模型。實驗分組：① C57BL/6假手術組12只；② C57BL/6 MCAO組12只。
術前以5%水合氯醛（0.07 mL/10 g體質量）麻醉后，小鼠俯臥于立體定位儀，頭部脫毛后常規消毒，矢狀位剪開頂部皮膚約1 cm，分離皮下筋膜，用棉簽輕輕摩擦暴露的筋膜，直至暴露出前囟和顱骨。將激光多普勒血流儀的探頭固定于右側顱骨，開始記錄右側大腦中動脈供血區域血流變化值，當所示數值平穩后開始制作MCAO模型。將小鼠仰臥固定于37℃恒溫手術臺上，脫毛后正中切開頸前皮膚，顯微鏡下暴露右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，結扎頸總動脈，在頸總動脈距頸外動脈分叉部約2～3 mm處剪一小口，經該切口將8.0的線栓插入頸內動脈約11～12 mm，阻塞大腦中動脈起始部。假手術組小鼠除不插入線栓以外，其余同模型動物。
1.2.2 腦血流監測
LDF實時監測，用瑞典Perimed 公司提供的數據記錄軟件PSW記錄并分析監測期間腦血流變化情況。對每只小鼠術前術后行LDF實時監測腦血流變化。
1.2.3 神經功能學評分
參照Longa等[9]的5級4分法標準，于小鼠清醒后進行神經功能評分：0分，無神經功能缺損癥狀；1分，輕微神經功能缺損，不能完全伸展左側前爪；2分，中度局灶性神經功能缺損，行走時向左側轉圈；3分，重度局灶性神經功能缺損，向左側傾倒；4分，不能自發行走，意識水平下降。
1.2.4 腦梗死面積測定
腦缺血24 h后，斷頭取腦，用生理鹽水沖洗大腦表面血污，放置在-80℃冰箱內冷凍5 min使之變硬，取出后按2 mm厚度由前向后冠狀切片，置2% TTC溶液中，于37℃避光孵育20 min，生理鹽水漂洗，用數碼相機照片后Image-Pro Plus軟件計算分析梗死面積。
1.3 統計學方法
用統計軟件Prism 5.0進行統計分析，各組計量資料以均數±標準差表示，兩兩比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 LDF實時監測腦血流
在栓線插入前，小鼠腦血流圖顯示其基礎血流波動，小鼠右側腦血流基礎值為（186.78 ± 52.50）PU，在栓線插入后，右側大腦中動脈血流阻塞，肉眼透過顱骨即可見到小鼠右腦變白，腦血流降至（25.80 ± 7.66）PU，血流降低絕對值達168.98 PU，降幅達到90.4%（P＜0.05）。12例模型組中降幅達到85%以上者達到10例。另外2例，其中1例因小鼠血管畸形，栓線不能進入到位，手術失敗。另1例由于栓線插入過深，小鼠在腦血流儀監測，血流降至10 PU后10 min內死亡。而假手術組腦血流圖未見明顯改變，腦血流始終在基礎值波動。典型的腦血流圖見圖 1、2。
圖1
MCAO過程中腦血流的變化
圖2
假手術過程中腦血流變化
2.2 神經功能學評分
對所有MCAO模型組和假手術組小鼠在其麻醉清醒后，采用雙盲法評價其神經功能，發現大腦中動脈閉塞后腦血流降幅達85%以上的小鼠神經功能學評分在（2.48 ± 0.36）分，假手術組神經功能學評分為0分（P＜0.01）。
2.3 TTC染色驗證腦梗死面積
MCAO術后24 h，小鼠經斷頭取腦，TTC染色后，發現永久性MCAO模型導致小鼠右側腦組織紋狀體和海馬部位出現大面積梗死發白區域。本研究中模型成功的小鼠腦組織梗死面積達39.79%，假手術組和模型不成功的小鼠均未出現梗死病灶。見圖 3。
圖3
TTC染色觀察腦梗死面積 3a. 假手術組3b. MCAO模型組
3 討論
線栓法復制MCAO病理模型已經是一個應用較廣泛的技術，首次使用是用于復制大鼠腦缺血模型[9]，之后由于轉基因技術的出現，該模型漸漸用于小鼠。這種技術的優點是：經頸動脈插入線栓閉塞一側大腦中動脈血流，避免了去骨瓣，消除了對血腦屏障通透性和開顱后手術操作對顱內壓的影響[10]。然而，許多因素如實驗鼠體質量的差異、不同品系和不同小鼠間血管Willis環的解剖差異，術中血管的痙攣、栓線直徑與血管的匹配程度、體溫、手術者的技巧、線栓閉塞時間以及一些其他因素，可能導致梗死體積在模型本身的不夠穩定[11, 12]。術后的神經功能學評分作為常用的判斷模型成功與否的一種手段，需要研究者嚴格執行雙盲，但依然可能會出現假陽性或者假陰性結果。因此，想要得到穩定的模型，除了在造模時注意操作上的技術細節，嚴格執行雙盲，我們更需要一種在活體水平的、有效的、更客觀的評估手段以判斷模型的穩定性。
LDF可以實時監測特定的解剖區域的血流量，可以較準確地反映局部微循環的血量[13]。近年來，國外研究者把LDF作為一個極好的篩選方法來評價大鼠腦缺血模型是否成功。小鼠的MCAO模型，因體質量更小，手術難度更大，更需要以一種更客觀的手段在活體水平衡量模型是否可以入組。C57BL/6小鼠作為“標準”的近交系小鼠，基于C57BL/6遺傳背景的多種基因敲除小鼠近年來更多地用于復制多種疾病模型研究，我們在實驗中發現，基于C57BL/6小鼠復制的MCAO模型穩定性優于ICR等遺傳背景小鼠[14]。因此，以 C57BL/6小鼠為背景的MCAO模型，我們尚需要摸索一個相對穩定、確切的腦血流下降率作為參考值以便下一步更準確地篩選出手術成功的模型。
我們首先通過立體定位儀預設好所需監測的解剖區域，此后的實驗鼠檢測的腦血流水平即是預設的大腦區域的血液流動。相對于大鼠檢測LDF的定位，C57BL/6小鼠腦部定位的精度和要求難度更大，要求更為嚴格，只有嚴格定位才可以獲得較一致、更可靠的結果。術前我們發現，C57BL/6小鼠的腦血流量基礎值波動與大鼠MCAO相比受體溫影響較大，之后，我們將術前術后小鼠都置于恒溫毯操作。我們發現，栓線成功插入到11～12 mm的小鼠患側腦血流即下降明顯，下降幅度均達到85%以上，與文獻中大鼠MCAO后血流下降程度類似[13]。我們對這部分模型小鼠進行神經功能學評分，配合TTC組織學檢查，發現均有較為恒定的腦梗死體積。在預實驗中，我們發現神經功能學評分在1～3分時小鼠的腦梗死體積較為恒定，但也有部分小鼠神經功能學評分在0～1分時即有較明顯的腦梗死。因此，我們認為為了減少珍貴小鼠模型的浪費（尤其是一些基因敲除背景的小鼠模型），為了實現實驗的標準化，術前術后LDF監測和神經功能學評分相互驗證，對判斷MCAO模型更敏感，更有效，更可靠，并能加強后續實驗結果的說服力。因此，我們實驗室在建立MCAO模型時，把LDF的實時監測納入建模體系中，同時與神經功能學評分反復驗證，將腦血流量降幅達到85%以上的模型小鼠納入下一步研究，在研究中建立了更可靠的基礎模型，對進一步研究腦缺血的病理機制打下更為堅實的基礎[14]。
綜上，我們建議有必要將LDF在活體水平實時監測腦血流作為一種常規的監測手段和神經功能學評分相互驗證，共同納入小鼠MCAO模型建立體系中。也有研究者將LDF用于大鼠腦梗死后組織纖溶酶原激活物介導的再灌注的效率預測評估，但結果顯示其對再灌注效率的評估作用比較有限，尤其是對大面積梗死灶的再灌效果評估效率不夠確切，因此，LDF在腦缺血研究中更廣泛的使用還有待進一步研究[15]。
