引用本文： 涂禾, 梁栗, 侯世祥, 馮光富. 高效液相色譜法測定疲王按摩乳中阿魏酸的含量. 華西醫學, 2014, 29(9): 1697-1700. doi: 10.7507/1002-0179.20140517 復制
疲王按摩乳具有舒筋活絡、行氣活血、散寒止痛的功效，主要由伸筋草、舒筋草、川芎、紅花、大血藤、花椒、羌活、獨活等12味中藥組成，用于國家優秀運動員連續大運動量訓練后引起的運動性肌肉疲勞癥。癥見受累的肌肉、筋腱酸痛發困、發緊、發硬，壓痛之泛，多在肌腹肌腱、腱腹交接處以及肌間隔區，活動時筋肉酸痛乏力，或肌肉收縮紊亂癥[1]。查閱相關文獻資料后，伸筋草、舒筋草、川芎、羌活4味藥材均含阿魏酸，且用量較大，其功效可部分反映整個成方制劑的功效，因此對該制劑中總阿魏酸進行含量測定具有現實意義。實驗研究證實，高效液相色譜法可用于測定疲王按摩乳中的阿魏酸含量。
1 材料與方法
1.1 儀器
Agilent 1100高效液相色譜儀（美國惠普公司生產，包括G1311A四元梯度泵，VWD檢測器，G1316A柱溫箱，Agilent 1100化學色譜工作站）；AL204電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SB3200超聲清洗機（上海必能信超聲有限公司）。
1.2 試藥
阿魏酸對照品（批號110737-201012）、川芎對照品（批號120918-200809）、羌活對照品（批號120935-200506）、伸筋草對照品（批號1109-200001）均由中國藥品生物制品檢定所提供，舒筋草經鑒定藥材均符合《四川省中藥材標準》2010年版的有關規定[2]。冰醋酸和甲醇均為色譜純[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]、水為超純水（自制），其他試劑均為分析純。
疲王按摩乳樣品批號為：110821、110911、110912、110913。均由四川省骨科醫院制劑室提供。
1.3 方法
1.3.1 色譜條件
色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，北京迪馬科技有限公司）；流動相：甲醇-2%冰醋酸（32︰68）；體積流量：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：320 nm。
1.3.2 溶液制備
阿魏酸對照品溶液：取阿魏酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含10 μg阿魏酸對照品的溶液，即得。
供試品溶液：精密稱取供試品5 g，加入70%甲醇30 mL，加熱回流30 min，冰水浴20 min，使其基質析出，濾過，用70%甲醇6 mL洗滌濾器及圓底燒瓶等，洗滌2次，合并濾液，用70%甲醇稀釋并定容于50 mL棕色容量瓶中，取少量供試品溶液于離心管中，離心（離心半徑3 cm，轉速10 000 r/min，離心時間10 min）后，取上清液用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，即得。
川芎對照品溶液：將藥材粉碎，過60目篩，取本品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，稱定質量，超聲處理20 min （功率160 W，頻率50 kHz），精密稱定，用稀乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，再用微孔濾膜（0.45 μm） 濾過，即得。
羌活對照品溶液、伸筋草對照品溶液及舒筋草對照品溶液制備方法同“川芎對照品溶液”。
陰性對照品溶液：除川芎、羌活、伸筋草和舒筋草外，其他中藥飲片按供試品處方量投料，按疲王按摩乳工藝制成陰性對照品，然后再按“供試品溶液”項下方法，制成陰性對照品溶液。
1.3.3 專屬性試驗
分別取阿魏酸對照品溶液、陰性對照品溶液、4種藥材對照品溶液（川芎、羌活、伸筋草和舒筋草）及供試品溶液，注入高效液相色譜儀，按照1.3.1項“色譜條件”，在同一條件下測定。
1.3.4 線性關系考查
分別精密吸取阿魏酸對照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10 mL于10 mL棕色容量瓶中，用5%甲酸稀釋并定容，搖勻，即得4.55、9.10、27.30、45.50、72.80、91.00 μg/mL的標準供試液。精密取各供試液10 μL，進樣，按上述色譜條件測定，重復操作2次，以峰面積（A）對濃度（C）進行線性回歸。
1.3.5 精密度試驗
精密吸取阿魏酸對照品溶液（45.5 μg/mL）10 μL，按上述色譜條件測得阿魏酸峰面積，連續進樣6次，測定阿魏酸的峰面積值。
精密吸取供試品溶液（批號110911）10 μL，按上述色譜條件測得阿魏酸峰面積，連續重復進樣6次，測定阿魏酸的峰面積。
1.3.6 供試品溶液的穩定性考察
取同一供試品溶液（批號：110911），分別在在1、4、12、24、48、72 h，取10 μL供試品溶液進樣，按上述色譜條件測得阿魏酸峰面積，考察供試品溶液的穩定性。
1.3.7 重復性考察
取同一批號供試品（批號：110911） 6份，分別按1.3.2項中“供試品溶液制備方法”項下平行制備6個供試品溶液，在上述色譜條件下分別按上述含量測定方法進樣測定，并計算含量。
1.3.8 加樣回收試驗
精密稱取一定量的已測知含量（88.49 μg/g）的樣品（批號：1100821）9份，分別精密加入阿魏酸對照品適量（3種不同梯度，各3份），分別按1.3.2項中“供試品溶液制備方法”項下平行制備9個供試品的溶液，按上述色譜條件下分別進樣含量測定，計算回收率。
1.3.9 樣品的含量測定
取3批中試樣品（110911、110912、110913）按上述含量測定方法，每一個批號取樣品3個，分別按1.3.2項中“供試品溶液制備方法”項下制備供試品的溶液。按上述色譜條件下分別分別精密吸取供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定阿魏酸的含量，計算出阿魏酸含量的平均值。
2 結果
2.1 專屬性試驗
陰性對照品在阿魏酸岀峰區間未出現相應色譜峰，表明該測定方法具有較好的專屬性，測定無干擾。見圖 1。
圖1
高效液相色譜圖 1a. 阿魏酸對照品 1b. 陰性對照品 1c. 川芎藥材對照 1d. 羌活藥材對照 1e. 伸筋草藥材對照 1f. 舒筋草藥材對照 1g. 供試品溶液 ? ?圖 2 阿魏酸對照品標準曲線
2.2 線性關系考察
經過線性回歸計算得阿魏酸標準曲線方程為：y=44.431x-2.158 7，R2=0.999 8，結果表明，在上述色譜條件下，阿魏酸在4.55～91.00 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。見圖 2。
2.3 精密度試驗
阿魏酸對照品溶液（n=6）和供試品溶液（n=6）阿魏酸的峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為1.566%和1.732%。
2.4 供試品溶液的穩定性考察
阿魏酸峰面積的RSD值（n=6）為1.419%。表明供試品溶液含量在72 h內穩定。
2.5 重復性考察
供試品阿魏酸含量平均值（n=6）為85.37 μg/g，RSD值為2.21%，上述結果表明測定方法有較好的重復性。
2.6 回收率試驗
阿魏酸加樣回收率試驗結果見表 1，其平均回收率為98.78%，RSD值為2.668%。該含量測定法加樣回收良好，可用于該制劑阿魏酸含量的測定。
表1
阿魏酸加樣回收率試驗結果
2.7 樣品的含量測定
3批中試樣品（110911、110912、110913）阿魏酸含量的平均值分別為85.97、86.23、87.20 μg/g。
3 討論
阿魏酸具有抗氧化、抗血栓、抗血糖、抗血脂的作用，可預防動脈粥樣硬化，還具有抗菌消炎的功效，能夠在一定程度上抑制癌細胞的發生，對預防腫瘤等疾病有很好的療效。關于阿魏酸的含量測定，有薄層掃描法、薄層分光光度法、高效液相色譜法等多種方法，其中高效液相色譜法因方法簡便、快速、準確，靈敏度高，重現性好，文獻報道大多數是采用該法對阿魏酸進行含量測定[3-16]。我們參考大量的文獻資料在進行高效液相色譜法測定阿魏酸的含量時，流動性的選擇是重要參數，絕大多數采用酸系統進行[3-16]。在對流動相的條件選擇方面，我們分別比較了甲醇-醋酸、甲醇-磷酸、乙腈-醋酸、乙腈-磷酸、甲醇-乙腈-醋酸等系統，阿魏酸在甲醇-磷酸、乙腈-醋酸系統中分離效果均不理想，從實驗發現在甲醇-醋酸系統中分離效果較佳，參照中國藥典2010版川芎項下含量測定的有關內容[17]，以甲醇-1%冰醋酸（30︰70）作為流動相，結果在此條件下，阿魏酸色譜峰峰形還不理想，與其他組分不能達到基線分離；于是又分別考察了甲醇-0.1%冰醋酸、甲醇-0.5%冰醋酸、甲醇-1%冰醋酸、甲醇-2%冰醋酸系統，最終根據阿魏酸的保留時間、峰形、分離度等色譜條件的綜合分析，找到了缺川芎、羌活、伸筋草和舒筋草的陰性對照溶液在阿魏酸的位置上無干擾的流動相條件，最終確定甲醇-2%冰醋酸系統為本研究的流動相系統。
取阿魏酸對照品的甲醇溶液，在190～400 nm波長范圍內進行掃描，結果其在320 nm處有最大吸收，故選320 nm為測定波長[18]。
由于組方的復雜性和劑型的特點，我們對影響樣品提取的條件進行了考察。根據阿魏酸的理化性質，提取方法著重考察超聲處理與加熱回流兩法，研究表明加熱回流法優于超聲處理；在溶劑的考察上，分別精密加入70%甲醇加入不同體積稀乙醇（25、30、35 mL），回流提取30 min，用30、35 mL稀乙醇提取的阿魏酸含量基本相同，與25 mL稀乙醇提取有區別，故確定溶劑用量為30 mL；考察了不同濃度的稀乙醇（50%、60%、70%）對本實驗回收率、雜質量等因素的影響進行篩選，以70%的乙醇好，故用70%乙醇作為提取溶劑。研究結果表明，將溶解阿魏酸的溶劑進行適當的調整，能夠有效的改善阿魏酸的降解情況，使得測定條件穩定，數據可靠。
由于阿魏酸對光、熱的穩定性較差，在實驗時盡量做到避光且溫度適當，因此在樣品的存放中采取了避光、冷藏措施[19]。
綜上所述，本實驗建立的高效液相色譜法，疲王按摩乳中阿魏酸與其他峰達到基線分離，方法簡便快速，準確度高，重復性好，可以作為疲王按摩乳的質量控制方法。
疲王按摩乳具有舒筋活絡、行氣活血、散寒止痛的功效，主要由伸筋草、舒筋草、川芎、紅花、大血藤、花椒、羌活、獨活等12味中藥組成，用于國家優秀運動員連續大運動量訓練后引起的運動性肌肉疲勞癥。癥見受累的肌肉、筋腱酸痛發困、發緊、發硬，壓痛之泛，多在肌腹肌腱、腱腹交接處以及肌間隔區，活動時筋肉酸痛乏力，或肌肉收縮紊亂癥[1]。查閱相關文獻資料后，伸筋草、舒筋草、川芎、羌活4味藥材均含阿魏酸，且用量較大，其功效可部分反映整個成方制劑的功效，因此對該制劑中總阿魏酸進行含量測定具有現實意義。實驗研究證實，高效液相色譜法可用于測定疲王按摩乳中的阿魏酸含量。
1 材料與方法
1.1 儀器
Agilent 1100高效液相色譜儀（美國惠普公司生產，包括G1311A四元梯度泵，VWD檢測器，G1316A柱溫箱，Agilent 1100化學色譜工作站）；AL204電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SB3200超聲清洗機（上海必能信超聲有限公司）。
1.2 試藥
阿魏酸對照品（批號110737-201012）、川芎對照品（批號120918-200809）、羌活對照品（批號120935-200506）、伸筋草對照品（批號1109-200001）均由中國藥品生物制品檢定所提供，舒筋草經鑒定藥材均符合《四川省中藥材標準》2010年版的有關規定[2]。冰醋酸和甲醇均為色譜純[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]、水為超純水（自制），其他試劑均為分析純。
疲王按摩乳樣品批號為：110821、110911、110912、110913。均由四川省骨科醫院制劑室提供。
1.3 方法
1.3.1 色譜條件
色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，北京迪馬科技有限公司）；流動相：甲醇-2%冰醋酸（32︰68）；體積流量：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：320 nm。
1.3.2 溶液制備
阿魏酸對照品溶液：取阿魏酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含10 μg阿魏酸對照品的溶液，即得。
供試品溶液：精密稱取供試品5 g，加入70%甲醇30 mL，加熱回流30 min，冰水浴20 min，使其基質析出，濾過，用70%甲醇6 mL洗滌濾器及圓底燒瓶等，洗滌2次，合并濾液，用70%甲醇稀釋并定容于50 mL棕色容量瓶中，取少量供試品溶液于離心管中，離心（離心半徑3 cm，轉速10 000 r/min，離心時間10 min）后，取上清液用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，即得。
川芎對照品溶液：將藥材粉碎，過60目篩，取本品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，稱定質量，超聲處理20 min （功率160 W，頻率50 kHz），精密稱定，用稀乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，再用微孔濾膜（0.45 μm） 濾過，即得。
羌活對照品溶液、伸筋草對照品溶液及舒筋草對照品溶液制備方法同“川芎對照品溶液”。
陰性對照品溶液：除川芎、羌活、伸筋草和舒筋草外，其他中藥飲片按供試品處方量投料，按疲王按摩乳工藝制成陰性對照品，然后再按“供試品溶液”項下方法，制成陰性對照品溶液。
1.3.3 專屬性試驗
分別取阿魏酸對照品溶液、陰性對照品溶液、4種藥材對照品溶液（川芎、羌活、伸筋草和舒筋草）及供試品溶液，注入高效液相色譜儀，按照1.3.1項“色譜條件”，在同一條件下測定。
1.3.4 線性關系考查
分別精密吸取阿魏酸對照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10 mL于10 mL棕色容量瓶中，用5%甲酸稀釋并定容，搖勻，即得4.55、9.10、27.30、45.50、72.80、91.00 μg/mL的標準供試液。精密取各供試液10 μL，進樣，按上述色譜條件測定，重復操作2次，以峰面積（A）對濃度（C）進行線性回歸。
1.3.5 精密度試驗
精密吸取阿魏酸對照品溶液（45.5 μg/mL）10 μL，按上述色譜條件測得阿魏酸峰面積，連續進樣6次，測定阿魏酸的峰面積值。
精密吸取供試品溶液（批號110911）10 μL，按上述色譜條件測得阿魏酸峰面積，連續重復進樣6次，測定阿魏酸的峰面積。
1.3.6 供試品溶液的穩定性考察
取同一供試品溶液（批號：110911），分別在在1、4、12、24、48、72 h，取10 μL供試品溶液進樣，按上述色譜條件測得阿魏酸峰面積，考察供試品溶液的穩定性。
1.3.7 重復性考察
取同一批號供試品（批號：110911） 6份，分別按1.3.2項中“供試品溶液制備方法”項下平行制備6個供試品溶液，在上述色譜條件下分別按上述含量測定方法進樣測定，并計算含量。
1.3.8 加樣回收試驗
精密稱取一定量的已測知含量（88.49 μg/g）的樣品（批號：1100821）9份，分別精密加入阿魏酸對照品適量（3種不同梯度，各3份），分別按1.3.2項中“供試品溶液制備方法”項下平行制備9個供試品的溶液，按上述色譜條件下分別進樣含量測定，計算回收率。
1.3.9 樣品的含量測定
取3批中試樣品（110911、110912、110913）按上述含量測定方法，每一個批號取樣品3個，分別按1.3.2項中“供試品溶液制備方法”項下制備供試品的溶液。按上述色譜條件下分別分別精密吸取供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定阿魏酸的含量，計算出阿魏酸含量的平均值。
2 結果
2.1 專屬性試驗
陰性對照品在阿魏酸岀峰區間未出現相應色譜峰，表明該測定方法具有較好的專屬性，測定無干擾。見圖 1。
圖1
高效液相色譜圖 1a. 阿魏酸對照品 1b. 陰性對照品 1c. 川芎藥材對照 1d. 羌活藥材對照 1e. 伸筋草藥材對照 1f. 舒筋草藥材對照 1g. 供試品溶液 ? ?圖 2 阿魏酸對照品標準曲線
2.2 線性關系考察
經過線性回歸計算得阿魏酸標準曲線方程為：y=44.431x-2.158 7，R2=0.999 8，結果表明，在上述色譜條件下，阿魏酸在4.55～91.00 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。見圖 2。
2.3 精密度試驗
阿魏酸對照品溶液（n=6）和供試品溶液（n=6）阿魏酸的峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為1.566%和1.732%。
2.4 供試品溶液的穩定性考察
阿魏酸峰面積的RSD值（n=6）為1.419%。表明供試品溶液含量在72 h內穩定。
2.5 重復性考察
供試品阿魏酸含量平均值（n=6）為85.37 μg/g，RSD值為2.21%，上述結果表明測定方法有較好的重復性。
2.6 回收率試驗
阿魏酸加樣回收率試驗結果見表 1，其平均回收率為98.78%，RSD值為2.668%。該含量測定法加樣回收良好，可用于該制劑阿魏酸含量的測定。
表1
阿魏酸加樣回收率試驗結果
2.7 樣品的含量測定
3批中試樣品（110911、110912、110913）阿魏酸含量的平均值分別為85.97、86.23、87.20 μg/g。
3 討論
阿魏酸具有抗氧化、抗血栓、抗血糖、抗血脂的作用，可預防動脈粥樣硬化，還具有抗菌消炎的功效，能夠在一定程度上抑制癌細胞的發生，對預防腫瘤等疾病有很好的療效。關于阿魏酸的含量測定，有薄層掃描法、薄層分光光度法、高效液相色譜法等多種方法，其中高效液相色譜法因方法簡便、快速、準確，靈敏度高，重現性好，文獻報道大多數是采用該法對阿魏酸進行含量測定[3-16]。我們參考大量的文獻資料在進行高效液相色譜法測定阿魏酸的含量時，流動性的選擇是重要參數，絕大多數采用酸系統進行[3-16]。在對流動相的條件選擇方面，我們分別比較了甲醇-醋酸、甲醇-磷酸、乙腈-醋酸、乙腈-磷酸、甲醇-乙腈-醋酸等系統，阿魏酸在甲醇-磷酸、乙腈-醋酸系統中分離效果均不理想，從實驗發現在甲醇-醋酸系統中分離效果較佳，參照中國藥典2010版川芎項下含量測定的有關內容[17]，以甲醇-1%冰醋酸（30︰70）作為流動相，結果在此條件下，阿魏酸色譜峰峰形還不理想，與其他組分不能達到基線分離；于是又分別考察了甲醇-0.1%冰醋酸、甲醇-0.5%冰醋酸、甲醇-1%冰醋酸、甲醇-2%冰醋酸系統，最終根據阿魏酸的保留時間、峰形、分離度等色譜條件的綜合分析，找到了缺川芎、羌活、伸筋草和舒筋草的陰性對照溶液在阿魏酸的位置上無干擾的流動相條件，最終確定甲醇-2%冰醋酸系統為本研究的流動相系統。
取阿魏酸對照品的甲醇溶液，在190～400 nm波長范圍內進行掃描，結果其在320 nm處有最大吸收，故選320 nm為測定波長[18]。
由于組方的復雜性和劑型的特點，我們對影響樣品提取的條件進行了考察。根據阿魏酸的理化性質，提取方法著重考察超聲處理與加熱回流兩法，研究表明加熱回流法優于超聲處理；在溶劑的考察上，分別精密加入70%甲醇加入不同體積稀乙醇（25、30、35 mL），回流提取30 min，用30、35 mL稀乙醇提取的阿魏酸含量基本相同，與25 mL稀乙醇提取有區別，故確定溶劑用量為30 mL；考察了不同濃度的稀乙醇（50%、60%、70%）對本實驗回收率、雜質量等因素的影響進行篩選，以70%的乙醇好，故用70%乙醇作為提取溶劑。研究結果表明，將溶解阿魏酸的溶劑進行適當的調整，能夠有效的改善阿魏酸的降解情況，使得測定條件穩定，數據可靠。
由于阿魏酸對光、熱的穩定性較差，在實驗時盡量做到避光且溫度適當，因此在樣品的存放中采取了避光、冷藏措施[19]。
綜上所述，本實驗建立的高效液相色譜法，疲王按摩乳中阿魏酸與其他峰達到基線分離，方法簡便快速，準確度高，重復性好，可以作為疲王按摩乳的質量控制方法。
