引用本文： 姚梅, 崔穎, 王月田, 張本, 付文舉. 軟骨源性形態發生蛋白1轉基因細胞片的初步探討. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(2): 142-148. doi: 10.7507/1002-1892.20140033 復制
細胞片技術（cell sheet technology，CST）[1]是組織工程中獲取種子細胞和對種子細胞進行轉移的一項新技術，它利用溫度敏感性培養皿在一定條件下可以無損傷地收獲含有細胞及細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的完整膜片狀結構。細胞片是單純的無載體結構，避免了傳統組織工程中支架或細胞注射等方法引起的排斥反應和細胞流失等缺點，提高了細胞利用率，目前已廣泛應用于牙周韌帶、皮膚、血管、角膜等組織的構建[2-3]，但軟骨源性形態發生蛋白1（cartilage-derived morphogenetic protein 1，CDMP1）轉基因細胞片方面的研究尚不多見。本研究嘗試結合轉基因技術與CST構建轉基因細胞片，從形態學、基因水平和蛋白水平對其生物學特性進行探索，以期能構建出不含載體的組織工程軟骨，為軟骨組織工程發展提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
1月齡健康新西蘭白兔1只，雌雄不限，體重1.0 kg，由遼寧醫學院動物實驗中心提供。
L-DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；FBS（HyClone公司，美國）；溫度敏感性6孔板（Nunc公司，日本）；RT-PCR試劑盒（大連Takara公司）；Trizol（Invitrogen公司，美國）；兔抗人CDMP1多克隆抗體、兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體（Abcam公司，美國）；胰蛋白酶（Sigma公司，美國）；腺病毒（adenorirus，Ad）-巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）-人CDMP1（human CDMP1，hCDMP1）-內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）-增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）病毒液和Ad-CMV-EGFP病毒液（廣州賽業生物科技有限公司）；MTT試劑盒（北京賽馳生物科技有限公司）。細胞培養箱（Heraeus公司，德國）；5100低溫離心機（KUBOTA公司，日本）；A101439電泳儀、Wide Mini Sub-Cell Electrophoresis System電泳槽、1703940轉膜儀（Bio-Rad 公司，美國）；IX71倒置熒光顯微鏡、CPH-500 倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；Labworks凝膠成像分析系統（UVP公司，美國）；Optizen 2120UV型紫外可見分光光度計（Mecasys公司，韓國）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美 國）。
1.2 BMSCs的分離培養
取1月齡新西蘭白兔，按文獻[4]方法分離培養BMSCs。無菌條件下分離兔雙側股骨，分別剪開股骨兩端，L-DMEM培養基沖洗骨髓腔，4號針頭反復吹打沖出的骨髓，100目篩網過濾，以800 r/ min離心2 min，用含10%FBS的L-DMEM培養基重懸混勻，以1 ×105個/cm2密度接種于25 cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。48 h首次半量換液，5～7 d待細胞融合達70%～ 80%時，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例進行傳代培養，取第3～6代BMSCs備用。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。
1.3 hCDMP1基因轉染BMSCs
1.3.1 實驗分組
取第4代兔BMSCs，以2 ×105 個 / cm2密度接種于6孔板，常規培養24 h后棄上清，L-DMEM培養基漂洗2遍。實驗分為3組，A組以感染復數為100[5]加入2 mL以L-DMEM培養基適當稀釋后的Ad-CMV-hCDMP1-IRES-EGFP病毒液，B組同法加入Ad-CMV-EGFP空載體腺病毒液，C組為未轉染BMSCs作為對照組。各組細胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱孵育24 h，PBS沖洗3遍，用含5%FBS的L-DMEM培養基培養，倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效果。
1.3.2 MTT法檢測基因轉染后BMSCs增殖活力
分別取上述3組處于對數生長期的細胞制成細胞懸液，調整細胞密度為2 ×105個/cm2接種于96孔板，第1～9天每天同一時間點取出1塊96孔板，參照MTT試劑盒說明行MTT法檢測波長為570 nm處吸光度（A）值，每組設3個復孔，取均值，繪制細胞生長曲線。
1.4 細胞片制備及相關檢測
1.4.1 細胞片制備
將3組細胞以5 ×107個/cm2密度接種于培養面積為9.6 cm2的溫度敏感性6孔板上，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，待細胞生長融合達90%左右時，取出培養板置于20℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中孵育15 min，細胞片即可自動脫落[6-9]。行大體及倒置相差顯微鏡觀察細胞片形態。
1.4.2 RT-PCR法檢測轉基因細胞片hCDMP1及Ⅱ型膠原α1（collagen
typeⅡα1，COL2A1）mRNA表達 將上述3組細胞連續培養14 d后收獲細胞片，按照Trizol說明書提取總RNA行RT-PCR反應，檢測目的基因hCDMP1、COL2A1的mRNA表達，以GAPDH基因作為內參，引物序列、產物長度及退火溫度見表 1。反應結束后取PCR擴增產物10 μL，與6 × loading buffer 2 μL混勻后，在含有溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠中電泳，Labworks凝膠成像分析系統拍照。
表1
各基因引物序列、產物長度及退火溫度
Table1.
Primer sequence,product size,and annealing temperature of genes
1.4.3 Western
blot檢測轉基因細胞片hCDMP1和Ⅱ型膠原蛋白表達 取上述3組細胞連續培養14 d后收獲細胞片，PBS漂洗3遍，以200 μL裂解液充分裂解各組細胞片，參照文獻[10]方法行Western blot檢測hCDMP1和Ⅱ型膠原蛋白表達。按常規方法制樣，BCA法蛋白定量，按標準曲線計算蛋白濃度，行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉印至聚偏氟乙烯膜上，行封閉、洗膜后分別與兔抗人CDMP1多克隆抗體、兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體雜交過夜，曝光、顯影，Labworks凝膠成像分析系統分析膜上目的條帶，內參為GAPDH。
1.4.4 HE染色
收集上述3組細胞連續培養14 d后收獲的細胞片，10%中性甲醛固定液浸泡、4℃過夜，次日取出后PBS漂洗數次以清除甲醛液，梯度乙醇脫水，二甲苯透明；最后行透蠟、包埋、5 μm厚切片，常規行HE染色。
1.4.5 阿利新藍染色檢測轉基因細胞片糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）表達
同1.4.4方法制備上述3組細胞片切片，用1% （V/V）阿利新藍工作液染色20～30 min，自來水流水沖洗2 min，三蒸水沖洗，晾干、脫水、中性樹膠封片，生物顯微鏡下觀察、拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測GAG含量的灰度值及陽性染色面積（n=6）。
1.5 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs形態學觀察
原代培養的BMSCs因有少量血細胞混雜，不易分辨，可見貼壁細胞呈橢圓形、三角形或多角形；72 h多數細胞開始貼壁生長，部分區域有少量細胞集落形成，呈輻射狀生長；5～7 d后貼壁細胞增多并連接成片，呈魚群狀排列（圖 1）。
圖1
原代BMSCs培養5 d形態學觀察（倒置相差顯微鏡× 40） ? ?2.2 CDMP1基因轉染BMSCs相關檢測
2.2.1 基因轉染后BMSCs的EGFP表達
倒置熒光顯微鏡下觀察示，轉染24 h后A、B組僅見微弱熒光表達，48 h開始逐漸增多，72 h可見熒光明顯增多，96 h達高峰，見大量綠色熒光，與細胞輪廓一致，轉染效率達90%以上，可持續14 d；而C組在各時間點均無綠色熒光表達。見圖 2。
2.2.2 MTT法檢測基因轉染后BMSCs增殖活力
A組BMSCs轉染后3 d進入對數生長期，6～7 d進入平臺期，9 d開始減慢；B、C組BMSCs轉染后3 d進入對數生長期，7～8 d進入平臺期，9 d開始減慢。3 組細胞生長曲線基本一致，呈S形。除1～3 d外，其余各時間點A組A值均高于B、C組，但3組間差異均無統計學意義（P＞ 0.05），見圖 3。
2.3 細胞片相關檢測
2.3.1 細胞片形態學觀察
大體觀察示，分離的細胞片層完整、有一定韌性，呈白色薄膜狀，有一定回縮，可疊加；用小鑷子輕輕將其展開，細胞片呈不規則圓形，卡尺粗略測量邊緣較溫度敏感性6孔板大小回縮0.4～0.5 cm（圖 4 a）。倒置相差顯微鏡下見細胞緊密連接，細胞形態發生變化，細胞間基質固縮，胞間距消失，細胞呈短梭形，邊界不清（圖 4 b）。
2.3.2 RT-PCR檢測
A組在123 bp和193 bp處分別出現與hCDMP1和COL2A1基因cDNA產物大小一致的電泳條帶，而B、C組均未出現電泳條帶。見圖 5。
圖5
RT-PCR檢測各組hCDMP1和COL2A1 mRNA表達 M：Marker 1：A組 2：B組 3：C組 hCDMP1 COL2A1 ? ?2.3.3 Western
blot檢測 A組出現相對分子質量分別為13 ×103 （與hCDMP1蛋白相符）和142 ×103（與Ⅱ型膠原蛋白相符）的明顯電泳條帶，而B、C組無電泳條帶出現。見圖 6。
2.3.4 HE染色
A組纖維組織豐富，細胞外基質較多，呈紅染，細胞核深染，呈藍紫色。B、C組細胞呈類圓形，細胞核深染，界限清晰，細胞外基質相對較少。見圖 7。
2.3.5 阿利新藍染色
A組阿利新藍染色陽性，細胞質及細胞膜深染，藍色異染顆粒多；B、C組阿利新藍染色陰性，呈非特異性染色。見圖 8。圖像分析顯示，A 組陽性染色面積和灰度值與B、C組比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05），B、C組間差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表 2。
表2
各組GAG陽性染色面積和灰度值比較（n=6，3 討論
軟骨作為一種無血管化組織，損傷后自身修復能力有限，成為臨床難題，軟骨組織工程的興起為其提供了良好前景。數量充足的種子細胞和良好的細胞載體支架是成功構建組織工程軟骨的關鍵[11]。但因體外培養軟骨細胞來源有限，擴增能力低，易去分化而喪失表型，難以達到組織修復所需細胞數量；傳統細胞負載于支架的方法，常因細胞利用率低、支架降解導致的纖維化和非特異性炎性反應，使得修復效果不理想。故選用何種生長因子調節及如何保證持續高效的修復效果是軟骨組織工程探索的方向。
BMSCs來源廣泛、取材簡便、易于培養、具有較強增殖能力和多向分化潛能，體外培養10代以內均能較好表達干細胞生物活性[12]，目前已廣泛應用于脂肪、肌肉、骨骼和軟骨組織工程[13]。基因強化組織工程是以MSCs作為靶細胞的基因治療和組織工程相結合的技術，在實際應用中，可通過一定載體將目的基因轉染入靶細胞中內源性誘導其分化[14]。目前基因治療多選用病毒介導法，構建病毒載體時通過去除病毒的致病基因，改造為無致病能力的缺陷病毒，保證了臨床應用的安全性。腺病毒載體被認為能高效表達外源基因，可插入最長達815 kb的外源基因，其轉染效率高，免疫排斥反應低，是理想的目的基因載體[15]。
CDMP1又稱生長分化因子5，是TGF-β超家族的成員，由Coleman等[16-17]發現；其在軟骨形成初期主要促進間充質前軟骨細胞黏附、聚集和分化，后期則顯著促進軟骨細胞成熟和肥大，具有較強誘導軟骨生成能力[18]，能分泌軟骨細胞特異性基質[19-20]。為此，本實驗選擇CDMP1作為目的基因，采用腺病毒介導的轉基因技術誘導BMSCs成軟骨分化。
然而傳統的組織工程存在支架降解、細胞流失、排斥反應等弊端，為克服這一弊端興起了CST。CST最早為Okano等[21]用于細胞培養，之后Hirose 等[22]和Yamato等[23]改進并提出了溫度敏感性培養皿的概念。溫度敏感性培養皿是通過共價嫁接溫敏聚合物聚N-聚異丙基丙烯酰胺（poly N-isopropyl acrylamide，PNIPAAm）至普通商用聚苯乙烯組織培養皿表面，當溫度高于PNIPAAm的臨界溶液溫度（32℃）時[24]，培養基表面呈疏水性，細胞可在溫度敏感性培養皿表面附著、擴展和增殖；當溫度降至32℃以下后，聚合物表面變為親水性，并在培養皿表面和培養的細胞之間形成水化層，細胞片自然形成。該方法簡便可行，收獲的細胞片是僅由細胞及其自身分泌的ECM組成的完整膜片狀結構，含有離子通道、生長因子受體和連接蛋白等重要的細胞表面蛋白，是一種具有極高細胞利用率的全新細胞接種方式。目前已廣泛應用于構建牙周韌帶、皮膚、血管、角膜等組織，在心肌、腎小球及骨骼重建等方面的應用漸趨成熟[25-27]，但轉基因細胞片方面的研究尚不多見。
基于以上基礎，我們嘗試構建轉基因細胞片，探索其生物活性，以期為組織工程提供新思路。本實驗選擇BMSCs作為種子細胞，采用密度梯度離心和貼壁培養相結合的方法體外擴增培養純化的兔BMSCs，應用腺病毒轉基因技術將hCDMP1基因轉染至兔BMSCs，實現了高效率的基因轉入，MTT檢測顯示腺病毒介導的轉基因技術未影響兔BMSCs的增殖活力。本研究將組織工程和基因工程相結合，利用溫度敏感性6孔板，在體外成功收獲了完整的、肉眼可見的三維立體細胞片。通過對該細胞片進行RT-PCR檢測，結果顯示A組在123 bp和193 bp處分別出現與hCDMP1和COL2A1基因cDNA產物大小一致的電泳條帶，而B、C組均未出現電泳條帶；Western blot檢測示A組出現相對分子質量分別為13 ×103 （與hCDMP1蛋白相符）和142 ×103（與Ⅱ型膠原相符）的明顯電泳條帶，而B、C組無電泳條帶。說明hCDMP1基因成功轉入兔BMSCS并在細胞內及其細胞片中高效表達，轉染hCDMP1的BMSCs細胞片具有良好的成軟骨分化活性。我們通過對細胞片行HE染色和阿利新藍染色，結果顯示A組BMSCs細胞片纖維組織豐富，ECM較多，藍色異染顆粒多，GAG陽性染色面積和灰度值與B、C組比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。
綜上述，通過腺病毒轉基因技術介導的hCDMP1基因轉染效率高，不影響細胞的生長活性；體外采用溫度敏感性6孔板成功收獲了完整的hCDMP1轉基因細胞片，避免了胰蛋白酶的消化損害作用，保護了重要的細胞表面蛋白，使細胞片活性得以更大程度保留，具有成軟骨分化特異性表達。但我們的研究尚處于體外轉基因細胞片探索的初步階段，對于其后期是否可通過疊加多層細胞片形成致密軟骨組織及其體內修復軟骨缺損，尚需進一步探討。
細胞片技術（cell sheet technology，CST）[1]是組織工程中獲取種子細胞和對種子細胞進行轉移的一項新技術，它利用溫度敏感性培養皿在一定條件下可以無損傷地收獲含有細胞及細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的完整膜片狀結構。細胞片是單純的無載體結構，避免了傳統組織工程中支架或細胞注射等方法引起的排斥反應和細胞流失等缺點，提高了細胞利用率，目前已廣泛應用于牙周韌帶、皮膚、血管、角膜等組織的構建[2-3]，但軟骨源性形態發生蛋白1（cartilage-derived morphogenetic protein 1，CDMP1）轉基因細胞片方面的研究尚不多見。本研究嘗試結合轉基因技術與CST構建轉基因細胞片，從形態學、基因水平和蛋白水平對其生物學特性進行探索，以期能構建出不含載體的組織工程軟骨，為軟骨組織工程發展提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
1月齡健康新西蘭白兔1只，雌雄不限，體重1.0 kg，由遼寧醫學院動物實驗中心提供。
L-DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；FBS（HyClone公司，美國）；溫度敏感性6孔板（Nunc公司，日本）；RT-PCR試劑盒（大連Takara公司）；Trizol（Invitrogen公司，美國）；兔抗人CDMP1多克隆抗體、兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體（Abcam公司，美國）；胰蛋白酶（Sigma公司，美國）；腺病毒（adenorirus，Ad）-巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）-人CDMP1（human CDMP1，hCDMP1）-內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）-增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）病毒液和Ad-CMV-EGFP病毒液（廣州賽業生物科技有限公司）；MTT試劑盒（北京賽馳生物科技有限公司）。細胞培養箱（Heraeus公司，德國）；5100低溫離心機（KUBOTA公司，日本）；A101439電泳儀、Wide Mini Sub-Cell Electrophoresis System電泳槽、1703940轉膜儀（Bio-Rad 公司，美國）；IX71倒置熒光顯微鏡、CPH-500 倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；Labworks凝膠成像分析系統（UVP公司，美國）；Optizen 2120UV型紫外可見分光光度計（Mecasys公司，韓國）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美 國）。
1.2 BMSCs的分離培養
取1月齡新西蘭白兔，按文獻[4]方法分離培養BMSCs。無菌條件下分離兔雙側股骨，分別剪開股骨兩端，L-DMEM培養基沖洗骨髓腔，4號針頭反復吹打沖出的骨髓，100目篩網過濾，以800 r/ min離心2 min，用含10%FBS的L-DMEM培養基重懸混勻，以1 ×105個/cm2密度接種于25 cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。48 h首次半量換液，5～7 d待細胞融合達70%～ 80%時，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例進行傳代培養，取第3～6代BMSCs備用。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。
1.3 hCDMP1基因轉染BMSCs
1.3.1 實驗分組
取第4代兔BMSCs，以2 ×105 個 / cm2密度接種于6孔板，常規培養24 h后棄上清，L-DMEM培養基漂洗2遍。實驗分為3組，A組以感染復數為100[5]加入2 mL以L-DMEM培養基適當稀釋后的Ad-CMV-hCDMP1-IRES-EGFP病毒液，B組同法加入Ad-CMV-EGFP空載體腺病毒液，C組為未轉染BMSCs作為對照組。各組細胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱孵育24 h，PBS沖洗3遍，用含5%FBS的L-DMEM培養基培養，倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效果。
1.3.2 MTT法檢測基因轉染后BMSCs增殖活力
分別取上述3組處于對數生長期的細胞制成細胞懸液，調整細胞密度為2 ×105個/cm2接種于96孔板，第1～9天每天同一時間點取出1塊96孔板，參照MTT試劑盒說明行MTT法檢測波長為570 nm處吸光度（A）值，每組設3個復孔，取均值，繪制細胞生長曲線。
1.4 細胞片制備及相關檢測
1.4.1 細胞片制備
將3組細胞以5 ×107個/cm2密度接種于培養面積為9.6 cm2的溫度敏感性6孔板上，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，待細胞生長融合達90%左右時，取出培養板置于20℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中孵育15 min，細胞片即可自動脫落[6-9]。行大體及倒置相差顯微鏡觀察細胞片形態。
1.4.2 RT-PCR法檢測轉基因細胞片hCDMP1及Ⅱ型膠原α1（collagen
typeⅡα1，COL2A1）mRNA表達 將上述3組細胞連續培養14 d后收獲細胞片，按照Trizol說明書提取總RNA行RT-PCR反應，檢測目的基因hCDMP1、COL2A1的mRNA表達，以GAPDH基因作為內參，引物序列、產物長度及退火溫度見表 1。反應結束后取PCR擴增產物10 μL，與6 × loading buffer 2 μL混勻后，在含有溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠中電泳，Labworks凝膠成像分析系統拍照。
表1
各基因引物序列、產物長度及退火溫度
Table1.
Primer sequence,product size,and annealing temperature of genes
1.4.3 Western
blot檢測轉基因細胞片hCDMP1和Ⅱ型膠原蛋白表達 取上述3組細胞連續培養14 d后收獲細胞片，PBS漂洗3遍，以200 μL裂解液充分裂解各組細胞片，參照文獻[10]方法行Western blot檢測hCDMP1和Ⅱ型膠原蛋白表達。按常規方法制樣，BCA法蛋白定量，按標準曲線計算蛋白濃度，行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉印至聚偏氟乙烯膜上，行封閉、洗膜后分別與兔抗人CDMP1多克隆抗體、兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體雜交過夜，曝光、顯影，Labworks凝膠成像分析系統分析膜上目的條帶，內參為GAPDH。
1.4.4 HE染色
收集上述3組細胞連續培養14 d后收獲的細胞片，10%中性甲醛固定液浸泡、4℃過夜，次日取出后PBS漂洗數次以清除甲醛液，梯度乙醇脫水，二甲苯透明；最后行透蠟、包埋、5 μm厚切片，常規行HE染色。
1.4.5 阿利新藍染色檢測轉基因細胞片糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）表達
同1.4.4方法制備上述3組細胞片切片，用1% （V/V）阿利新藍工作液染色20～30 min，自來水流水沖洗2 min，三蒸水沖洗，晾干、脫水、中性樹膠封片，生物顯微鏡下觀察、拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測GAG含量的灰度值及陽性染色面積（n=6）。
1.5 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs形態學觀察
原代培養的BMSCs因有少量血細胞混雜，不易分辨，可見貼壁細胞呈橢圓形、三角形或多角形；72 h多數細胞開始貼壁生長，部分區域有少量細胞集落形成，呈輻射狀生長；5～7 d后貼壁細胞增多并連接成片，呈魚群狀排列（圖 1）。
圖1
原代BMSCs培養5 d形態學觀察（倒置相差顯微鏡× 40） ? ?2.2 CDMP1基因轉染BMSCs相關檢測
2.2.1 基因轉染后BMSCs的EGFP表達
倒置熒光顯微鏡下觀察示，轉染24 h后A、B組僅見微弱熒光表達，48 h開始逐漸增多，72 h可見熒光明顯增多，96 h達高峰，見大量綠色熒光，與細胞輪廓一致，轉染效率達90%以上，可持續14 d；而C組在各時間點均無綠色熒光表達。見圖 2。
2.2.2 MTT法檢測基因轉染后BMSCs增殖活力
A組BMSCs轉染后3 d進入對數生長期，6～7 d進入平臺期，9 d開始減慢；B、C組BMSCs轉染后3 d進入對數生長期，7～8 d進入平臺期，9 d開始減慢。3 組細胞生長曲線基本一致，呈S形。除1～3 d外，其余各時間點A組A值均高于B、C組，但3組間差異均無統計學意義（P＞ 0.05），見圖 3。
2.3 細胞片相關檢測
2.3.1 細胞片形態學觀察
大體觀察示，分離的細胞片層完整、有一定韌性，呈白色薄膜狀，有一定回縮，可疊加；用小鑷子輕輕將其展開，細胞片呈不規則圓形，卡尺粗略測量邊緣較溫度敏感性6孔板大小回縮0.4～0.5 cm（圖 4 a）。倒置相差顯微鏡下見細胞緊密連接，細胞形態發生變化，細胞間基質固縮，胞間距消失，細胞呈短梭形，邊界不清（圖 4 b）。
2.3.2 RT-PCR檢測
A組在123 bp和193 bp處分別出現與hCDMP1和COL2A1基因cDNA產物大小一致的電泳條帶，而B、C組均未出現電泳條帶。見圖 5。
圖5
RT-PCR檢測各組hCDMP1和COL2A1 mRNA表達 M：Marker 1：A組 2：B組 3：C組 hCDMP1 COL2A1 ? ?2.3.3 Western
blot檢測 A組出現相對分子質量分別為13 ×103 （與hCDMP1蛋白相符）和142 ×103（與Ⅱ型膠原蛋白相符）的明顯電泳條帶，而B、C組無電泳條帶出現。見圖 6。
2.3.4 HE染色
A組纖維組織豐富，細胞外基質較多，呈紅染，細胞核深染，呈藍紫色。B、C組細胞呈類圓形，細胞核深染，界限清晰，細胞外基質相對較少。見圖 7。
2.3.5 阿利新藍染色
A組阿利新藍染色陽性，細胞質及細胞膜深染，藍色異染顆粒多；B、C組阿利新藍染色陰性，呈非特異性染色。見圖 8。圖像分析顯示，A 組陽性染色面積和灰度值與B、C組比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05），B、C組間差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表 2。
表2
各組GAG陽性染色面積和灰度值比較（n=6，3 討論
軟骨作為一種無血管化組織，損傷后自身修復能力有限，成為臨床難題，軟骨組織工程的興起為其提供了良好前景。數量充足的種子細胞和良好的細胞載體支架是成功構建組織工程軟骨的關鍵[11]。但因體外培養軟骨細胞來源有限，擴增能力低，易去分化而喪失表型，難以達到組織修復所需細胞數量；傳統細胞負載于支架的方法，常因細胞利用率低、支架降解導致的纖維化和非特異性炎性反應，使得修復效果不理想。故選用何種生長因子調節及如何保證持續高效的修復效果是軟骨組織工程探索的方向。
BMSCs來源廣泛、取材簡便、易于培養、具有較強增殖能力和多向分化潛能，體外培養10代以內均能較好表達干細胞生物活性[12]，目前已廣泛應用于脂肪、肌肉、骨骼和軟骨組織工程[13]。基因強化組織工程是以MSCs作為靶細胞的基因治療和組織工程相結合的技術，在實際應用中，可通過一定載體將目的基因轉染入靶細胞中內源性誘導其分化[14]。目前基因治療多選用病毒介導法，構建病毒載體時通過去除病毒的致病基因，改造為無致病能力的缺陷病毒，保證了臨床應用的安全性。腺病毒載體被認為能高效表達外源基因，可插入最長達815 kb的外源基因，其轉染效率高，免疫排斥反應低，是理想的目的基因載體[15]。
CDMP1又稱生長分化因子5，是TGF-β超家族的成員，由Coleman等[16-17]發現；其在軟骨形成初期主要促進間充質前軟骨細胞黏附、聚集和分化，后期則顯著促進軟骨細胞成熟和肥大，具有較強誘導軟骨生成能力[18]，能分泌軟骨細胞特異性基質[19-20]。為此，本實驗選擇CDMP1作為目的基因，采用腺病毒介導的轉基因技術誘導BMSCs成軟骨分化。
然而傳統的組織工程存在支架降解、細胞流失、排斥反應等弊端，為克服這一弊端興起了CST。CST最早為Okano等[21]用于細胞培養，之后Hirose 等[22]和Yamato等[23]改進并提出了溫度敏感性培養皿的概念。溫度敏感性培養皿是通過共價嫁接溫敏聚合物聚N-聚異丙基丙烯酰胺（poly N-isopropyl acrylamide，PNIPAAm）至普通商用聚苯乙烯組織培養皿表面，當溫度高于PNIPAAm的臨界溶液溫度（32℃）時[24]，培養基表面呈疏水性，細胞可在溫度敏感性培養皿表面附著、擴展和增殖；當溫度降至32℃以下后，聚合物表面變為親水性，并在培養皿表面和培養的細胞之間形成水化層，細胞片自然形成。該方法簡便可行，收獲的細胞片是僅由細胞及其自身分泌的ECM組成的完整膜片狀結構，含有離子通道、生長因子受體和連接蛋白等重要的細胞表面蛋白，是一種具有極高細胞利用率的全新細胞接種方式。目前已廣泛應用于構建牙周韌帶、皮膚、血管、角膜等組織，在心肌、腎小球及骨骼重建等方面的應用漸趨成熟[25-27]，但轉基因細胞片方面的研究尚不多見。
基于以上基礎，我們嘗試構建轉基因細胞片，探索其生物活性，以期為組織工程提供新思路。本實驗選擇BMSCs作為種子細胞，采用密度梯度離心和貼壁培養相結合的方法體外擴增培養純化的兔BMSCs，應用腺病毒轉基因技術將hCDMP1基因轉染至兔BMSCs，實現了高效率的基因轉入，MTT檢測顯示腺病毒介導的轉基因技術未影響兔BMSCs的增殖活力。本研究將組織工程和基因工程相結合，利用溫度敏感性6孔板，在體外成功收獲了完整的、肉眼可見的三維立體細胞片。通過對該細胞片進行RT-PCR檢測，結果顯示A組在123 bp和193 bp處分別出現與hCDMP1和COL2A1基因cDNA產物大小一致的電泳條帶，而B、C組均未出現電泳條帶；Western blot檢測示A組出現相對分子質量分別為13 ×103 （與hCDMP1蛋白相符）和142 ×103（與Ⅱ型膠原相符）的明顯電泳條帶，而B、C組無電泳條帶。說明hCDMP1基因成功轉入兔BMSCS并在細胞內及其細胞片中高效表達，轉染hCDMP1的BMSCs細胞片具有良好的成軟骨分化活性。我們通過對細胞片行HE染色和阿利新藍染色，結果顯示A組BMSCs細胞片纖維組織豐富，ECM較多，藍色異染顆粒多，GAG陽性染色面積和灰度值與B、C組比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。
綜上述，通過腺病毒轉基因技術介導的hCDMP1基因轉染效率高，不影響細胞的生長活性；體外采用溫度敏感性6孔板成功收獲了完整的hCDMP1轉基因細胞片，避免了胰蛋白酶的消化損害作用，保護了重要的細胞表面蛋白，使細胞片活性得以更大程度保留，具有成軟骨分化特異性表達。但我們的研究尚處于體外轉基因細胞片探索的初步階段，對于其后期是否可通過疊加多層細胞片形成致密軟骨組織及其體內修復軟骨缺損，尚需進一步探討。
