引用本文： 程相國, 胡斌, 盛加根, 張長青. 應用基因芯片技術對激素性股骨頭缺血性壞死差異表達基因篩選的初步研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(5): 586-590. doi: 10.7507/1002-1892.20140131 復制
股骨頭缺血性壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是由多種病因引起股骨頭血供障礙所致，其致殘率高，是臨床亟待解決的重大難題[1-3]。其中糖皮質激素引起的ONFH占非創傷性ONFH的首位[1-4]，其發病機制有10余種假說，主要包括脂質代謝紊亂、骨內壓增高、BMSCs的成脂分化、微血管損傷及血管內凝血等，目前傾向于為多因素所致[5-11]。研究表明，不同人群對糖皮質激素的反應存在個體差異[12]，但罕見在基因水平分析該差異表達的研究報道。基因芯片技術能對微量樣品中核酸序列進行檢測和分析，具有快速、準確、高效等特點，已廣泛應用于分子生物學研究領域 [13]。本研究采用基因芯片技術檢測激素性ONFH骨組織和正常骨組織中基因表達的差異，篩選相關基因群，為進一步研究ONFH的發病機制提供參考。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
Trizol（Invitrogen公司，美國）；Cy3-dUTP、Cy5-dUTP（Amersham-Pharmacia公司，英國）；焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC；上海生工生物工程有限公司）。Agilent掃描儀（GenePix公司，美國）；PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；臺式多功能冷凍離心機（Eppendorf公司，德國）；雜交箱（UVP公司，美國）；GeneSpring分析軟件（Agilent公司，美國）；Cluster分析軟件（美國斯坦福大學）。
1.2 實驗標本
本實驗共納入4例股骨頭組織標本。其中3例由激素性ONFH男性患者自愿捐贈，為吻合血管游離腓骨移植術中切取的壞死股骨頭組織；患者年齡分別為25、31、38歲；應用糖皮質激素治療的原發病分別為面神經麻痹、動眼神經麻痹和腦外傷；每例患者激素累計用量均超過1 800 mg；接受糖皮質激素治療距發生ONFH時間為6～32個月，平均20個月；均經MRI檢查確診。另1例取自因交通意外死亡的26歲健康男性捐獻者尸體，X線片檢查證實雙側髖關節無異常改變。4例股骨頭組織均制備為1 cm × 1 cm × 1 cm大小標本，取一部分置于4%多聚甲醛溶液固定，另一部分經DEPC漂洗后液氮凍存備用。
1.3 觀測指標
1.3.1 組織學檢查
取4%多聚甲醛溶液固定24 h的標本，EDTA微波脫鈣，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，5 μm厚切片，常規HE染色，光鏡下觀察。
1.3.2 總RNA抽提
取液氮凍存標本，每例100 mg，分別置于液氮預冷的研缽中研磨成粉末狀。加入1 mL Trizol，混勻靜置5 min；加入0.2 mL氯仿，充分混勻，室溫靜置3 min；4℃以12 000 × g 離心15 min。取上清液，加入0.5 mL異丙醇，室溫靜置10 min；同上法離心10 min。棄上清，加入1 mL預冷的75%乙醇溶液洗滌；4℃以7 500 × g 離心5 min。棄上清，氣干沉淀5～10 min，加入20～30 μL無核酸酶純水完全溶解沉淀并保存于-80℃。對總RNA的純度進行電泳測定。
1.3.3 基因芯片技術篩選差異表達基因
采用逆轉錄標記法進行探針標記。用Cy3-dUTP標記正常股骨頭組織的RNA，Cy5-dUTP標記激素性ONFH骨組織的RNA。將預雜交后的芯片置于95℃水浴中變性30 s，浸無水乙醇30 s；探針置于95℃水浴中變性2 min，取出后迅速置于冰上。然后將探針置于芯片上，蓋玻片覆蓋，放入42℃雜交箱內，避光雜交18 h后洗滌。將分別裝有溶液Ⅰ（1 × SSC + 0.2% SDS）、溶液Ⅱ（1 × SSC + 0.2% Tween）的染色缸，置于25℃水浴鍋中。雜交后的芯片依次浸入以上2個染色缸中洗滌6 min，0.1 × SSC 沖洗玻片，室溫下晾干。使用Agilent掃描儀獲取圖像，掃描像素值10 μm。將Cy3和Cy5的原始信號數據導入GeneSpring分析軟件進行數據分析和標準化處理，Cluster分析軟件進行層級聚類分析。采用標準化后的Cy3和Cy5值計算Cy3/Cy5比值，比值＜ 0.5為表達減弱，比值＞ 2為表達增強。
2 結果
2.1 組織學觀察
鏡下觀察示，正常股骨頭標本可見由板層骨構成的完整骨單位，板層骨連續完整，圍繞血管呈同心圓排列，骨小梁陷窩內可見正常骨細胞（圖 1 a）。激素性ONFH標本可見髓腔內脂肪組織、脂肪細胞增多并充填于髓腔，微血管受擠壓；骨小梁內骨細胞減少，核染色質深染，細胞核固縮、裂解或消失；部分骨陷窩中骨細胞消失，骨小梁變細、稀疏、中斷，單位視野內骨組織面積減小（圖 1 b）。
圖1
組織學觀察股骨頭組織（HE × 20） ? 正常股骨頭標本 ? 激素性ONFH標本
Figure1.
The histological observation of the femoral head tissue (HE × 20) ? Normal femoral head ? Steroid-induced ONFH
2.2 總RNA抽提結果
總RNA抽提電泳圖顯示，4個樣本總RNA 28S、18S的條帶清晰，亮度比約為2∶1，提示總RNA質量好，可以進行芯片實驗。見圖 2。
圖2
總RNA抽提電泳圖 1～3：激素性ONFH標本 4：正常股骨頭標本
Figure2.
The electrophoretogram of total RNA 1-3: Steroid-induced ONFH 4: Normal femoral head
2.3 差異表達基因篩選
4例樣本完成3組基因芯片。與正常股骨頭組織相比，1號患者上調基因140條，下調基因123條；2號患者上調基因118條，下調基因123條；3號患者上調基因120條，下調基因73條。其中44條基因在3張芯片中均出現差異表達，其中上調基因28條，下調基因16條。將其按功能分析并大體歸為7大類：細胞代謝基因、信號轉導基因、基因與蛋白表達基因、細胞分裂基因、細胞防御基因、細胞結構/細胞運動基因以及未分類基因。見表 1、2。
表1
表達上調的基因名稱和功能分類
Table1.
Name and functional classification of the up-regulated expression genes
表2
表達下調基因的名稱和功能分類
Table2.
Name and functional classification of the down-regulated expression genes
3 討論
基因芯片又稱基因微矩陣或cDNA微矩陣，是將大量靶基因片段有序、高密度排列在玻璃或硅膠等載體上，再將樣品用熒光染料標記制備成探針，與芯片進行分子雜交，檢測雜交信號強度，并經計算機分析和數據處理，對基因序列和功能進行大規模、高通量的研究[14]。本研究主要通過基因芯片技術檢測激素性ONFH組織和正常股骨頭組織中基因表達的差異，篩選出相關基因群，嘗試從基因水平揭示激素性ONFH的發病機制。
本項研究應用含有12 722個基因的基因芯片技術，在全基因組范圍內比較正常股骨頭組織與激素性ONFH組織之間基因表達差異，發現了44條表達有顯著差異的基因，其中上調基因28條，下調基因16條，涉及7大類基因。將篩選出的基因在Gene Bank進行檢索分析，選出與骨代謝密切相關的TSG101基因及SMAD5基因進行分析。
3.1 TSG101
TSG101基因是一個泛表達基因，幾乎表達于所有組織，腦及妊娠期乳腺表達水平最高，肝臟中最低[15-16]。TSG101蛋白無論在小鼠或人細胞中均維持穩定含量，含量不足或過量均可引起細胞轉化或細胞周期紊亂[17]。Wagner等[18]的研究結果顯示，外源性TSG101基因過度表達可造成內生性及外源性TSG101蛋白降解，以免TSG101蛋白在細胞中堆積；而TSG101蛋白的連續過表達將加速細胞內所有TSG101蛋白降解，使細胞內TSG101蛋白被外源性TSG101蛋白取代。Ma等 [19] 報道，當小鼠體內TSG101缺乏時可導致p53蓄積及細胞分化增殖障礙，從而導致細胞凋亡。同時，TSG101還參與了缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α） 的表達，而HIF-1α的高表達與激素性ONFH的發生密切相[20-21]，但TSG101的表達與ONFH的關系有待進一步分析和研究。
3.2 SMAD5
SMAD5基因是TGF-β 信號轉導途徑中的一個重要新基因家族--SMADs家族成員之一[22]。SMAD5基因所編碼的蛋白為受體激活型SMAD，也稱為途徑限制型SMAD。SMAD5與SMAD1（可能還有SMAD8、9）分別與特異的Ⅰ型Ser/Thr激酶受體作用，并被磷酸化；磷酸化的SMAD與通用型SMAD形成復合物后轉移至核內，調節靶基因對TGF-β的信號應答。Gr?nroos等[23]報道，SMAD5是BMP特異的細胞內信號轉導基因，SMAD5被BMP受體磷酸化后，介導BMP信號，BMP受體對受體激活型SMADs的磷酸化，使活化的SMADs構象發生變化并從BMP受體上解離下來，并與SMAD5結合，結合后異源寡聚物轉移至核內，激活特定基因的轉錄。BMPs除BMP-1外，同屬于TGF-β超家族成員，而BMP在人體骨與軟骨組織生成過程中具有重要作用。許多研究表明，SMAD5可以調節血管重塑過程，促進細胞外基質形成，促進基質細胞分化成血管平滑肌細胞并抑制血管內皮細胞生長[24-26]。目前，尚缺乏SMAD5與ONFH之間關系的相關報道，在本研究中SMAD基因上調可能與ONFH發生后的修復有關。
ONFH的發病機制十分復雜，采用基因芯片技術對其差異表達基因進行篩選，可能有助于從基因水平揭示該病的發病機制。下一步我們將應用顯著性分析方法和頂級評分基因方法對數據進一步分析與挖掘，以期初步構建激素性ONFH的基因調控網絡。
股骨頭缺血性壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是由多種病因引起股骨頭血供障礙所致，其致殘率高，是臨床亟待解決的重大難題[1-3]。其中糖皮質激素引起的ONFH占非創傷性ONFH的首位[1-4]，其發病機制有10余種假說，主要包括脂質代謝紊亂、骨內壓增高、BMSCs的成脂分化、微血管損傷及血管內凝血等，目前傾向于為多因素所致[5-11]。研究表明，不同人群對糖皮質激素的反應存在個體差異[12]，但罕見在基因水平分析該差異表達的研究報道。基因芯片技術能對微量樣品中核酸序列進行檢測和分析，具有快速、準確、高效等特點，已廣泛應用于分子生物學研究領域 [13]。本研究采用基因芯片技術檢測激素性ONFH骨組織和正常骨組織中基因表達的差異，篩選相關基因群，為進一步研究ONFH的發病機制提供參考。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
Trizol（Invitrogen公司，美國）；Cy3-dUTP、Cy5-dUTP（Amersham-Pharmacia公司，英國）；焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC；上海生工生物工程有限公司）。Agilent掃描儀（GenePix公司，美國）；PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；臺式多功能冷凍離心機（Eppendorf公司，德國）；雜交箱（UVP公司，美國）；GeneSpring分析軟件（Agilent公司，美國）；Cluster分析軟件（美國斯坦福大學）。
1.2 實驗標本
本實驗共納入4例股骨頭組織標本。其中3例由激素性ONFH男性患者自愿捐贈，為吻合血管游離腓骨移植術中切取的壞死股骨頭組織；患者年齡分別為25、31、38歲；應用糖皮質激素治療的原發病分別為面神經麻痹、動眼神經麻痹和腦外傷；每例患者激素累計用量均超過1 800 mg；接受糖皮質激素治療距發生ONFH時間為6～32個月，平均20個月；均經MRI檢查確診。另1例取自因交通意外死亡的26歲健康男性捐獻者尸體，X線片檢查證實雙側髖關節無異常改變。4例股骨頭組織均制備為1 cm × 1 cm × 1 cm大小標本，取一部分置于4%多聚甲醛溶液固定，另一部分經DEPC漂洗后液氮凍存備用。
1.3 觀測指標
1.3.1 組織學檢查
取4%多聚甲醛溶液固定24 h的標本，EDTA微波脫鈣，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，5 μm厚切片，常規HE染色，光鏡下觀察。
1.3.2 總RNA抽提
取液氮凍存標本，每例100 mg，分別置于液氮預冷的研缽中研磨成粉末狀。加入1 mL Trizol，混勻靜置5 min；加入0.2 mL氯仿，充分混勻，室溫靜置3 min；4℃以12 000 × g 離心15 min。取上清液，加入0.5 mL異丙醇，室溫靜置10 min；同上法離心10 min。棄上清，加入1 mL預冷的75%乙醇溶液洗滌；4℃以7 500 × g 離心5 min。棄上清，氣干沉淀5～10 min，加入20～30 μL無核酸酶純水完全溶解沉淀并保存于-80℃。對總RNA的純度進行電泳測定。
1.3.3 基因芯片技術篩選差異表達基因
采用逆轉錄標記法進行探針標記。用Cy3-dUTP標記正常股骨頭組織的RNA，Cy5-dUTP標記激素性ONFH骨組織的RNA。將預雜交后的芯片置于95℃水浴中變性30 s，浸無水乙醇30 s；探針置于95℃水浴中變性2 min，取出后迅速置于冰上。然后將探針置于芯片上，蓋玻片覆蓋，放入42℃雜交箱內，避光雜交18 h后洗滌。將分別裝有溶液Ⅰ（1 × SSC + 0.2% SDS）、溶液Ⅱ（1 × SSC + 0.2% Tween）的染色缸，置于25℃水浴鍋中。雜交后的芯片依次浸入以上2個染色缸中洗滌6 min，0.1 × SSC 沖洗玻片，室溫下晾干。使用Agilent掃描儀獲取圖像，掃描像素值10 μm。將Cy3和Cy5的原始信號數據導入GeneSpring分析軟件進行數據分析和標準化處理，Cluster分析軟件進行層級聚類分析。采用標準化后的Cy3和Cy5值計算Cy3/Cy5比值，比值＜ 0.5為表達減弱，比值＞ 2為表達增強。
2 結果
2.1 組織學觀察
鏡下觀察示，正常股骨頭標本可見由板層骨構成的完整骨單位，板層骨連續完整，圍繞血管呈同心圓排列，骨小梁陷窩內可見正常骨細胞（圖 1 a）。激素性ONFH標本可見髓腔內脂肪組織、脂肪細胞增多并充填于髓腔，微血管受擠壓；骨小梁內骨細胞減少，核染色質深染，細胞核固縮、裂解或消失；部分骨陷窩中骨細胞消失，骨小梁變細、稀疏、中斷，單位視野內骨組織面積減小（圖 1 b）。
圖1
組織學觀察股骨頭組織（HE × 20） ? 正常股骨頭標本 ? 激素性ONFH標本
Figure1.
The histological observation of the femoral head tissue (HE × 20) ? Normal femoral head ? Steroid-induced ONFH
2.2 總RNA抽提結果
總RNA抽提電泳圖顯示，4個樣本總RNA 28S、18S的條帶清晰，亮度比約為2∶1，提示總RNA質量好，可以進行芯片實驗。見圖 2。
圖2
總RNA抽提電泳圖 1～3：激素性ONFH標本 4：正常股骨頭標本
Figure2.
The electrophoretogram of total RNA 1-3: Steroid-induced ONFH 4: Normal femoral head
2.3 差異表達基因篩選
4例樣本完成3組基因芯片。與正常股骨頭組織相比，1號患者上調基因140條，下調基因123條；2號患者上調基因118條，下調基因123條；3號患者上調基因120條，下調基因73條。其中44條基因在3張芯片中均出現差異表達，其中上調基因28條，下調基因16條。將其按功能分析并大體歸為7大類：細胞代謝基因、信號轉導基因、基因與蛋白表達基因、細胞分裂基因、細胞防御基因、細胞結構/細胞運動基因以及未分類基因。見表 1、2。
表1
表達上調的基因名稱和功能分類
Table1.
Name and functional classification of the up-regulated expression genes
表2
表達下調基因的名稱和功能分類
Table2.
Name and functional classification of the down-regulated expression genes
3 討論
基因芯片又稱基因微矩陣或cDNA微矩陣，是將大量靶基因片段有序、高密度排列在玻璃或硅膠等載體上，再將樣品用熒光染料標記制備成探針，與芯片進行分子雜交，檢測雜交信號強度，并經計算機分析和數據處理，對基因序列和功能進行大規模、高通量的研究[14]。本研究主要通過基因芯片技術檢測激素性ONFH組織和正常股骨頭組織中基因表達的差異，篩選出相關基因群，嘗試從基因水平揭示激素性ONFH的發病機制。
本項研究應用含有12 722個基因的基因芯片技術，在全基因組范圍內比較正常股骨頭組織與激素性ONFH組織之間基因表達差異，發現了44條表達有顯著差異的基因，其中上調基因28條，下調基因16條，涉及7大類基因。將篩選出的基因在Gene Bank進行檢索分析，選出與骨代謝密切相關的TSG101基因及SMAD5基因進行分析。
3.1 TSG101
TSG101基因是一個泛表達基因，幾乎表達于所有組織，腦及妊娠期乳腺表達水平最高，肝臟中最低[15-16]。TSG101蛋白無論在小鼠或人細胞中均維持穩定含量，含量不足或過量均可引起細胞轉化或細胞周期紊亂[17]。Wagner等[18]的研究結果顯示，外源性TSG101基因過度表達可造成內生性及外源性TSG101蛋白降解，以免TSG101蛋白在細胞中堆積；而TSG101蛋白的連續過表達將加速細胞內所有TSG101蛋白降解，使細胞內TSG101蛋白被外源性TSG101蛋白取代。Ma等 [19] 報道，當小鼠體內TSG101缺乏時可導致p53蓄積及細胞分化增殖障礙，從而導致細胞凋亡。同時，TSG101還參與了缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α） 的表達，而HIF-1α的高表達與激素性ONFH的發生密切相[20-21]，但TSG101的表達與ONFH的關系有待進一步分析和研究。
3.2 SMAD5
SMAD5基因是TGF-β 信號轉導途徑中的一個重要新基因家族--SMADs家族成員之一[22]。SMAD5基因所編碼的蛋白為受體激活型SMAD，也稱為途徑限制型SMAD。SMAD5與SMAD1（可能還有SMAD8、9）分別與特異的Ⅰ型Ser/Thr激酶受體作用，并被磷酸化；磷酸化的SMAD與通用型SMAD形成復合物后轉移至核內，調節靶基因對TGF-β的信號應答。Gr?nroos等[23]報道，SMAD5是BMP特異的細胞內信號轉導基因，SMAD5被BMP受體磷酸化后，介導BMP信號，BMP受體對受體激活型SMADs的磷酸化，使活化的SMADs構象發生變化并從BMP受體上解離下來，并與SMAD5結合，結合后異源寡聚物轉移至核內，激活特定基因的轉錄。BMPs除BMP-1外，同屬于TGF-β超家族成員，而BMP在人體骨與軟骨組織生成過程中具有重要作用。許多研究表明，SMAD5可以調節血管重塑過程，促進細胞外基質形成，促進基質細胞分化成血管平滑肌細胞并抑制血管內皮細胞生長[24-26]。目前，尚缺乏SMAD5與ONFH之間關系的相關報道，在本研究中SMAD基因上調可能與ONFH發生后的修復有關。
ONFH的發病機制十分復雜，采用基因芯片技術對其差異表達基因進行篩選，可能有助于從基因水平揭示該病的發病機制。下一步我們將應用顯著性分析方法和頂級評分基因方法對數據進一步分析與挖掘，以期初步構建激素性ONFH的基因調控網絡。
