引用本文： 楊大威, 林和敏, 劉廣鵬. 成骨分化的人臍帶血間充質干細胞免疫原性研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(6): 752-757. doi: 10.7507/1002-1892.20140167 復制
作為再生醫學研究領域的重要內容之一，組織工程骨構建、移植與治療技術已日益成熟并進入臨床前期應用階段，有望成為骨缺損修復的新手段。臍帶血來源于中胚層，除含有造血干細胞外，也含有較為豐富的MSCs[1-2]。臍帶血具有來源豐富、采集簡便、易于凍存、不易傳播病毒性疾病等優點，因此臍帶血間充質干細胞（umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs）有望成為理想的組織工程骨種子細胞來源[3-4]。我們前期研究表明，人UCB-MSCs在長期培養過程中細胞表面標志、體外增殖與成骨分化潛能等干細胞特性均保持穩定[5]。以成骨誘導分化的UCB-MSCs復合脫礦骨基質構建的組織工程骨能夠修復裸大鼠顱骨標準缺損，為研究其作為組織工程骨種子細胞的可行性奠定了實驗基礎[6]。
但要真正廣泛應用UCB-MSCs修復骨缺損，滿足急性骨損傷臨床治療需要，面臨的另一重要課題就是異基因的UCB-MSCs能否成為組織工程骨的種子細胞來源。已知人臍血淋巴細胞相對不成熟，臍帶血造血干細胞可在人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型不符者之間輸注[7-9]。而UCB-MSCs免疫原性也較弱，UCB-MSCs在體外可抑制T淋巴細胞增殖，高表達HLA-Ⅰ類分子（即HLA-A、B、C），不表達HLA-Ⅱ類分子（即HLA-DR、DP、DQ），也不表達CD40、CD40L、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）等B、T淋巴細胞活化所需的共刺激分子[10-13]。但作為骨組織工程種子細胞，體內回植前的體外擴增和成骨誘導分化非常關鍵。UCB-MSCs在成骨誘導分化過程中將分泌合成較多細胞外基質，在基因水平、蛋白表達與細胞功能方面產生多種改變，其免疫原性是否也會因此發生變化，目前罕見相關研究報道。本研究通過系統觀察成骨誘導分化UCB-MSCs表面免疫分子的表達及其在體外抑制混合淋巴細胞增殖反應的能力，闡明成骨分化的UCB-MSCs免疫原性變化規律，為探討同種異體UCB-MSCs能否用于構建組織工程骨及骨缺損修復提供免疫學證據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
Ficoll淋巴細胞分離液、地塞米松、β-磷酸甘油酸鈉、磷酸抗壞血酸、茜素紅染色試劑盒、IFN-γ、IL-2、植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）、絲裂霉素C（Sigma公司，美國）；L-DMEM培養液、RPMI1640培養液（GIBCO公司，美國）；FBS（HyClone公司，美國）；胰蛋白酶、EDTA（上海思吉生物制品有限公司）；PE標記的鼠抗人HLA-Ⅰ抗體、FITC標記的鼠抗人HLA-Ⅱ抗體（Santa Cruz公司，美國）；氚標記胸腺嘧啶核苷（3H-thymidine，3H-TdR；中國科學院上海核技術開發公司）。
恒溫CO2培養箱（Forma公司，美國）；低溫高速離心機、β液閃計數儀（Beckman Coulter公司，德國）；流式細胞儀（FACScan公司，美國）；倒置相差顯微鏡、顯微照相系統（Olympus公司，日本）；細胞培養皿、6孔板、96孔板、離心管（1.5、15、50 mL）、Transwell通透性隔離腔（Falcon公司，美國）。
1.2 UCB-MSCs分離培養
5份臍靜脈血標本（50 mL/例）均來源于同濟大學附屬上海市第十人民醫院產科行剖腹產的健康產婦，經醫院倫理委員會批準且產婦及家屬知情同意。臍靜脈血標本加入PBS液混勻，緩慢滴入至等量1.077 g/mL Ficoll淋巴細胞分離液面上，以600 × g離心20 min。抽取白膜層細胞，以等量PBS液洗滌離心（300 × g離心5 min），基礎培養液（含20%FBS、100 U/ mL青鏈霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺的L-DMEM）重懸，接種至100 mm培養皿，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養。第5天首次全量換液，之后每3天換液1次，2～3周后細胞達60%～80%融合時，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，按1∶3比例傳代。倒置相差顯微鏡下觀察各代細胞形態變化。取第3代細胞進行以下實驗。
1.3 檢測指標
1.3.1 UCB-MSCs的成骨誘導分化與檢測
取UCB-MSCs以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后，按1 ×105個/孔密度接種至6孔板。接種次日起改用成骨條件培養液（含1 × 10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/ L β-磷酸甘油酸鈉、50 μg/L磷酸抗壞血酸的基礎培養液）行成骨誘導培養[5-6]。誘導2周后參照文獻[14]方法行茜素紅染色，觀察細胞外基質鈣化和鈣結節形成情況，并采用吸光度（A）值半定量檢測細胞外基質Ca2+含量[14]。以未誘導細胞作為對照。
1.3.2 成骨分化UCB-MSCs免疫相關膜蛋白分子的表達
分別取成骨誘導2周和未誘導的UCB-MSCs，加入IFN-γ（20 ng/mL），作用48 h后，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，調整細胞濃度為2 ×106 個 / mL，加入流式細胞緩沖液（含0.5%牛血清白蛋白的PBS）重懸。每個1.5 mL離心管內加入100 μL細胞懸液，分別加入PE標記的鼠抗人HLA-Ⅰ抗體、FITC標記的鼠抗人HLA-Ⅱ抗體和IgG同型對照2 μL，混勻，冰上避光孵育30 min。PBS洗滌2次，每管加入1 mL 4%中性甲醛溶液固定，40 μm濾網過濾至流式檢測管內形成單細胞懸液，用流式細胞儀檢測IFN-γ刺激前后未誘導的UCB-MSCs HLA-Ⅰ類分子、HLA-Ⅱ類分子和CD40、CD80細胞表面抗原表達情況，比較成骨誘導2 周和未誘導的UCB-MSCs HLA-Ⅰ類分子、HLA-Ⅱ類分子的表達情況。
1.3.3 3H-TdR
摻入法檢測成骨分化UCB-MSCs對體外T淋巴細胞增殖的刺激反應經同濟大學附屬上海市第十人民醫院倫理委員會批準并獲得志愿者知情同意，獲取5份健康成年人外周血（10 mL/例），經密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，加入含10%FBS的RPMI1640細胞培養液，調整細胞濃度為1 ×108 個 / mL。將細胞懸液加入尼龍棉柱內，37℃孵育1 h。用預溫至37℃的RPMI1640細胞培養液沖出非黏附細胞，即為T淋巴細胞。細胞計數后以1 ×105 個/孔接種于96孔板備用。
實驗分為5組：未誘導UCB-MSCs + T淋巴細胞組（A組）、成骨誘導2周UCB-MSCs + T淋巴細胞組（B組）、經IFN-γ刺激的未誘導UCB-MSCs + T淋巴細胞組（C組）、經IFN-γ刺激的成骨誘導2周UCB-MSCs + T淋巴細胞組（D組）、單純T淋巴細胞對照組（E組）。取經成骨誘導2周和未誘導的UCB-MSCs，以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化細胞計數，分別以1 ×102、1 ×103、1 ×104、1 ×105個/孔（UCB-MSCs∶淋巴細胞分別為1∶1、1∶10、1∶100和1∶1 000）密度加入96孔板，待其貼壁后，以絲裂霉素C（5 μg/ 孔）預處理。其中C、D組在建立T淋巴細胞共培養反應體系前2 d，于UCB-MSCs培養液中加入IFN-γ（20 ng/ mL），刺激HLA-Ⅱ類分子表達。各組每孔加入1 ×105個T淋巴細胞共培養6 d。然后每孔加入3H-TdR，18 h后收集樣品，β液閃計數儀檢測T淋巴細胞增殖情況。A～D組均設立上述4個細胞數量級，各取3個復孔，檢測每分鐘計數（count per minute，CPM）值。
1.3.4 成骨分化UCB-MSCs對PHA刺激T淋巴細胞增殖反應的影響
實驗分為6組：未誘導UCB-MSCs + T淋巴細胞+ PHA組（A組）、未誘導UCB-MSCs + T淋巴細胞+ PHA + IL-2組（B組）、成骨誘導2周UCB-MSCs + T淋巴細胞+ PHA組（C組）、成骨誘導2周UCB-MSCs + T淋巴細胞+ PHA + IL-2組（D組）、T淋巴細胞+ PHA組（E組）、T淋巴細胞 + PHA + IL-2組（F組）。A～D組對應取未誘導和經成骨誘導2周的UCB-MSCs，分別以1 ×102、1 ×103、1 ×104、1 ×105個/孔密度接種至96孔板，待細胞貼壁后，以絲裂霉素C（5 μg/孔）預處理；B、D組在接種UCB-MSCs時，加入IL-2（50 ng/mL）。A～F組每孔加入1 ×105個T淋巴細胞及PHA（2 μg/ mL），非特異性刺激T淋巴細胞增殖；共培養6 d后，加入3H-TdR，18 h后收集樣品，β液閃計數儀檢測CPM值。
1.3.5 Transwell通透性隔離腔培養體系對T淋巴細胞增殖反應的作用
取T淋巴細胞、未誘導和經成骨誘導2周的UCB-MSCs，分別建立非接觸共培養體系；其中UCB-MSCs分別以1 ×102、1 ×103、1 ×104和1 ×105 個/孔密度接種入Transwell小室，T淋巴細胞以1 ×105個/孔密度接種于培養體系下層。置入6孔板內共培養6 d后，取出Transwell通透性隔離腔；實驗分為5組：直接接觸培養的未誘導UCB-MSCs + T淋巴細胞組（A組）、直接接觸培養的經成骨誘導2周UCB-MSCs + T淋巴細胞組（B組）、非接觸共培養的未誘導UCB-MSCs + T淋巴細胞組（C組）、非接觸共培養的經成骨誘導2周UCB-MSCs + T淋巴細胞組（D組）、直接接觸培養的T淋巴細胞組（E組）。各組加入3H-TdR，18 h后收集樣品，β液閃計數儀檢測CPM值。
1.4 統計學方法
采用SAS6.12統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t檢驗或方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 UCB-MSCs形態學觀察及成骨分化能力檢測
原代UCB-MSCs呈克隆樣集落生長，細胞呈橢圓形或短梭形；傳代后細胞分布均勻，多數為成纖維樣細胞形態，呈漩渦狀生長。見圖 1。
圖1
UCB-MSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡 × 40） ? 原代細胞 ? 第3代細胞 ? ?第3代細胞成骨誘導2周后茜素紅染色為陽性，形成大小不等的紅色鈣鹽沉積區域，對照組無鈣鹽沉積現象，見圖 2。對照組Ca2+含量為0.767 ± 0.081，顯著低于成骨誘導組的9.783 ± 0.784，差異有統計學意義（t=4.362，P=0.002）。
2.2 成骨分化UCB-MSCs免疫相關膜蛋白分子的表達
流式細胞儀檢測示，IFN-γ刺激前，未誘導的第3 代UCB-MSCs高表達HLA-Ⅰ類分子，不表達HLA-Ⅱ類分子和CD40、CD80細胞表面抗原；經IFN-γ刺激后，仍高表達HLA-Ⅰ類分子，HLA-Ⅱ類分子也呈陽性表達，但CD40、CD80表達仍為陰性。見圖 3。
成骨誘導組和未誘導組細胞HLA-Ⅰ類分子均呈陽性表達；而HLA-Ⅱ類分子在未誘導組呈陰性（1.2% ± 0.4%），成骨誘導組陽性表達率有所增高（6.8% ± 3.4%），差異有統計學意義（t=5.491，P=0.001），見圖 4。
2.3 成骨分化UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖的刺激反應
A、B、C、D組各濃度UCB-MSCs刺激T淋巴細胞增殖效果均顯著低于E組（P＜ 0.05）。A、C組各濃度UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖均有明顯抑制效果，且抑制效果呈細胞數量依賴性，密度為1 ×104 個/孔及1 ×105 個/孔時，抑制增殖效果顯著高于1 ×102 個 / 孔及1 ×103 個/孔時，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。而經成骨誘導分化的B、D組UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖的抑制作用較A、C組明顯減弱（P＜ 0.05），不僅不隨細胞數量變化而改變，并且D組在IFN-γ作用后較B組反而有刺激T淋巴細胞增殖的效果（P＜ 0.05）。見圖 5。
2.4 成骨分化UCB-MSCs對PHA刺激T淋巴細胞增殖反應的影響
E組PHA顯著刺激T淋巴細胞增殖，加入IL-2后淋巴細胞增殖反應進一步增強（F組），兩組間各濃度級別比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05），且均顯著高于A～D組各濃度級別UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖作用的刺激效果（P＜ 0.05）。A組密度為1 ×104 個 / 孔和1 ×105個/孔時未誘導的UCB-MSCs可抑制PHA刺激T淋巴細胞增殖，抑制效果呈細胞數量依賴性，與密度為1 ×102個/孔和1 ×103個/孔時比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）。但B組加入IL-2后，與A組相比抑制作用被逆轉，各密度級別UCB-MSCs對PHA刺激的T淋巴細胞增殖的抑制效果均顯著低于A組（P＜ 0.05）。除C組1 ×103個/孔密度外，C、D組各密度級別UCB-MSCs 對T 淋巴細胞增殖的抑制效果均顯著低于A、B 組（P＜ 0.05），且C、D組間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05），表明經成骨誘導分化的UCB-MSCs不具有抑制PHA刺激T淋巴細胞增殖的作用，且與IL-2的作用無關。見圖 6。
2.5 Transwell通透性隔離腔共培養體系對T淋巴細胞增殖反應的作用
與A組直接接觸培養結果相似，C組各密度級別未誘導UCB-MSCs均可顯著抑制T淋巴細胞增殖反應，且抑制效果呈細胞數量依賴性，1 ×104個/孔和1 ×105個/孔時抑制增殖效果顯著高于密度為1 ×102個/孔和1 ×103個/孔時，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。在細胞密度≥1 ×103個/孔時，A、C組UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖的抑制效果均顯著高于B、D組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。A～D組各密度級別UCB-MSCs刺激T淋巴細胞增殖的效果均顯著低于E組（P＜ 0.05），而A、C組間和B、D組間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖 7。
3 討論
種子細胞是組織工程骨的重要研究內容之一，但種子細胞來源受限卻影響了組織工程骨的實際應用。UCB-MSCs來源豐富，取材簡便，具有作為組織工程種子細胞的潛在優勢。我們前期研究結果表明人UCB-MSCs具有多向分化潛能，在長期體外培養過程中仍能保持成骨分化能力，并且應用成骨分化的UCB-MSCs作為種子細胞成功修復了裸大鼠顱骨標準缺損[5-6]。UCB-MSCs具有較低的免疫原性，本次實驗重點針對成骨分化的UCB-MSCs免疫原性進行觀察與檢測。我們選擇成骨誘導2周的UCB-MSCs細胞進行檢測，因為此時細胞已分化為成骨細胞（茜素紅染色為陽性），但細胞外基質的鈣化程度對細胞消化、分離等實驗操作無顯著影響[15]。
流式細胞儀檢測結果發現，正常狀態下UCB-MSCs表達HLA-Ⅰ類分子，不表達HLA-Ⅱ類分子；在應用IFN-γ刺激后，HLA-Ⅱ類分子表達明顯增高。表明UCB-MSCs具有弱免疫原性，與既往實驗報道結果一致[10-13]。成骨誘導分化后的UCB-MSCs同樣表達HLA-Ⅰ類分子，并且HLA-Ⅱ類分子的陽性表達率比未誘導細胞升高，提示其免疫原性較正常UCB-MSCs發生了改變，與IFN-γ的刺激效果相似。
我們以混合T淋巴細胞反應模擬體內免疫微環境條件，觀察成骨誘導分化的UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖反應的免疫調節作用。T淋巴細胞增殖實驗結果表明，正常狀態下UCB-MSCs不能刺激異體T淋巴細胞增殖；在經IFN-γ刺激后，HLA-Ⅱ類分子表達增高，但仍未刺激T淋巴細胞增殖升高。上述結果與既往實驗報道[10-13]一致，表明未經成骨誘導分化的UCB-MSCs具有抑制混合T淋巴細胞反應的免疫調節功能，且此種負向免疫調節功能呈細胞數量依賴性，而與HLA-Ⅱ類分子的表達無關。但是經成骨誘導分化后，抑制T淋巴細胞增殖的效果明顯低于未分化細胞，且不存在細胞數量依賴性。應用IFN-γ刺激后，成骨分化UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖的抑制作用基本消失，表明其免疫原性的改變與HLA-Ⅱ類分子表達升高有關。
為了進一步觀察UCB-MSCs對非特異性淋巴細胞增殖反應的作用，我們先以PHA刺激T淋巴細胞增殖。結果發現1 ×104個/孔及以上數量級的未分化UCB-MSCs可抑制PHA刺激的T淋巴細胞增殖，但這種抑制效果能夠被IL-2所逆轉。而不同數量級的成骨分化UCB-MSCs對PHA刺激的T淋巴細胞增殖反應無抑制效果，不論是否添加IL-2均無逆轉。
Transwell通透性隔離腔膜片的孔徑為0.3 μm，因此采用Transwell培養法既可有效隔離UCB-MSCs與T淋巴細胞的相互接觸，又能夠保證大分子物質在隔離腔內外自由彌散，以判斷UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖反應的影響是否為細胞間的直接接觸所致。研究發現，隔離腔培養與直接接觸培養的實驗結果一致，即成骨分化的UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖反應的抑制效果顯著低于未分化的UCB-MSCs。表明UCB-MSCs對混合T淋巴細胞增殖反應的抑制作用不依賴于細胞間的直接接觸，可能與UCB-MSCs分泌的免疫原性相關細胞因子有關[16-18]。
綜上述，本實驗結果顯示，經成骨誘導分化的UCB-MSCs不再具有未分化狀態細胞的低免疫原性和調節免疫反應的能力，不能抑制混合T淋巴細胞的體外增殖反應，也不適合作為異源性骨組織工程或細胞治療的種子細胞來源。下一步我們將重點觀察此種免疫調控機制改變與經體外成骨誘導分化后UCB-MSCs分泌的細胞因子和免疫原性膜蛋白的相關性。
作為再生醫學研究領域的重要內容之一，組織工程骨構建、移植與治療技術已日益成熟并進入臨床前期應用階段，有望成為骨缺損修復的新手段。臍帶血來源于中胚層，除含有造血干細胞外，也含有較為豐富的MSCs[1-2]。臍帶血具有來源豐富、采集簡便、易于凍存、不易傳播病毒性疾病等優點，因此臍帶血間充質干細胞（umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs）有望成為理想的組織工程骨種子細胞來源[3-4]。我們前期研究表明，人UCB-MSCs在長期培養過程中細胞表面標志、體外增殖與成骨分化潛能等干細胞特性均保持穩定[5]。以成骨誘導分化的UCB-MSCs復合脫礦骨基質構建的組織工程骨能夠修復裸大鼠顱骨標準缺損，為研究其作為組織工程骨種子細胞的可行性奠定了實驗基礎[6]。
但要真正廣泛應用UCB-MSCs修復骨缺損，滿足急性骨損傷臨床治療需要，面臨的另一重要課題就是異基因的UCB-MSCs能否成為組織工程骨的種子細胞來源。已知人臍血淋巴細胞相對不成熟，臍帶血造血干細胞可在人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型不符者之間輸注[7-9]。而UCB-MSCs免疫原性也較弱，UCB-MSCs在體外可抑制T淋巴細胞增殖，高表達HLA-Ⅰ類分子（即HLA-A、B、C），不表達HLA-Ⅱ類分子（即HLA-DR、DP、DQ），也不表達CD40、CD40L、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）等B、T淋巴細胞活化所需的共刺激分子[10-13]。但作為骨組織工程種子細胞，體內回植前的體外擴增和成骨誘導分化非常關鍵。UCB-MSCs在成骨誘導分化過程中將分泌合成較多細胞外基質，在基因水平、蛋白表達與細胞功能方面產生多種改變，其免疫原性是否也會因此發生變化，目前罕見相關研究報道。本研究通過系統觀察成骨誘導分化UCB-MSCs表面免疫分子的表達及其在體外抑制混合淋巴細胞增殖反應的能力，闡明成骨分化的UCB-MSCs免疫原性變化規律，為探討同種異體UCB-MSCs能否用于構建組織工程骨及骨缺損修復提供免疫學證據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
Ficoll淋巴細胞分離液、地塞米松、β-磷酸甘油酸鈉、磷酸抗壞血酸、茜素紅染色試劑盒、IFN-γ、IL-2、植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）、絲裂霉素C（Sigma公司，美國）；L-DMEM培養液、RPMI1640培養液（GIBCO公司，美國）；FBS（HyClone公司，美國）；胰蛋白酶、EDTA（上海思吉生物制品有限公司）；PE標記的鼠抗人HLA-Ⅰ抗體、FITC標記的鼠抗人HLA-Ⅱ抗體（Santa Cruz公司，美國）；氚標記胸腺嘧啶核苷（3H-thymidine，3H-TdR；中國科學院上海核技術開發公司）。
恒溫CO2培養箱（Forma公司，美國）；低溫高速離心機、β液閃計數儀（Beckman Coulter公司，德國）；流式細胞儀（FACScan公司，美國）；倒置相差顯微鏡、顯微照相系統（Olympus公司，日本）；細胞培養皿、6孔板、96孔板、離心管（1.5、15、50 mL）、Transwell通透性隔離腔（Falcon公司，美國）。
1.2 UCB-MSCs分離培養
5份臍靜脈血標本（50 mL/例）均來源于同濟大學附屬上海市第十人民醫院產科行剖腹產的健康產婦，經醫院倫理委員會批準且產婦及家屬知情同意。臍靜脈血標本加入PBS液混勻，緩慢滴入至等量1.077 g/mL Ficoll淋巴細胞分離液面上，以600 × g離心20 min。抽取白膜層細胞，以等量PBS液洗滌離心（300 × g離心5 min），基礎培養液（含20%FBS、100 U/ mL青鏈霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺的L-DMEM）重懸，接種至100 mm培養皿，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養。第5天首次全量換液，之后每3天換液1次，2～3周后細胞達60%～80%融合時，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，按1∶3比例傳代。倒置相差顯微鏡下觀察各代細胞形態變化。取第3代細胞進行以下實驗。
1.3 檢測指標
1.3.1 UCB-MSCs的成骨誘導分化與檢測
取UCB-MSCs以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后，按1 ×105個/孔密度接種至6孔板。接種次日起改用成骨條件培養液（含1 × 10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/ L β-磷酸甘油酸鈉、50 μg/L磷酸抗壞血酸的基礎培養液）行成骨誘導培養[5-6]。誘導2周后參照文獻[14]方法行茜素紅染色，觀察細胞外基質鈣化和鈣結節形成情況，并采用吸光度（A）值半定量檢測細胞外基質Ca2+含量[14]。以未誘導細胞作為對照。
1.3.2 成骨分化UCB-MSCs免疫相關膜蛋白分子的表達
分別取成骨誘導2周和未誘導的UCB-MSCs，加入IFN-γ（20 ng/mL），作用48 h后，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，調整細胞濃度為2 ×106 個 / mL，加入流式細胞緩沖液（含0.5%牛血清白蛋白的PBS）重懸。每個1.5 mL離心管內加入100 μL細胞懸液，分別加入PE標記的鼠抗人HLA-Ⅰ抗體、FITC標記的鼠抗人HLA-Ⅱ抗體和IgG同型對照2 μL，混勻，冰上避光孵育30 min。PBS洗滌2次，每管加入1 mL 4%中性甲醛溶液固定，40 μm濾網過濾至流式檢測管內形成單細胞懸液，用流式細胞儀檢測IFN-γ刺激前后未誘導的UCB-MSCs HLA-Ⅰ類分子、HLA-Ⅱ類分子和CD40、CD80細胞表面抗原表達情況，比較成骨誘導2 周和未誘導的UCB-MSCs HLA-Ⅰ類分子、HLA-Ⅱ類分子的表達情況。
1.3.3 3H-TdR
摻入法檢測成骨分化UCB-MSCs對體外T淋巴細胞增殖的刺激反應經同濟大學附屬上海市第十人民醫院倫理委員會批準并獲得志愿者知情同意，獲取5份健康成年人外周血（10 mL/例），經密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，加入含10%FBS的RPMI1640細胞培養液，調整細胞濃度為1 ×108 個 / mL。將細胞懸液加入尼龍棉柱內，37℃孵育1 h。用預溫至37℃的RPMI1640細胞培養液沖出非黏附細胞，即為T淋巴細胞。細胞計數后以1 ×105 個/孔接種于96孔板備用。
實驗分為5組：未誘導UCB-MSCs + T淋巴細胞組（A組）、成骨誘導2周UCB-MSCs + T淋巴細胞組（B組）、經IFN-γ刺激的未誘導UCB-MSCs + T淋巴細胞組（C組）、經IFN-γ刺激的成骨誘導2周UCB-MSCs + T淋巴細胞組（D組）、單純T淋巴細胞對照組（E組）。取經成骨誘導2周和未誘導的UCB-MSCs，以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化細胞計數，分別以1 ×102、1 ×103、1 ×104、1 ×105個/孔（UCB-MSCs∶淋巴細胞分別為1∶1、1∶10、1∶100和1∶1 000）密度加入96孔板，待其貼壁后，以絲裂霉素C（5 μg/ 孔）預處理。其中C、D組在建立T淋巴細胞共培養反應體系前2 d，于UCB-MSCs培養液中加入IFN-γ（20 ng/ mL），刺激HLA-Ⅱ類分子表達。各組每孔加入1 ×105個T淋巴細胞共培養6 d。然后每孔加入3H-TdR，18 h后收集樣品，β液閃計數儀檢測T淋巴細胞增殖情況。A～D組均設立上述4個細胞數量級，各取3個復孔，檢測每分鐘計數（count per minute，CPM）值。
1.3.4 成骨分化UCB-MSCs對PHA刺激T淋巴細胞增殖反應的影響
實驗分為6組：未誘導UCB-MSCs + T淋巴細胞+ PHA組（A組）、未誘導UCB-MSCs + T淋巴細胞+ PHA + IL-2組（B組）、成骨誘導2周UCB-MSCs + T淋巴細胞+ PHA組（C組）、成骨誘導2周UCB-MSCs + T淋巴細胞+ PHA + IL-2組（D組）、T淋巴細胞+ PHA組（E組）、T淋巴細胞 + PHA + IL-2組（F組）。A～D組對應取未誘導和經成骨誘導2周的UCB-MSCs，分別以1 ×102、1 ×103、1 ×104、1 ×105個/孔密度接種至96孔板，待細胞貼壁后，以絲裂霉素C（5 μg/孔）預處理；B、D組在接種UCB-MSCs時，加入IL-2（50 ng/mL）。A～F組每孔加入1 ×105個T淋巴細胞及PHA（2 μg/ mL），非特異性刺激T淋巴細胞增殖；共培養6 d后，加入3H-TdR，18 h后收集樣品，β液閃計數儀檢測CPM值。
1.3.5 Transwell通透性隔離腔培養體系對T淋巴細胞增殖反應的作用
取T淋巴細胞、未誘導和經成骨誘導2周的UCB-MSCs，分別建立非接觸共培養體系；其中UCB-MSCs分別以1 ×102、1 ×103、1 ×104和1 ×105 個/孔密度接種入Transwell小室，T淋巴細胞以1 ×105個/孔密度接種于培養體系下層。置入6孔板內共培養6 d后，取出Transwell通透性隔離腔；實驗分為5組：直接接觸培養的未誘導UCB-MSCs + T淋巴細胞組（A組）、直接接觸培養的經成骨誘導2周UCB-MSCs + T淋巴細胞組（B組）、非接觸共培養的未誘導UCB-MSCs + T淋巴細胞組（C組）、非接觸共培養的經成骨誘導2周UCB-MSCs + T淋巴細胞組（D組）、直接接觸培養的T淋巴細胞組（E組）。各組加入3H-TdR，18 h后收集樣品，β液閃計數儀檢測CPM值。
1.4 統計學方法
采用SAS6.12統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t檢驗或方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 UCB-MSCs形態學觀察及成骨分化能力檢測
原代UCB-MSCs呈克隆樣集落生長，細胞呈橢圓形或短梭形；傳代后細胞分布均勻，多數為成纖維樣細胞形態，呈漩渦狀生長。見圖 1。
圖1
UCB-MSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡 × 40） ? 原代細胞 ? 第3代細胞 ? ?第3代細胞成骨誘導2周后茜素紅染色為陽性，形成大小不等的紅色鈣鹽沉積區域，對照組無鈣鹽沉積現象，見圖 2。對照組Ca2+含量為0.767 ± 0.081，顯著低于成骨誘導組的9.783 ± 0.784，差異有統計學意義（t=4.362，P=0.002）。
2.2 成骨分化UCB-MSCs免疫相關膜蛋白分子的表達
流式細胞儀檢測示，IFN-γ刺激前，未誘導的第3 代UCB-MSCs高表達HLA-Ⅰ類分子，不表達HLA-Ⅱ類分子和CD40、CD80細胞表面抗原；經IFN-γ刺激后，仍高表達HLA-Ⅰ類分子，HLA-Ⅱ類分子也呈陽性表達，但CD40、CD80表達仍為陰性。見圖 3。
成骨誘導組和未誘導組細胞HLA-Ⅰ類分子均呈陽性表達；而HLA-Ⅱ類分子在未誘導組呈陰性（1.2% ± 0.4%），成骨誘導組陽性表達率有所增高（6.8% ± 3.4%），差異有統計學意義（t=5.491，P=0.001），見圖 4。
2.3 成骨分化UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖的刺激反應
A、B、C、D組各濃度UCB-MSCs刺激T淋巴細胞增殖效果均顯著低于E組（P＜ 0.05）。A、C組各濃度UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖均有明顯抑制效果，且抑制效果呈細胞數量依賴性，密度為1 ×104 個/孔及1 ×105 個/孔時，抑制增殖效果顯著高于1 ×102 個 / 孔及1 ×103 個/孔時，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。而經成骨誘導分化的B、D組UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖的抑制作用較A、C組明顯減弱（P＜ 0.05），不僅不隨細胞數量變化而改變，并且D組在IFN-γ作用后較B組反而有刺激T淋巴細胞增殖的效果（P＜ 0.05）。見圖 5。
2.4 成骨分化UCB-MSCs對PHA刺激T淋巴細胞增殖反應的影響
E組PHA顯著刺激T淋巴細胞增殖，加入IL-2后淋巴細胞增殖反應進一步增強（F組），兩組間各濃度級別比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05），且均顯著高于A～D組各濃度級別UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖作用的刺激效果（P＜ 0.05）。A組密度為1 ×104 個 / 孔和1 ×105個/孔時未誘導的UCB-MSCs可抑制PHA刺激T淋巴細胞增殖，抑制效果呈細胞數量依賴性，與密度為1 ×102個/孔和1 ×103個/孔時比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）。但B組加入IL-2后，與A組相比抑制作用被逆轉，各密度級別UCB-MSCs對PHA刺激的T淋巴細胞增殖的抑制效果均顯著低于A組（P＜ 0.05）。除C組1 ×103個/孔密度外，C、D組各密度級別UCB-MSCs 對T 淋巴細胞增殖的抑制效果均顯著低于A、B 組（P＜ 0.05），且C、D組間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05），表明經成骨誘導分化的UCB-MSCs不具有抑制PHA刺激T淋巴細胞增殖的作用，且與IL-2的作用無關。見圖 6。
2.5 Transwell通透性隔離腔共培養體系對T淋巴細胞增殖反應的作用
與A組直接接觸培養結果相似，C組各密度級別未誘導UCB-MSCs均可顯著抑制T淋巴細胞增殖反應，且抑制效果呈細胞數量依賴性，1 ×104個/孔和1 ×105個/孔時抑制增殖效果顯著高于密度為1 ×102個/孔和1 ×103個/孔時，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。在細胞密度≥1 ×103個/孔時，A、C組UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖的抑制效果均顯著高于B、D組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。A～D組各密度級別UCB-MSCs刺激T淋巴細胞增殖的效果均顯著低于E組（P＜ 0.05），而A、C組間和B、D組間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖 7。
3 討論
種子細胞是組織工程骨的重要研究內容之一，但種子細胞來源受限卻影響了組織工程骨的實際應用。UCB-MSCs來源豐富，取材簡便，具有作為組織工程種子細胞的潛在優勢。我們前期研究結果表明人UCB-MSCs具有多向分化潛能，在長期體外培養過程中仍能保持成骨分化能力，并且應用成骨分化的UCB-MSCs作為種子細胞成功修復了裸大鼠顱骨標準缺損[5-6]。UCB-MSCs具有較低的免疫原性，本次實驗重點針對成骨分化的UCB-MSCs免疫原性進行觀察與檢測。我們選擇成骨誘導2周的UCB-MSCs細胞進行檢測，因為此時細胞已分化為成骨細胞（茜素紅染色為陽性），但細胞外基質的鈣化程度對細胞消化、分離等實驗操作無顯著影響[15]。
流式細胞儀檢測結果發現，正常狀態下UCB-MSCs表達HLA-Ⅰ類分子，不表達HLA-Ⅱ類分子；在應用IFN-γ刺激后，HLA-Ⅱ類分子表達明顯增高。表明UCB-MSCs具有弱免疫原性，與既往實驗報道結果一致[10-13]。成骨誘導分化后的UCB-MSCs同樣表達HLA-Ⅰ類分子，并且HLA-Ⅱ類分子的陽性表達率比未誘導細胞升高，提示其免疫原性較正常UCB-MSCs發生了改變，與IFN-γ的刺激效果相似。
我們以混合T淋巴細胞反應模擬體內免疫微環境條件，觀察成骨誘導分化的UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖反應的免疫調節作用。T淋巴細胞增殖實驗結果表明，正常狀態下UCB-MSCs不能刺激異體T淋巴細胞增殖；在經IFN-γ刺激后，HLA-Ⅱ類分子表達增高，但仍未刺激T淋巴細胞增殖升高。上述結果與既往實驗報道[10-13]一致，表明未經成骨誘導分化的UCB-MSCs具有抑制混合T淋巴細胞反應的免疫調節功能，且此種負向免疫調節功能呈細胞數量依賴性，而與HLA-Ⅱ類分子的表達無關。但是經成骨誘導分化后，抑制T淋巴細胞增殖的效果明顯低于未分化細胞，且不存在細胞數量依賴性。應用IFN-γ刺激后，成骨分化UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖的抑制作用基本消失，表明其免疫原性的改變與HLA-Ⅱ類分子表達升高有關。
為了進一步觀察UCB-MSCs對非特異性淋巴細胞增殖反應的作用，我們先以PHA刺激T淋巴細胞增殖。結果發現1 ×104個/孔及以上數量級的未分化UCB-MSCs可抑制PHA刺激的T淋巴細胞增殖，但這種抑制效果能夠被IL-2所逆轉。而不同數量級的成骨分化UCB-MSCs對PHA刺激的T淋巴細胞增殖反應無抑制效果，不論是否添加IL-2均無逆轉。
Transwell通透性隔離腔膜片的孔徑為0.3 μm，因此采用Transwell培養法既可有效隔離UCB-MSCs與T淋巴細胞的相互接觸，又能夠保證大分子物質在隔離腔內外自由彌散，以判斷UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖反應的影響是否為細胞間的直接接觸所致。研究發現，隔離腔培養與直接接觸培養的實驗結果一致，即成骨分化的UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖反應的抑制效果顯著低于未分化的UCB-MSCs。表明UCB-MSCs對混合T淋巴細胞增殖反應的抑制作用不依賴于細胞間的直接接觸，可能與UCB-MSCs分泌的免疫原性相關細胞因子有關[16-18]。
綜上述，本實驗結果顯示，經成骨誘導分化的UCB-MSCs不再具有未分化狀態細胞的低免疫原性和調節免疫反應的能力，不能抑制混合T淋巴細胞的體外增殖反應，也不適合作為異源性骨組織工程或細胞治療的種子細胞來源。下一步我們將重點觀察此種免疫調控機制改變與經體外成骨誘導分化后UCB-MSCs分泌的細胞因子和免疫原性膜蛋白的相關性。
