引用本文： 侯開宇, 王宇飛, 陸曉濤, 楊克敏, 孔維云, 李勇剛. NF-κB受體活化因子配體在假體無菌性松動患者外周血中的表達. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(7): 853-856. doi: 10.7507/1002-1892.20140188 復制
隨著人工關節材料和相關技術的發展，人工全髖關節置換術（total hip arthroplasty，THA）已成為治療髖關節終末期疾病的有效方法之一。假體周圍骨溶解是其最主要并發癥[1-2]。據報道，約20%患者因假體周圍骨溶解，最終導致假體無菌性松動[3-4]，嚴重影響關節置換術遠期療效，至今尚無有效治療措施及預測因子。目前認為假體無菌性松動的主要病理機制是磨損碎屑導致的假體周圍骨溶解[5-7]。研究表明[8-9]，NF-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）在破骨細胞分化過程中具有重要作用。RANKL與其受體--NF-κB受體活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）結合，對驅動破骨細胞從造血前體細胞的發育并活化為成熟破骨細胞提供了關鍵信號。為此，本研究通過觀察THA術后假體無菌性松動患者外周血中RANKL的表達變化，分析RANKL與假體無菌性松動的關系，旨在為假體無菌性松動的診斷和治療提供可能的預測因子和治療靶點。
1 材料與方法
1.1 實驗對象
納入標準：① 試驗組為因THA術后疼痛行髖關節翻修術患者，符合國際證件與評價系統（IDES）于1998年提出的THA術后假體松動的影像學診斷標準[10]；對照組為股骨頸骨折患者。② 年齡18～80歲。排除標準：翻修術中取出組織冰凍病理檢查和細菌培養顯示感染者。
2008年1月－2013年1月，共121例患者符合選擇標準納入研究。其中試驗組58例，對照組63例。 試驗組：男30例，女28例；年齡52～80歲，中位年齡65歲。左髖36例，右髖22例。關節置換原因：股骨頸骨折（≥70歲）27髖，均為頭下型；股骨頭缺血性壞死23髖；風濕性關節炎8髖。置換術后6～187個月出現假體無菌性松動，平均36.8個月。
對照組：男32例，女31例；年齡50～79歲，中位年齡63歲。左髖39例，右髖24例。骨折類型：經頸型27例，頭下型20例，基底型16例。傷后至入院時間1～72 h，平均3 h。
兩組患者年齡及性別比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。取兩組患者清晨空腹抗凝外周血進行檢測。
1.2 主要試劑及儀器
逆轉錄試劑盒（Takara公司，日本）；熒光定量試劑盒（Fermentas公司，美國）；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore公司，美國）；兔抗人RANKL一抗、兔抗人β-actin一抗（ProteinTech公司，美國）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（Invitrogen公司，美國）；ECL顯色試劑盒（Bio-Rad公司，美國）； ELISA試劑盒[博研（上海）生物科技有限公司]。Quantity One 4.6軟件（Bio-Rad公司，美國）；Primer 5.0引物設計軟件（Premier Biosoft International公司，美國）。
1.3 檢測指標
1.3.1 熒光定量PCR檢測
取兩組樣本各10 mL，加入2倍體積紅細胞裂解液，靜置10 min后以3 000 × g離心10 min，棄上清；重復加入紅細胞裂解液處理1次，沉淀即為白細胞。收集白細胞，棄上清，加入Trizol裂解細胞；提取樣品總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明合成cDNA；通過GenBank數據庫搜索人RANKL及人β-actin基因完整mRNA序列，Primer 5.0引物設計軟件設計引物，由美國Invitrogen公司合成；引物序列及產物長度見表 1。根據熒光定量試劑盒說明，采用2-ΔΔCt法檢測RANKL基因相對表達量。
表1
各基因引物序列及產物長度
Table1.
Primer sequences and product size
1.3.2 Western
blot檢測同上法收集白細胞，加入細胞裂解液，以12 000 × g離心5 min，上清即為白細胞的蛋白樣品。BCA法檢測蛋白濃度，取40 μg樣品PAGE凝膠電泳后轉至PVDF膜，將兔抗人RANKL一抗、兔抗人β-actin一抗以1∶500～1∶1 000稀釋，4℃孵育過夜；TBST洗液洗膜3次；將辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗以1∶5 000稀釋，室溫孵育1 h；漂洗后ECL Plus顯色。使用Quantity One 4.6軟件對條帶進行半定量分析，以與β-actin的比值作為RANKL蛋白相對表達量。
1.3.3 ELISA
檢測取兩組樣本各10 mL，參照ELISA試劑盒說明檢測RANKL濃度。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
熒光定量PCR及Western blot檢測示，試驗組RANKL基因、蛋白相對表達量分別為18.30 ± 1.09、0.856 ± 0.254，顯著高于對照組的1.00 ± 0.05、0.404 ± 0.102，比較差異均有統計學意義（t=125.390，P=0.000；t=13.032，P=0.000）。見圖 1。ELISA 檢測示，試驗組RANKL濃度為（3.553 5 ± 0.129 7）ng/mL，顯著高于對照組的（1.912 3 ± 0.126 2）ng/mL，比較差異有統計學意義（t=18.124，P=0.000）。
圖1
Western blot檢測兩組RANKL蛋白表達 1：對照組 2：試驗 組
Figure1.
Western blot detection for RANKL protein expression in 2 groups 1: Control group 2: Trial group
3 討論
假體無菌性松動是臨床THA術后翻修的主要原因，約占翻修患者的70% [11]。假體周圍骨溶解是導致無菌性松動的主要原因，而假體主要支撐表面之間因磨損產生的碎屑引起的局部炎性反應，則是造成骨溶解的主要原因之一。這些直徑＜ 1 μm的磨損顆粒能刺激大量炎性細胞分泌多種炎性介質，趨化外周血中的單核巨噬細胞向假體周圍聚集，刺激T細胞分泌巨噬細胞集落刺激因子，并促進成骨細胞及其他細胞釋放RANKL [12-14]。本研究也發現關節置換術后假體無菌性松動患者外周血中RANKL濃度及基因、蛋白表達水平顯著增高，提示RANKL可能與假體無菌性松動有關，可作為其預測因子。
RANKL在骨髓基質細胞、成骨細胞和活化的T細胞中以蛋白質形式表達。研究發現，RANKL與其受體RANK在骨髓和外圍血內相結合后，誘導破骨細胞前體細胞向破骨細胞分化，促進破骨細胞生長[15-17]。這為我們采用外周血中白細胞檢測RANKL表達水平提供了理論依據。RANKL與RANK結合后啟動并傳遞破骨細胞分化信號，RANK C-端構型發生改變，與TNF受體相關因子N-端環指/鋅指結構域結合，引起多種酶的級聯反應，從而使破骨細胞形成、分化[18-19]。RANKL基因敲除的小鼠表現為嚴重的骨硬化和出牙缺陷、破骨細胞完全缺失、T細胞和B細胞早期分化缺陷、缺少淋巴結和胸腺分化不足、乳腺發育缺陷[20-21]。
目前有關RANKL在假體無菌性松動中的作用研究主要集中于假體周圍組織的研究。Veigl等[22]觀察了59例THA術后假體無菌性松動患者的假體周圍組織，發現其中23例組織內含有大量RANKL陽性細胞，并且這些陽性細胞主要出現于含有大量磨損顆粒的組織內，因此他們認為RANKL與磨損顆粒引起的骨溶解密切相關。也有學者認為，RANKL/RANK是假體周圍界膜細胞以及界膜周圍細胞產生的許多骨溶解刺激因子作用的直接靶目標，假體周圍界膜中的細胞在磨損顆粒作用下產生各種骨溶解因子，通過影響RANKL/RANK的表達量使破骨細胞分化和活化，最終導致假體周圍骨溶解[23-27]。
為了解外周血中RANKL和骨保護素（osteop-rotegerin，OPG）是否與假體無菌性松動有關，Granci等[28]對36例無菌性假體松動患者、33例假體穩定患者、39例骨關節炎患者和20例健康志愿者的血清OPG和RANKL濃度進行檢測，發現無菌性假體松動患者假體股骨柄側的骨溶解影像學表現與RANKL水平和RANKL/OPG比值相關。本研究也發現試驗組THA術后假體無菌性松動患者血清中RANKL濃度較對照組患者顯著增高。進一步提取外周血白細胞進行RANKL 基因及蛋白檢測，發現試驗組患者白細胞中RANKL 基因及蛋白表達亦顯著高于對照組患者。這可能與假體磨損碎屑引起的局部炎性反應刺激大量炎性細胞產生多種炎性介質，趨化外周血中的單核巨噬細胞向假體周圍聚集，同時也刺激破骨細胞、T細胞分泌釋放RANKL有關。
綜上述，通過外周血白細胞及血清檢測RANKL 基因、蛋白表達和濃度，可能為臨床提供一種簡便預測THA術后假體無菌性松動的方法，但由于受樣本量以及置換術后假體穩定患者隨訪困難等因素限制，能否應用于臨床還需進一步擴大樣本量并行多中心臨床研究。
隨著人工關節材料和相關技術的發展，人工全髖關節置換術（total hip arthroplasty，THA）已成為治療髖關節終末期疾病的有效方法之一。假體周圍骨溶解是其最主要并發癥[1-2]。據報道，約20%患者因假體周圍骨溶解，最終導致假體無菌性松動[3-4]，嚴重影響關節置換術遠期療效，至今尚無有效治療措施及預測因子。目前認為假體無菌性松動的主要病理機制是磨損碎屑導致的假體周圍骨溶解[5-7]。研究表明[8-9]，NF-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）在破骨細胞分化過程中具有重要作用。RANKL與其受體--NF-κB受體活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）結合，對驅動破骨細胞從造血前體細胞的發育并活化為成熟破骨細胞提供了關鍵信號。為此，本研究通過觀察THA術后假體無菌性松動患者外周血中RANKL的表達變化，分析RANKL與假體無菌性松動的關系，旨在為假體無菌性松動的診斷和治療提供可能的預測因子和治療靶點。
1 材料與方法
1.1 實驗對象
納入標準：① 試驗組為因THA術后疼痛行髖關節翻修術患者，符合國際證件與評價系統（IDES）于1998年提出的THA術后假體松動的影像學診斷標準[10]；對照組為股骨頸骨折患者。② 年齡18～80歲。排除標準：翻修術中取出組織冰凍病理檢查和細菌培養顯示感染者。
2008年1月－2013年1月，共121例患者符合選擇標準納入研究。其中試驗組58例，對照組63例。 試驗組：男30例，女28例；年齡52～80歲，中位年齡65歲。左髖36例，右髖22例。關節置換原因：股骨頸骨折（≥70歲）27髖，均為頭下型；股骨頭缺血性壞死23髖；風濕性關節炎8髖。置換術后6～187個月出現假體無菌性松動，平均36.8個月。
對照組：男32例，女31例；年齡50～79歲，中位年齡63歲。左髖39例，右髖24例。骨折類型：經頸型27例，頭下型20例，基底型16例。傷后至入院時間1～72 h，平均3 h。
兩組患者年齡及性別比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。取兩組患者清晨空腹抗凝外周血進行檢測。
1.2 主要試劑及儀器
逆轉錄試劑盒（Takara公司，日本）；熒光定量試劑盒（Fermentas公司，美國）；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore公司，美國）；兔抗人RANKL一抗、兔抗人β-actin一抗（ProteinTech公司，美國）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（Invitrogen公司，美國）；ECL顯色試劑盒（Bio-Rad公司，美國）； ELISA試劑盒[博研（上海）生物科技有限公司]。Quantity One 4.6軟件（Bio-Rad公司，美國）；Primer 5.0引物設計軟件（Premier Biosoft International公司，美國）。
1.3 檢測指標
1.3.1 熒光定量PCR檢測
取兩組樣本各10 mL，加入2倍體積紅細胞裂解液，靜置10 min后以3 000 × g離心10 min，棄上清；重復加入紅細胞裂解液處理1次，沉淀即為白細胞。收集白細胞，棄上清，加入Trizol裂解細胞；提取樣品總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明合成cDNA；通過GenBank數據庫搜索人RANKL及人β-actin基因完整mRNA序列，Primer 5.0引物設計軟件設計引物，由美國Invitrogen公司合成；引物序列及產物長度見表 1。根據熒光定量試劑盒說明，采用2-ΔΔCt法檢測RANKL基因相對表達量。
表1
各基因引物序列及產物長度
Table1.
Primer sequences and product size
1.3.2 Western
blot檢測同上法收集白細胞，加入細胞裂解液，以12 000 × g離心5 min，上清即為白細胞的蛋白樣品。BCA法檢測蛋白濃度，取40 μg樣品PAGE凝膠電泳后轉至PVDF膜，將兔抗人RANKL一抗、兔抗人β-actin一抗以1∶500～1∶1 000稀釋，4℃孵育過夜；TBST洗液洗膜3次；將辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗以1∶5 000稀釋，室溫孵育1 h；漂洗后ECL Plus顯色。使用Quantity One 4.6軟件對條帶進行半定量分析，以與β-actin的比值作為RANKL蛋白相對表達量。
1.3.3 ELISA
檢測取兩組樣本各10 mL，參照ELISA試劑盒說明檢測RANKL濃度。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
熒光定量PCR及Western blot檢測示，試驗組RANKL基因、蛋白相對表達量分別為18.30 ± 1.09、0.856 ± 0.254，顯著高于對照組的1.00 ± 0.05、0.404 ± 0.102，比較差異均有統計學意義（t=125.390，P=0.000；t=13.032，P=0.000）。見圖 1。ELISA 檢測示，試驗組RANKL濃度為（3.553 5 ± 0.129 7）ng/mL，顯著高于對照組的（1.912 3 ± 0.126 2）ng/mL，比較差異有統計學意義（t=18.124，P=0.000）。
圖1
Western blot檢測兩組RANKL蛋白表達 1：對照組 2：試驗 組
Figure1.
Western blot detection for RANKL protein expression in 2 groups 1: Control group 2: Trial group
3 討論
假體無菌性松動是臨床THA術后翻修的主要原因，約占翻修患者的70% [11]。假體周圍骨溶解是導致無菌性松動的主要原因，而假體主要支撐表面之間因磨損產生的碎屑引起的局部炎性反應，則是造成骨溶解的主要原因之一。這些直徑＜ 1 μm的磨損顆粒能刺激大量炎性細胞分泌多種炎性介質，趨化外周血中的單核巨噬細胞向假體周圍聚集，刺激T細胞分泌巨噬細胞集落刺激因子，并促進成骨細胞及其他細胞釋放RANKL [12-14]。本研究也發現關節置換術后假體無菌性松動患者外周血中RANKL濃度及基因、蛋白表達水平顯著增高，提示RANKL可能與假體無菌性松動有關，可作為其預測因子。
RANKL在骨髓基質細胞、成骨細胞和活化的T細胞中以蛋白質形式表達。研究發現，RANKL與其受體RANK在骨髓和外圍血內相結合后，誘導破骨細胞前體細胞向破骨細胞分化，促進破骨細胞生長[15-17]。這為我們采用外周血中白細胞檢測RANKL表達水平提供了理論依據。RANKL與RANK結合后啟動并傳遞破骨細胞分化信號，RANK C-端構型發生改變，與TNF受體相關因子N-端環指/鋅指結構域結合，引起多種酶的級聯反應，從而使破骨細胞形成、分化[18-19]。RANKL基因敲除的小鼠表現為嚴重的骨硬化和出牙缺陷、破骨細胞完全缺失、T細胞和B細胞早期分化缺陷、缺少淋巴結和胸腺分化不足、乳腺發育缺陷[20-21]。
目前有關RANKL在假體無菌性松動中的作用研究主要集中于假體周圍組織的研究。Veigl等[22]觀察了59例THA術后假體無菌性松動患者的假體周圍組織，發現其中23例組織內含有大量RANKL陽性細胞，并且這些陽性細胞主要出現于含有大量磨損顆粒的組織內，因此他們認為RANKL與磨損顆粒引起的骨溶解密切相關。也有學者認為，RANKL/RANK是假體周圍界膜細胞以及界膜周圍細胞產生的許多骨溶解刺激因子作用的直接靶目標，假體周圍界膜中的細胞在磨損顆粒作用下產生各種骨溶解因子，通過影響RANKL/RANK的表達量使破骨細胞分化和活化，最終導致假體周圍骨溶解[23-27]。
為了解外周血中RANKL和骨保護素（osteop-rotegerin，OPG）是否與假體無菌性松動有關，Granci等[28]對36例無菌性假體松動患者、33例假體穩定患者、39例骨關節炎患者和20例健康志愿者的血清OPG和RANKL濃度進行檢測，發現無菌性假體松動患者假體股骨柄側的骨溶解影像學表現與RANKL水平和RANKL/OPG比值相關。本研究也發現試驗組THA術后假體無菌性松動患者血清中RANKL濃度較對照組患者顯著增高。進一步提取外周血白細胞進行RANKL 基因及蛋白檢測，發現試驗組患者白細胞中RANKL 基因及蛋白表達亦顯著高于對照組患者。這可能與假體磨損碎屑引起的局部炎性反應刺激大量炎性細胞產生多種炎性介質，趨化外周血中的單核巨噬細胞向假體周圍聚集，同時也刺激破骨細胞、T細胞分泌釋放RANKL有關。
綜上述，通過外周血白細胞及血清檢測RANKL 基因、蛋白表達和濃度，可能為臨床提供一種簡便預測THA術后假體無菌性松動的方法，但由于受樣本量以及置換術后假體穩定患者隨訪困難等因素限制，能否應用于臨床還需進一步擴大樣本量并行多中心臨床研究。
