引用本文： 方家劉, 尹宗生, 王偉, 陸鳴, 江正, 高維陸, 張碩, 余濤. 富白細胞和血小板血漿對BMSCs在兔股骨頭缺血性壞死中成骨作用的影響. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(2): 227-233. doi: 10.7507/1002-1892.20150048 復制
股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of femoral head，ANFH）是骨科常見疾病，各種治療方法在于延緩或阻止早期壞死進展，避免晚期行人工關節置換，但均存在一定不足[1-2]。BMSCs是一種具有自我更新及多種分化潛能的細胞，能分泌多種成骨活性因子，是組織工程常用種子細胞[3-5]。富白細胞和血小板血漿（leucocyte-and platelet-rich plasma，L-PRP）是通過離心法從外周血分離出的白細胞和血小板濃縮物，含有豐富的纖維蛋白網絡、各種生長因子及炎性反應抑制因子，具有促進組織修復、抑制炎性反應、控制感染和構建生物支架的潛能[6]。目前關于L-PRP對BMSCs成骨分化的作用尚存在爭議[7-9]。本實驗旨在通過動物實驗探索L-PRP在ANFH模型中對BMSCs成骨分化的影響，為BMSCs聯合L-PRP治療ANFH奠定理論基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～6月齡新西蘭大白兔24只，體重2.0～ 3.0 kg，雌雄不拘，由安徽醫科大學動物實驗室提供。DMEM/F12培養基（HyClone公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；胰蛋白酶（上海鼎國生物技術有限公司）；牛凝血酶、CD29、CD31、CD45及CD90單抗（Sigma公司，美國）。CO2孵箱（Harris公司，美國）；Airtech無菌超凈工作臺（蘇州富泰潔凈系統有限公司）；常溫超速離心機（Thermofisher公司，美國）；普通光學顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image-Pro Plus5.0計算機圖像分析系統（Media Cybernetics公司，美國）；MDGS圖像分析系統（Zeiss公司，德國）。
1.2 實驗方法
實驗動物隨機分成A、B、C、D 4組（n=6）。A組：單純行髓芯減壓；B組：髓芯減壓聯合L-PRP移植；C組：髓芯減壓聯合BMSCs移植；D組：髓芯減壓聯合BMSCs及L-PRP移植。
1.2.1 BMSCs分離培養及鑒定
取C、D組實驗動物，于雙側髂后上嵴穿刺抽取骨髓6 mL，緩慢轉入至離心管內（含淋巴細胞分離液2 mL），以離心半徑13.5 cm、2 000 r/min離心25 min；采用淋巴細胞分離液經密度梯度離心去除紅細胞等純化處理后，收集單核細胞層，洗滌2次，加至25 cm2培養瓶，加入含10%FBS的DMEM/F12培養基，于37℃、5%CO2孵箱內培養。48 h后換液，棄懸浮的單個核細胞及培養液，倒置相差顯微鏡下見散在貼壁，呈梭形、球形或菱形的細胞。每隔3～4 d換液1次，至細胞長滿至80%時，按1∶2比例傳代；第2代傳第3代時，取部分細胞接種于裝有載玻片的6孔板，預留檢測細胞表型；其余第3代細胞繼續培養備用。細胞移植前以0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌，以離心半徑13.5 cm、1 500 r/min離心5 min，計數細胞，配制成6×106 個 /mL細胞懸液。
細胞表型鑒定：棄6孔板培養液，PBS沖洗2遍，加入胰蛋白酶消化成細胞懸液，移至離心管，以離心半徑13.5 cm、1 500 r/min離心5 min，棄上清。PBS洗2次后3%多聚甲醛垂懸。4℃固定30 min，2%牛血清白蛋白封閉，加入CD29、 CD31、CD45 及CD90單抗孵育60 min，流式細胞儀檢測細胞表型。
1.2.2 L-PRP及其凝膠制備
采用Landesberg方法[10]制備L-PRP。取B、D組實驗動物，于耳背動脈抽取5 mL血液移至肝素抗凝管，以200×g離心10 min，在超凈臺內用槍頭吸取全部上清液及白膜層，加入離心管中，以200×g離心10 min，棄3/4上清，剩余0.5 mL即為L-PRP。取L-PRP光鏡下計數血小板，約（1 053.17±129.65）×109個/L。取5 000 U牛凝血酶溶解于5 mL 10% CaCl2溶液調配牛凝血酶溶液，取L-PRP或BMSCs/L-PRP混合物與牛凝血酶溶液以體積比（V/V）為1∶0.167混合，制備L-PRP或BMSCs/L-PRP凝膠。
1.2.3 ANFH動物模型制備
采用文獻[11]方法制備ANFH動物模型。取24只實驗動物，3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉，取髖關節前外側切口，顯露股骨頭及股骨頸前上部，行Light Bulb手術。在軟骨與骨交界處，以3.5 mm 電鉆頭向股骨頭前內側鉆孔，深4.0 mm。刮匙向內側潛行刮除部分股骨頭松質骨至軟骨下骨，占股骨頭總體積的50%～60%，模擬骨壞死行病灶清理術；干紗布保護股骨頭以外組織，用沾有液氮的棉球即刻填塞于缺損區冷凍，連續冷凍25次，每次約8 s，共持續約3 min，使骨細胞和骨髓細胞壞死，生理鹽水復溫，制備ANFH動物模型。
1.2.4 ANFH動物模型修復方法
A組：ANFH動物模型制備后即刻縫合切口。B組：ANFH動物模型制備后，吸取50 μL L-PRP按上述方法制備L-PRP凝膠（血小板數約5.25×107個）植入缺損區，骨蠟封閉骨孔，縫合切口。C組：ANFH動物模型制備后，吸取50 μL BMSCs懸液（BMSCs數約3×105個）植入缺損區，骨蠟封閉骨孔，縫合切口。D組：ANFH動物模型制備后，吸取50 μL L-PRP及50 μL BMSCs混勻后按上述方法制備L-PRP/BMSCs凝膠（血小板數約5.25×107個，BMSCs數約3×105個）植入缺損區，骨蠟封閉骨孔，縫合切口。術后連續3 d臀大肌肌肉注射硫酸慶大霉素，2 mL/只，每日1次。
1.3 觀測指標
1.3.1 X線片評價
術后2、4、8周，實驗動物以3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉后取仰臥位，攝髖關節正位X線片，觀察髖關節和骨缺損灶骨密度變化，并行Lane-Sandhu X線評分評價成骨情況[12]。
1.3.2 組織學觀測
攝片后，每組隨機取2只實驗動物處死，取股骨頭標本，10%甲醛固定48 h，5%～7%硝酸溶液脫鈣2周，沿冠狀面切開標本，常規石蠟包埋，連續切片，厚5 μm，HE染色，光鏡下觀察ANFH修復情況。每張切片在100倍鏡下隨機取10個視野，行血管計數，取均值。采用Image-Pro Plus5.0計算機圖像分析系統在100倍鏡下觀察，應用MDGS圖像分析系統采集圖像并分析，計算新生骨在骨缺損區所占面積百分比。
1.4 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs分離培養及鑒定
第3代細胞培養5 d，倒置相差顯微鏡下呈貼壁梭形生長（圖 1）。流式細胞儀檢測示，CD31、CD45表達陰性，CD29及CD90表達陽性（圖 2），表明傳代培養的細胞為BMSCs。
圖1
第3代細胞培養5 d，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態 ? ×100 ? ×400? ?圖 2 流式細胞儀鑒定 ? CD31 ? CD45 ? CD29 ? CD90
Figure1.
Morphological observation of BMSCs at passage 3 after cultured for 5 days under inverted phase contrast microscope ? ×100 ? ×400? ? Fig. 2 Identification of BMSCs by flow cytometry ? CD31 ? CD45 ? CD29 ? CD90
2.2 動物實驗
2.2.1 一般情況
所有動物無死亡，術后當天開始進食，傷口Ⅰ期愈合。
2.2.2 X線片評價
術后2周，各組缺損區均呈現低密度，C、D組缺損區密度較A、B組增高。4周，A組缺損區密度較2周時稍增高，邊緣骨小梁出現結構紊亂；B組缺損區密度稍增高，邊緣密度亦有所增高；C組缺損區密度較A、B組增高，但不及D組；D組缺損區密度進一步增高，有散在骨小梁出現，邊緣高密度，形成硬化線。8周，A組軟骨下出現明顯囊性變；B組缺損區密度較4周時增高，邊緣密度增高明顯；C組缺損區密度進一步增高，可見散在骨小梁結構；D組缺損區與正常區無明顯區別，有正常骨小梁結構。見圖 3。Lane-Sandhu X線評分示：術后2、4、8周C、D組成骨明顯優于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；D組優于C組，B組優于A組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
圖3
術后各時間點各組X線片 ? A組術后2周 ? A組術后4周 ? A組術后8周 ? B組術后2周 ? B組術后4周 ? B組術后8周 ? C組術后2周 ? C組術后4周 ? C組術后8周 ? D組術后2周 ? D組術后4周 ? D組術后8周
Figure3.
X-ray films in each group at different time points after operation ? Group A at 2 weeks ? Group A at 4 weeks ? Group A at 8 weeks ? Group B at 2 weeks ? Group B at 4 weeks ? Group B at 8 weeks ? Group C at 2 weeks ? Group C at 4 weeks ? Group C at 8 weeks ? Group D at 2 weeks ? Group D at 4 weeks ? Group D at 8 weeks
表1
各組術后各時間點X線評分比較(n=4，x±s)
Table1.
X-ray score in each group at postoperative different time points (n=4，x±s)
2.2.3 組織學觀測
A組：術后2周缺損區可見零星成骨細胞，周邊及負重區骨小窩內細胞萎縮，大量纖維組織充填；4周，周邊有新骨形成，中心部為疏松的纖維肉芽組織，空骨陷窩增多；8周，周邊為逐漸形成的骨壁，中心部為纖維組織，無骨組織充填，并可見軟骨與軟骨下骨分離，骨小梁斷裂等壞死征象。B組：術后2周缺損區可見少量成骨細胞，大量纖維組織充填，周邊少量成骨反應；4周，周邊有少量成骨反應，新生組織向中心部長入；8周，周邊為骨形成帶，中央部新生骨稀疏，排列紊亂。C組：術后2周缺損區內有較多成骨細胞，周邊有類骨質及新生骨小梁出現；4周，缺損區有較多骨小梁及類骨質填充；8周，出現比較成熟的骨小梁及骨髓組織。D組：術后2周缺損區內可見大量成骨細胞，周邊可見新生骨小梁及原始毛細血管形成；4周，缺損區新生骨小梁板層狀或編織狀，毛細血管豐富，但修復尚不均勻；8周，缺損區可見成熟的骨小梁變寬變粗，排列規則。見圖 4。
圖4
術后各時間點各組組織學觀察（HE×100） ? A組術后2周 ? A組術后4周 ? A組術后8周 ? B組術后2周 ? B組術后4周 ? B組術后8周 ? C組術后2周 ? C組術后4周 ? C組術后8周 ? D組術后2周 ? D組術后4周 ? D組術后8周
Figure4.
Histological observation in each group at different time points after operation (HE×100) ? Group A at 2 weeks ? Group A at 4 weeks ? Group A at 8 weeks ? Group B at 2 weeks ? Group B at 4 weeks ? Group B at 8 weeks ? Group C at 2 weeks ? Group C at 4 weeks ? Group C at 8 weeks ? Group D at 2 weeks ? Group D at 4 weeks ?Group D at 8 weeks
修復區內骨形態計量與血管計數：術后2、4、8周，C、D組新生骨面積百分比及血管計數明顯優于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；D組優于C組，B組優于A組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2、3。
表2
各組術后各時間點新生骨面積百分比比較(n=4,%，x±s)
Table2.
New bone area ratio in each group at postoperative different time points (n=4,%，x±s)
表3
各組術后各時間點血管計數比較(n=4，x±s)
Table3.
New blood vessel count in each group at postoperative different time points (n=4，x±s)
3 討論
ANFH常因疼痛影響髖關節功能，最終導致股骨頭表面塌陷、骨性關節炎，終末期需行髖關節置換術治療[13]。目前針對早期，即小區域及未塌陷階段的ANFH，采取各種保留股骨頭的方法進行治療。
髓芯減壓是治療早期ANFH的常用方法之一，可有效降低股骨頭內壓，有助于壞死區域內血管再生，但臨床有效率報道不一[14]。Buckley等[15]提出，單純髓芯減壓成功率為30%～90%。Steinberg等[16]報道約36%患者于術后30個月需行全髖關節置換，成功率因術前壞死階段及壞死范圍不同而異。研究者認為髓芯減壓失敗可能是由于病損區成骨細胞缺乏，導致單純髓芯減壓并不能提升壞死區骨的再生能力[17-18]。另有學者研究發現 [19-20]，ANFH患者壞死股骨頭內前體細胞增殖能力減低。成骨細胞缺乏是導致壞死的原因之一，因此增加前體細胞數量成為治療ANFH的潛在目標。
BMSCs來源于發育期中胚層，存在于骨髓組織中，是一種多分化潛能的祖細胞，容易收集及體外擴增，其分化受多種生長因子調控，成骨能力確切，并且來源廣泛，取材簡便，對機體創傷小，在骨缺損修復中具有重要作用。自體BMSCs移植很少發生免疫排斥反應，具有自我更新能力、很強的黏附性、可塑性及快速增殖形成克隆的能力，是骨組織工程最佳種子細胞來源之一[3-5]。
L-PRP是通過離心從自體血中提取的白細胞和血小板濃縮物，含有豐富的纖維蛋白網絡，可用作組織工程支架材料，同時又富含各種生長因子，包括PDGF、TGF-β、VEGF、IGF、EGF等，可刺激細胞增殖、合成與代謝。血小板還可釋放一些炎性抑制因子如：IL-1受體拮抗劑、可溶性TNF受體Ⅰ和Ⅱ、IL-4、IL-10、IL-13和IFN-γ等，可抑制IL-1β引起的炎性反應，保護細胞免受炎性反應損傷。白細胞在機體微生物防御反應中發揮重要作用，可直接或間接殺滅或抑制病原菌，控制感染[6]。目前對L-PRP促進骨再生的能力尚存在爭議，部分學者[21-22]認為L-PRP能夠促進骨再生，加速骨缺損修復；然而部分學者[23-24]在動物骨缺損模型中發現，L-PRP對骨再生無明顯促進作用；另外還有些學者[8-9]通過體外實驗認為L-PRP可促進BMSCs增殖，但對其成骨分化具有抑制作用。
Chen等[25]報道中等濃度L-PRP（2.65±0.20） × 109個/ mL具有促進BMSCs成骨分化，并抑制向脂肪分化的作用，然而高濃度L-PRP（8.21± 0.40） ×109 個 / mL則抑制BMSCs成骨分化。Aghaloo 等[23]則認為低濃度L-PRP（0.85±0.16） ×109個 / mL 和高濃度L-PRP（8.0±0.5）×109個/mL均無促BMSCs成骨分化的作用，認為L-PRP濃度與其生物學作用無明顯關聯。Thorwarth等 [26]則發現較高濃度L-PRP（約正常血的6.5倍）較低濃度L-PRP（約4.1 倍）成骨作用更好。
本研究顯示在兔ANFH模型中，髓芯減壓聯合BMSCs及L-PRP相對于單純髓芯減壓或髓芯減壓聯合L-PRP或BMSCs能更有效促進骨再生及缺損壞死區修復。本研究中C組單純聯合BMSCs的成骨作用優于B組單純聯合L-PRP，考慮原因可能是壞死股骨頭缺乏足夠的前體細胞及前體細胞增殖能力減弱，導致B組股骨頭內骨再生能力減低；同時L-PRP凝膠可有效減少植入物流失，增加了BMSCs及L-PRP的利用率。本研究發現L-PRP可有效促進骨形成，然而最佳L-PRP及生長因子濃度尚需深入研究。
綜上述，髓芯減壓聯合BMSCs及L-PRP較單純髓芯減壓或髓芯減壓聯合BMSCs或L-PRP對早期兔ANFH模型具有更好的治療作用；L-PRP對BMSCs具有促成骨分化作用，為髓芯減壓聯合BMSCs及L-PRP移植治療早期ANFH奠定了理論基礎。
股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of femoral head，ANFH）是骨科常見疾病，各種治療方法在于延緩或阻止早期壞死進展，避免晚期行人工關節置換，但均存在一定不足[1-2]。BMSCs是一種具有自我更新及多種分化潛能的細胞，能分泌多種成骨活性因子，是組織工程常用種子細胞[3-5]。富白細胞和血小板血漿（leucocyte-and platelet-rich plasma，L-PRP）是通過離心法從外周血分離出的白細胞和血小板濃縮物，含有豐富的纖維蛋白網絡、各種生長因子及炎性反應抑制因子，具有促進組織修復、抑制炎性反應、控制感染和構建生物支架的潛能[6]。目前關于L-PRP對BMSCs成骨分化的作用尚存在爭議[7-9]。本實驗旨在通過動物實驗探索L-PRP在ANFH模型中對BMSCs成骨分化的影響，為BMSCs聯合L-PRP治療ANFH奠定理論基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～6月齡新西蘭大白兔24只，體重2.0～ 3.0 kg，雌雄不拘，由安徽醫科大學動物實驗室提供。DMEM/F12培養基（HyClone公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；胰蛋白酶（上海鼎國生物技術有限公司）；牛凝血酶、CD29、CD31、CD45及CD90單抗（Sigma公司，美國）。CO2孵箱（Harris公司，美國）；Airtech無菌超凈工作臺（蘇州富泰潔凈系統有限公司）；常溫超速離心機（Thermofisher公司，美國）；普通光學顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image-Pro Plus5.0計算機圖像分析系統（Media Cybernetics公司，美國）；MDGS圖像分析系統（Zeiss公司，德國）。
1.2 實驗方法
實驗動物隨機分成A、B、C、D 4組（n=6）。A組：單純行髓芯減壓；B組：髓芯減壓聯合L-PRP移植；C組：髓芯減壓聯合BMSCs移植；D組：髓芯減壓聯合BMSCs及L-PRP移植。
1.2.1 BMSCs分離培養及鑒定
取C、D組實驗動物，于雙側髂后上嵴穿刺抽取骨髓6 mL，緩慢轉入至離心管內（含淋巴細胞分離液2 mL），以離心半徑13.5 cm、2 000 r/min離心25 min；采用淋巴細胞分離液經密度梯度離心去除紅細胞等純化處理后，收集單核細胞層，洗滌2次，加至25 cm2培養瓶，加入含10%FBS的DMEM/F12培養基，于37℃、5%CO2孵箱內培養。48 h后換液，棄懸浮的單個核細胞及培養液，倒置相差顯微鏡下見散在貼壁，呈梭形、球形或菱形的細胞。每隔3～4 d換液1次，至細胞長滿至80%時，按1∶2比例傳代；第2代傳第3代時，取部分細胞接種于裝有載玻片的6孔板，預留檢測細胞表型；其余第3代細胞繼續培養備用。細胞移植前以0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌，以離心半徑13.5 cm、1 500 r/min離心5 min，計數細胞，配制成6×106 個 /mL細胞懸液。
細胞表型鑒定：棄6孔板培養液，PBS沖洗2遍，加入胰蛋白酶消化成細胞懸液，移至離心管，以離心半徑13.5 cm、1 500 r/min離心5 min，棄上清。PBS洗2次后3%多聚甲醛垂懸。4℃固定30 min，2%牛血清白蛋白封閉，加入CD29、 CD31、CD45 及CD90單抗孵育60 min，流式細胞儀檢測細胞表型。
1.2.2 L-PRP及其凝膠制備
采用Landesberg方法[10]制備L-PRP。取B、D組實驗動物，于耳背動脈抽取5 mL血液移至肝素抗凝管，以200×g離心10 min，在超凈臺內用槍頭吸取全部上清液及白膜層，加入離心管中，以200×g離心10 min，棄3/4上清，剩余0.5 mL即為L-PRP。取L-PRP光鏡下計數血小板，約（1 053.17±129.65）×109個/L。取5 000 U牛凝血酶溶解于5 mL 10% CaCl2溶液調配牛凝血酶溶液，取L-PRP或BMSCs/L-PRP混合物與牛凝血酶溶液以體積比（V/V）為1∶0.167混合，制備L-PRP或BMSCs/L-PRP凝膠。
1.2.3 ANFH動物模型制備
采用文獻[11]方法制備ANFH動物模型。取24只實驗動物，3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉，取髖關節前外側切口，顯露股骨頭及股骨頸前上部，行Light Bulb手術。在軟骨與骨交界處，以3.5 mm 電鉆頭向股骨頭前內側鉆孔，深4.0 mm。刮匙向內側潛行刮除部分股骨頭松質骨至軟骨下骨，占股骨頭總體積的50%～60%，模擬骨壞死行病灶清理術；干紗布保護股骨頭以外組織，用沾有液氮的棉球即刻填塞于缺損區冷凍，連續冷凍25次，每次約8 s，共持續約3 min，使骨細胞和骨髓細胞壞死，生理鹽水復溫，制備ANFH動物模型。
1.2.4 ANFH動物模型修復方法
A組：ANFH動物模型制備后即刻縫合切口。B組：ANFH動物模型制備后，吸取50 μL L-PRP按上述方法制備L-PRP凝膠（血小板數約5.25×107個）植入缺損區，骨蠟封閉骨孔，縫合切口。C組：ANFH動物模型制備后，吸取50 μL BMSCs懸液（BMSCs數約3×105個）植入缺損區，骨蠟封閉骨孔，縫合切口。D組：ANFH動物模型制備后，吸取50 μL L-PRP及50 μL BMSCs混勻后按上述方法制備L-PRP/BMSCs凝膠（血小板數約5.25×107個，BMSCs數約3×105個）植入缺損區，骨蠟封閉骨孔，縫合切口。術后連續3 d臀大肌肌肉注射硫酸慶大霉素，2 mL/只，每日1次。
1.3 觀測指標
1.3.1 X線片評價
術后2、4、8周，實驗動物以3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉后取仰臥位，攝髖關節正位X線片，觀察髖關節和骨缺損灶骨密度變化，并行Lane-Sandhu X線評分評價成骨情況[12]。
1.3.2 組織學觀測
攝片后，每組隨機取2只實驗動物處死，取股骨頭標本，10%甲醛固定48 h，5%～7%硝酸溶液脫鈣2周，沿冠狀面切開標本，常規石蠟包埋，連續切片，厚5 μm，HE染色，光鏡下觀察ANFH修復情況。每張切片在100倍鏡下隨機取10個視野，行血管計數，取均值。采用Image-Pro Plus5.0計算機圖像分析系統在100倍鏡下觀察，應用MDGS圖像分析系統采集圖像并分析，計算新生骨在骨缺損區所占面積百分比。
1.4 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs分離培養及鑒定
第3代細胞培養5 d，倒置相差顯微鏡下呈貼壁梭形生長（圖 1）。流式細胞儀檢測示，CD31、CD45表達陰性，CD29及CD90表達陽性（圖 2），表明傳代培養的細胞為BMSCs。
圖1
第3代細胞培養5 d，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態 ? ×100 ? ×400? ?圖 2 流式細胞儀鑒定 ? CD31 ? CD45 ? CD29 ? CD90
Figure1.
Morphological observation of BMSCs at passage 3 after cultured for 5 days under inverted phase contrast microscope ? ×100 ? ×400? ? Fig. 2 Identification of BMSCs by flow cytometry ? CD31 ? CD45 ? CD29 ? CD90
2.2 動物實驗
2.2.1 一般情況
所有動物無死亡，術后當天開始進食，傷口Ⅰ期愈合。
2.2.2 X線片評價
術后2周，各組缺損區均呈現低密度，C、D組缺損區密度較A、B組增高。4周，A組缺損區密度較2周時稍增高，邊緣骨小梁出現結構紊亂；B組缺損區密度稍增高，邊緣密度亦有所增高；C組缺損區密度較A、B組增高，但不及D組；D組缺損區密度進一步增高，有散在骨小梁出現，邊緣高密度，形成硬化線。8周，A組軟骨下出現明顯囊性變；B組缺損區密度較4周時增高，邊緣密度增高明顯；C組缺損區密度進一步增高，可見散在骨小梁結構；D組缺損區與正常區無明顯區別，有正常骨小梁結構。見圖 3。Lane-Sandhu X線評分示：術后2、4、8周C、D組成骨明顯優于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；D組優于C組，B組優于A組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
圖3
術后各時間點各組X線片 ? A組術后2周 ? A組術后4周 ? A組術后8周 ? B組術后2周 ? B組術后4周 ? B組術后8周 ? C組術后2周 ? C組術后4周 ? C組術后8周 ? D組術后2周 ? D組術后4周 ? D組術后8周
Figure3.
X-ray films in each group at different time points after operation ? Group A at 2 weeks ? Group A at 4 weeks ? Group A at 8 weeks ? Group B at 2 weeks ? Group B at 4 weeks ? Group B at 8 weeks ? Group C at 2 weeks ? Group C at 4 weeks ? Group C at 8 weeks ? Group D at 2 weeks ? Group D at 4 weeks ? Group D at 8 weeks
表1
各組術后各時間點X線評分比較(n=4，x±s)
Table1.
X-ray score in each group at postoperative different time points (n=4，x±s)
2.2.3 組織學觀測
A組：術后2周缺損區可見零星成骨細胞，周邊及負重區骨小窩內細胞萎縮，大量纖維組織充填；4周，周邊有新骨形成，中心部為疏松的纖維肉芽組織，空骨陷窩增多；8周，周邊為逐漸形成的骨壁，中心部為纖維組織，無骨組織充填，并可見軟骨與軟骨下骨分離，骨小梁斷裂等壞死征象。B組：術后2周缺損區可見少量成骨細胞，大量纖維組織充填，周邊少量成骨反應；4周，周邊有少量成骨反應，新生組織向中心部長入；8周，周邊為骨形成帶，中央部新生骨稀疏，排列紊亂。C組：術后2周缺損區內有較多成骨細胞，周邊有類骨質及新生骨小梁出現；4周，缺損區有較多骨小梁及類骨質填充；8周，出現比較成熟的骨小梁及骨髓組織。D組：術后2周缺損區內可見大量成骨細胞，周邊可見新生骨小梁及原始毛細血管形成；4周，缺損區新生骨小梁板層狀或編織狀，毛細血管豐富，但修復尚不均勻；8周，缺損區可見成熟的骨小梁變寬變粗，排列規則。見圖 4。
圖4
術后各時間點各組組織學觀察（HE×100） ? A組術后2周 ? A組術后4周 ? A組術后8周 ? B組術后2周 ? B組術后4周 ? B組術后8周 ? C組術后2周 ? C組術后4周 ? C組術后8周 ? D組術后2周 ? D組術后4周 ? D組術后8周
Figure4.
Histological observation in each group at different time points after operation (HE×100) ? Group A at 2 weeks ? Group A at 4 weeks ? Group A at 8 weeks ? Group B at 2 weeks ? Group B at 4 weeks ? Group B at 8 weeks ? Group C at 2 weeks ? Group C at 4 weeks ? Group C at 8 weeks ? Group D at 2 weeks ? Group D at 4 weeks ?Group D at 8 weeks
修復區內骨形態計量與血管計數：術后2、4、8周，C、D組新生骨面積百分比及血管計數明顯優于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；D組優于C組，B組優于A組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2、3。
表2
各組術后各時間點新生骨面積百分比比較(n=4,%，x±s)
Table2.
New bone area ratio in each group at postoperative different time points (n=4,%，x±s)
表3
各組術后各時間點血管計數比較(n=4，x±s)
Table3.
New blood vessel count in each group at postoperative different time points (n=4，x±s)
3 討論
ANFH常因疼痛影響髖關節功能，最終導致股骨頭表面塌陷、骨性關節炎，終末期需行髖關節置換術治療[13]。目前針對早期，即小區域及未塌陷階段的ANFH，采取各種保留股骨頭的方法進行治療。
髓芯減壓是治療早期ANFH的常用方法之一，可有效降低股骨頭內壓，有助于壞死區域內血管再生，但臨床有效率報道不一[14]。Buckley等[15]提出，單純髓芯減壓成功率為30%～90%。Steinberg等[16]報道約36%患者于術后30個月需行全髖關節置換，成功率因術前壞死階段及壞死范圍不同而異。研究者認為髓芯減壓失敗可能是由于病損區成骨細胞缺乏，導致單純髓芯減壓并不能提升壞死區骨的再生能力[17-18]。另有學者研究發現 [19-20]，ANFH患者壞死股骨頭內前體細胞增殖能力減低。成骨細胞缺乏是導致壞死的原因之一，因此增加前體細胞數量成為治療ANFH的潛在目標。
BMSCs來源于發育期中胚層，存在于骨髓組織中，是一種多分化潛能的祖細胞，容易收集及體外擴增，其分化受多種生長因子調控，成骨能力確切，并且來源廣泛，取材簡便，對機體創傷小，在骨缺損修復中具有重要作用。自體BMSCs移植很少發生免疫排斥反應，具有自我更新能力、很強的黏附性、可塑性及快速增殖形成克隆的能力，是骨組織工程最佳種子細胞來源之一[3-5]。
L-PRP是通過離心從自體血中提取的白細胞和血小板濃縮物，含有豐富的纖維蛋白網絡，可用作組織工程支架材料，同時又富含各種生長因子，包括PDGF、TGF-β、VEGF、IGF、EGF等，可刺激細胞增殖、合成與代謝。血小板還可釋放一些炎性抑制因子如：IL-1受體拮抗劑、可溶性TNF受體Ⅰ和Ⅱ、IL-4、IL-10、IL-13和IFN-γ等，可抑制IL-1β引起的炎性反應，保護細胞免受炎性反應損傷。白細胞在機體微生物防御反應中發揮重要作用，可直接或間接殺滅或抑制病原菌，控制感染[6]。目前對L-PRP促進骨再生的能力尚存在爭議，部分學者[21-22]認為L-PRP能夠促進骨再生，加速骨缺損修復；然而部分學者[23-24]在動物骨缺損模型中發現，L-PRP對骨再生無明顯促進作用；另外還有些學者[8-9]通過體外實驗認為L-PRP可促進BMSCs增殖，但對其成骨分化具有抑制作用。
Chen等[25]報道中等濃度L-PRP（2.65±0.20） × 109個/ mL具有促進BMSCs成骨分化，并抑制向脂肪分化的作用，然而高濃度L-PRP（8.21± 0.40） ×109 個 / mL則抑制BMSCs成骨分化。Aghaloo 等[23]則認為低濃度L-PRP（0.85±0.16） ×109個 / mL 和高濃度L-PRP（8.0±0.5）×109個/mL均無促BMSCs成骨分化的作用，認為L-PRP濃度與其生物學作用無明顯關聯。Thorwarth等 [26]則發現較高濃度L-PRP（約正常血的6.5倍）較低濃度L-PRP（約4.1 倍）成骨作用更好。
本研究顯示在兔ANFH模型中，髓芯減壓聯合BMSCs及L-PRP相對于單純髓芯減壓或髓芯減壓聯合L-PRP或BMSCs能更有效促進骨再生及缺損壞死區修復。本研究中C組單純聯合BMSCs的成骨作用優于B組單純聯合L-PRP，考慮原因可能是壞死股骨頭缺乏足夠的前體細胞及前體細胞增殖能力減弱，導致B組股骨頭內骨再生能力減低；同時L-PRP凝膠可有效減少植入物流失，增加了BMSCs及L-PRP的利用率。本研究發現L-PRP可有效促進骨形成，然而最佳L-PRP及生長因子濃度尚需深入研究。
綜上述，髓芯減壓聯合BMSCs及L-PRP較單純髓芯減壓或髓芯減壓聯合BMSCs或L-PRP對早期兔ANFH模型具有更好的治療作用；L-PRP對BMSCs具有促成骨分化作用，為髓芯減壓聯合BMSCs及L-PRP移植治療早期ANFH奠定了理論基礎。
