引用本文： 王國忠, 李成軍, 范希超, 李波, 肖薇, 金莉. BMSCs對胃潰瘍修復的影響研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(7): 889-892. doi: 10.7507/1002-1892.20150191 復制
BMSCs具有自我更新能力和多向分化潛能，其低免疫原性和歸巢功能可用于體外移植治療疾病[1]。外源性BMSCs能夠修復重建損傷的胃黏膜而加速胃潰瘍愈合[2-3]，但對修復后胃黏膜愈合質量的影響國內外尚未見報道。潰瘍愈合質量低下是引起潰瘍復發的重要因素[4]。乙酸胃潰瘍與人的消化性胃潰瘍在組織學上十分相似，是研究胃潰瘍的經典模型。為此，本研究采用乙酸胃潰瘍模型，將BMSCs移植于潰瘍周圍，探討BMSCs對胃潰瘍愈合質量的影響和機制，以闡明BMSCs修復重建損傷組織的作用和機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級雄性Wistar大鼠48只，體重180～210 g，購于哈爾濱醫科大學實驗動物中心。
Wistar大鼠BMSCs、Wistar大鼠BMSCs完全培養基[賽業（廣州）生物科技有限公司]；VEGF一抗（Peprotech公司，美國）；VEGF酶標二抗、DAB顯色試劑盒（康為世紀生物科技有限公司）。VS-1300L-U超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；Thermo 3111型CO2培養箱（Thermo公司，美國）；DSZ-5000X型倒置顯微鏡（重慶澳浦光電技術有限公司）；Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析儀（麥克奧迪有限公司）；RM2015型Leica切片機（Leica公司，德國）。
1.2 BMSCs的復蘇
按說明書操作，從- 80℃冰箱中取出凍存的Wistar大鼠BMSCs，37℃水浴解凍，移入離心管中，
加入10 mL Wistar大鼠BMSCs完全培養基，以250×g離心5 min；棄上清液，加入3 mL Wistar大鼠BMSCs完全培養基，以（2.0～4.0）×104個/cm2細胞密度接種至培養瓶中培養，每2天換液，當細胞達80%～90%匯合度時傳代。
1.3 乙酸胃潰瘍模型制備及分組
按文獻[5]報道方法制備胃潰瘍模型，具體操作：取清潔級雄性Wistar大鼠48只，乙醚吸入麻醉后，行剖腹術將胃拉出腹腔，將內徑6 mm 的塑料管緊貼于胃體與幽門交界處，向管內注入99.5%（V/ V）乙酸75 μL，25 s后移除乙酸，縫合腹壁。造模后第3 天同上法麻醉后打開腹腔，觀察胃的外面可見接觸乙酸區域呈淡黃色、圓形，面積約27 mm2，提示造模成功。將造模后大鼠隨機分為3組，每組16只。A組僅打開腹腔，拉出胃；B、C組打開腹腔拉出胃后，在潰瘍周圍胃壁漿膜下5個不同點分別注入150 μL PBS和150 μL第4代BMSCs PBS液（細胞密度為1×108個 /100 μL）。各組處理完后，將胃復位后縫合切口。造模后第10天頸椎脫臼法處死大鼠，收集標本，進行各項指標檢測。
1.4 檢測指標
1.4.1 潰瘍面積測量
測量各組潰瘍長和寬，按以下公式計算潰瘍面積：（潰瘍長×潰瘍寬） /4×π，其中π≈3.14。
1.4.2 再生胃黏膜厚度和擴張腺體數檢測
按文獻[6]方法，以潰瘍為中心，沿胃長軸取材，每組隨機取4個標本切片行HE染色，每張切片隨機取2個視野，于100倍光鏡下測量切片中潰瘍邊緣最厚處的再生黏膜厚度，400倍光鏡下計數切片中潰瘍邊緣再生黏膜內囊狀擴張的腺體數。
1.4.3 VEGF表達檢測
采用免疫組織化學Elivison二步法檢測。VEGF一抗和二抗均按1∶150 稀釋，用 DAB 顯色試劑盒顯色。每組隨機取4張切片，每張切片隨機取2個視野，400倍光鏡下用數碼醫學圖像分析儀檢測其積分吸光度（IA）值。
1.5 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 潰瘍面積測量
A、B、C組潰瘍面積分別為（12.61±2.94）、（13.13±3.09）、（8.21±2.46）mm2，C組潰瘍面積顯著低于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.01）；A、B組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.2 再生胃黏膜厚度和擴張腺體數檢測
HE染色示，C組潰瘍邊緣胃黏膜較A、B組厚，擴張的腺體較少，黏膜結構較規則。見圖 1。A、B、C組再生胃黏膜厚度分別為（210.88±28.51）、（225.63±32.41）、（273.38±35.04）μm，C組顯著厚于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.01）；A、B組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。A、B、C組擴張腺體數分別為（26.38±7.25）、（24.50±5.21）、（15.13±6.60）個/HP，C組顯著少于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.01）；A、B組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
圖1
各組潰瘍部位組織學觀察（HE×100） ? A組 ? B組 ? C組 ? ?2.3 VEGF表達檢測
免疫組織化學染色示，C組潰瘍邊緣胃黏膜VEGF陽性表達顯著多于A、B組。見圖 2。A、B、C組VEGF表達IA值分別為11.21±4.31、13.46±3.03、19.66±5.25，C組顯著高于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.01）；A、B組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
3 討論
干細胞具有自我更新和多向分化潛能，是組織損傷后進行再生修復的基礎，分為胚胎干細胞和成體干細胞。BMSCs是中胚層來源的成體干細胞，并保持分化成結締組織譜系和其他胚層細胞的能力[7]，具有取材方便、來源充足[8]、低免疫原性[9]、允許同種異體移植[10]等優點。目前有3種移植方式：靜脈注射、動脈注射和立體定位直接注射[11]，現多采用直接注射方式進行移植[12]。BMSCs已在治療心血管疾病、急性肺損傷、免疫性疾病、皮膚再生、骨損傷和血液系統疾病等方面的臨床研究中取得了較好效果[13]，是組織工程和再生醫學領域重要的種子細胞[14]，具有廣泛的臨床應用前景[15]。消化性胃潰瘍是一種常見病、多發病，具有自限性，在無攻擊因子存在時，機體會動員自身的防衛功能經過一段時間使潰瘍自然愈合；抗潰瘍藥雖能加速潰瘍愈合，但愈合的黏膜組織結構也與正常胃黏膜有很大差異，即潰瘍愈合質量低下，形態學表現為再生黏膜厚度降低、腺體擴張等，這導致了胃黏膜的防御功能降低，潰瘍容易復發[16]。
本研究在造模后第3天于潰瘍周圍注入BM SCs，第10天檢測發現C組潰瘍面積小于A、B組（P＜0.01），而A、B組比較差異無統計學意義（P＞0.05），表明BMSCs移植于潰瘍周圍能夠加速潰瘍愈合。組織學觀察示，C組潰瘍邊緣再生的胃黏膜較A、B組厚，擴張的腺體較少，黏膜結構亦較規則；且定量分析顯示，C組再生黏膜厚度高于A、B組（P＜0.01），而A、B組比較差異無統計學意義（P＞0.05），表明BMSCs能夠提高潰瘍愈合質量。BMSCs移植于潰瘍周圍后，能夠分化成胃間質細胞，以進行潰瘍修復[2-3]，我們認為這可能是提高潰瘍愈合質量的機制之一。生長因子在修復損傷組織中起到了非常重要的作用，外源性BMSCs在修復損傷組織時能夠產生EGF、VEGF等[17]，還能增加胃黏膜VEGF受體的表達[18]，改善胃黏膜微循環，促進胃黏膜再生[19]。VEGF是血管內皮細胞特異性的生長因子[20]，能夠誘導血管發生[21]。本研究免疫組織化學染色示，C組VEGF表達多于A、B組，C組VEGF的IA值高于A、B組（P＜0.01），而A、B組比較差異無統計學意義（P＞0.05），這可能是由于移植的BMSCs分泌VEGF而使黏膜VEGF增多，進而促進血管生成，改善胃黏膜微循環，促進胃黏膜再生，加速潰瘍愈合。
綜上述，局部移植BMSCs于潰瘍周圍，能夠加速潰瘍愈合，其機制可能是移植的BMSCs分泌VEGF和分化為胃間質細胞，修復重建了胃黏膜組織，提高了潰瘍愈合質量。本實驗直接將干細胞注入潰瘍邊緣，雖然能控制注入干細胞的數量，但大鼠需二次手術是其不足。另外，還需進一步研究干細胞在潰瘍周圍環境下表達VEGF的機制。
BMSCs具有自我更新能力和多向分化潛能，其低免疫原性和歸巢功能可用于體外移植治療疾病[1]。外源性BMSCs能夠修復重建損傷的胃黏膜而加速胃潰瘍愈合[2-3]，但對修復后胃黏膜愈合質量的影響國內外尚未見報道。潰瘍愈合質量低下是引起潰瘍復發的重要因素[4]。乙酸胃潰瘍與人的消化性胃潰瘍在組織學上十分相似，是研究胃潰瘍的經典模型。為此，本研究采用乙酸胃潰瘍模型，將BMSCs移植于潰瘍周圍，探討BMSCs對胃潰瘍愈合質量的影響和機制，以闡明BMSCs修復重建損傷組織的作用和機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級雄性Wistar大鼠48只，體重180～210 g，購于哈爾濱醫科大學實驗動物中心。
Wistar大鼠BMSCs、Wistar大鼠BMSCs完全培養基[賽業（廣州）生物科技有限公司]；VEGF一抗（Peprotech公司，美國）；VEGF酶標二抗、DAB顯色試劑盒（康為世紀生物科技有限公司）。VS-1300L-U超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；Thermo 3111型CO2培養箱（Thermo公司，美國）；DSZ-5000X型倒置顯微鏡（重慶澳浦光電技術有限公司）；Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析儀（麥克奧迪有限公司）；RM2015型Leica切片機（Leica公司，德國）。
1.2 BMSCs的復蘇
按說明書操作，從- 80℃冰箱中取出凍存的Wistar大鼠BMSCs，37℃水浴解凍，移入離心管中，
加入10 mL Wistar大鼠BMSCs完全培養基，以250×g離心5 min；棄上清液，加入3 mL Wistar大鼠BMSCs完全培養基，以（2.0～4.0）×104個/cm2細胞密度接種至培養瓶中培養，每2天換液，當細胞達80%～90%匯合度時傳代。
1.3 乙酸胃潰瘍模型制備及分組
按文獻[5]報道方法制備胃潰瘍模型，具體操作：取清潔級雄性Wistar大鼠48只，乙醚吸入麻醉后，行剖腹術將胃拉出腹腔，將內徑6 mm 的塑料管緊貼于胃體與幽門交界處，向管內注入99.5%（V/ V）乙酸75 μL，25 s后移除乙酸，縫合腹壁。造模后第3 天同上法麻醉后打開腹腔，觀察胃的外面可見接觸乙酸區域呈淡黃色、圓形，面積約27 mm2，提示造模成功。將造模后大鼠隨機分為3組，每組16只。A組僅打開腹腔，拉出胃；B、C組打開腹腔拉出胃后，在潰瘍周圍胃壁漿膜下5個不同點分別注入150 μL PBS和150 μL第4代BMSCs PBS液（細胞密度為1×108個 /100 μL）。各組處理完后，將胃復位后縫合切口。造模后第10天頸椎脫臼法處死大鼠，收集標本，進行各項指標檢測。
1.4 檢測指標
1.4.1 潰瘍面積測量
測量各組潰瘍長和寬，按以下公式計算潰瘍面積：（潰瘍長×潰瘍寬） /4×π，其中π≈3.14。
1.4.2 再生胃黏膜厚度和擴張腺體數檢測
按文獻[6]方法，以潰瘍為中心，沿胃長軸取材，每組隨機取4個標本切片行HE染色，每張切片隨機取2個視野，于100倍光鏡下測量切片中潰瘍邊緣最厚處的再生黏膜厚度，400倍光鏡下計數切片中潰瘍邊緣再生黏膜內囊狀擴張的腺體數。
1.4.3 VEGF表達檢測
采用免疫組織化學Elivison二步法檢測。VEGF一抗和二抗均按1∶150 稀釋，用 DAB 顯色試劑盒顯色。每組隨機取4張切片，每張切片隨機取2個視野，400倍光鏡下用數碼醫學圖像分析儀檢測其積分吸光度（IA）值。
1.5 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 潰瘍面積測量
A、B、C組潰瘍面積分別為（12.61±2.94）、（13.13±3.09）、（8.21±2.46）mm2，C組潰瘍面積顯著低于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.01）；A、B組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.2 再生胃黏膜厚度和擴張腺體數檢測
HE染色示，C組潰瘍邊緣胃黏膜較A、B組厚，擴張的腺體較少，黏膜結構較規則。見圖 1。A、B、C組再生胃黏膜厚度分別為（210.88±28.51）、（225.63±32.41）、（273.38±35.04）μm，C組顯著厚于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.01）；A、B組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。A、B、C組擴張腺體數分別為（26.38±7.25）、（24.50±5.21）、（15.13±6.60）個/HP，C組顯著少于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.01）；A、B組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
圖1
各組潰瘍部位組織學觀察（HE×100） ? A組 ? B組 ? C組 ? ?2.3 VEGF表達檢測
免疫組織化學染色示，C組潰瘍邊緣胃黏膜VEGF陽性表達顯著多于A、B組。見圖 2。A、B、C組VEGF表達IA值分別為11.21±4.31、13.46±3.03、19.66±5.25，C組顯著高于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.01）；A、B組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
3 討論
干細胞具有自我更新和多向分化潛能，是組織損傷后進行再生修復的基礎，分為胚胎干細胞和成體干細胞。BMSCs是中胚層來源的成體干細胞，并保持分化成結締組織譜系和其他胚層細胞的能力[7]，具有取材方便、來源充足[8]、低免疫原性[9]、允許同種異體移植[10]等優點。目前有3種移植方式：靜脈注射、動脈注射和立體定位直接注射[11]，現多采用直接注射方式進行移植[12]。BMSCs已在治療心血管疾病、急性肺損傷、免疫性疾病、皮膚再生、骨損傷和血液系統疾病等方面的臨床研究中取得了較好效果[13]，是組織工程和再生醫學領域重要的種子細胞[14]，具有廣泛的臨床應用前景[15]。消化性胃潰瘍是一種常見病、多發病，具有自限性，在無攻擊因子存在時，機體會動員自身的防衛功能經過一段時間使潰瘍自然愈合；抗潰瘍藥雖能加速潰瘍愈合，但愈合的黏膜組織結構也與正常胃黏膜有很大差異，即潰瘍愈合質量低下，形態學表現為再生黏膜厚度降低、腺體擴張等，這導致了胃黏膜的防御功能降低，潰瘍容易復發[16]。
本研究在造模后第3天于潰瘍周圍注入BM SCs，第10天檢測發現C組潰瘍面積小于A、B組（P＜0.01），而A、B組比較差異無統計學意義（P＞0.05），表明BMSCs移植于潰瘍周圍能夠加速潰瘍愈合。組織學觀察示，C組潰瘍邊緣再生的胃黏膜較A、B組厚，擴張的腺體較少，黏膜結構亦較規則；且定量分析顯示，C組再生黏膜厚度高于A、B組（P＜0.01），而A、B組比較差異無統計學意義（P＞0.05），表明BMSCs能夠提高潰瘍愈合質量。BMSCs移植于潰瘍周圍后，能夠分化成胃間質細胞，以進行潰瘍修復[2-3]，我們認為這可能是提高潰瘍愈合質量的機制之一。生長因子在修復損傷組織中起到了非常重要的作用，外源性BMSCs在修復損傷組織時能夠產生EGF、VEGF等[17]，還能增加胃黏膜VEGF受體的表達[18]，改善胃黏膜微循環，促進胃黏膜再生[19]。VEGF是血管內皮細胞特異性的生長因子[20]，能夠誘導血管發生[21]。本研究免疫組織化學染色示，C組VEGF表達多于A、B組，C組VEGF的IA值高于A、B組（P＜0.01），而A、B組比較差異無統計學意義（P＞0.05），這可能是由于移植的BMSCs分泌VEGF而使黏膜VEGF增多，進而促進血管生成，改善胃黏膜微循環，促進胃黏膜再生，加速潰瘍愈合。
綜上述，局部移植BMSCs于潰瘍周圍，能夠加速潰瘍愈合，其機制可能是移植的BMSCs分泌VEGF和分化為胃間質細胞，修復重建了胃黏膜組織，提高了潰瘍愈合質量。本實驗直接將干細胞注入潰瘍邊緣，雖然能控制注入干細胞的數量，但大鼠需二次手術是其不足。另外，還需進一步研究干細胞在潰瘍周圍環境下表達VEGF的機制。
