引用本文： 肖原, 張杰, 陸燕蓉, 員海超, 柏琳, 蔣霞, 程驚秋. 聚氨酯-脫細胞基質復合支架的制備及體內外生物相容性研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(8): 1016-1021. doi: 10.7507/1002-1892.20150217 復制
膀胱癌、結核性攣縮膀胱、先天性膀胱缺失、創傷及炎癥等，均會引起膀胱組織損傷及功能缺失，用組織工程方法研究開發膀胱組織替代物，以恢復、維持或改善其功能，是治療膀胱組織損傷和功能缺失的一個新思路[1-2]。理想的組織工程材料應具有與正常膀胱組織相適應的機械性能、良好的生物相容性、較低的免疫原性，且支持多類細胞的黏附和增殖[3]。近年來，基于聚乙醇酸、聚乳酸和聚己內酯[4-5]的生物可降解材料由于具有良好的生物相容性、可塑性和可降解性，被應用于膀胱修復與重建研究。然而，這些人工合成材料存在無生物活性、表面親水性及細胞黏附性差，易引起無菌炎性反應的缺點。
脫細胞基質（acellular matrix，ACM）是一種具有良好醫用前景的生物材料，已有文獻報道用膀胱ACM（bladder ACM，BACM）作為泌尿系統組織工程重建材料[6-7]。但BACM缺乏組織應有的彈性[8]，導致其在膀胱修復與重建中的應用受到一定限制。聚氨酯（polyurethane，PU）是一種具有良好生物相容性和力學性能的可降解高分子材料[9]。我們在前期工作中已制備了力學性能優異的可降解PU，并對其本體結構進行了研究，利用其制備的三維多孔支架可較好地支持靜脈血管內皮細胞的黏附和增殖[10-12]。
將高分子可降解聚合物作為涂層復合到ACM中，是組織工程復合支架研究的一種方法，尤其是在對支架力學性能要求較高的領域（如血管），已有部分相關研究[13]。本研究中，我們將PU與BACM復合，構建新型PU-BACM復合支架，并對其力學性能、體內外生物相容性以及體內膀胱修復性能進行了評價，以期獲得一種有望應用于膀胱修復的復合支架。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
雄性新西蘭大白兔22只，體重3～4 kg，由四川大學華西醫院動物實驗中心提供。
人膀胱平滑肌細胞（human bladder smooth muscle cells，HBSMC）、小鼠胚胎成纖維細胞NIH-3T3（ATCC細胞庫，美國）；濾膜（Millipore公司，德國）；DMEM培養基、FBS（GIBCO公司，美國）。共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）；IX71熒光倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標儀（Biotek公司，美國）；超凈工作臺（NUAIRE公司，美國）；FC500流式細胞儀（Beckman公司，美國）；力學試驗儀（Instron公司，美國）。
1.2 支架材料制備及檢測
1.2.1 支架材料制備
① PU乳液為前期實驗制備[10]，采用冷凍干燥法制成相應大小及形狀備用。② BACM采用去污劑洗滌法制備[14]：取10只新西蘭大白兔，采用空氣栓塞法處死，取出膀胱組織，修剪成2 cm×2 cm的小片，在PBS中磁力攪拌清洗2 h后放入1%SDS液中，磁力攪拌24 h；然后放入1%Triton X-100液中磁力攪拌24 h，最后經PBS清洗后冷凍干燥，保存備用。③ PU-BACM復合支架制備：將BACM緩慢浸沒于PU乳液中，1 s后取出，置入鼓風干燥箱中40℃烘干；干燥后的支架冷卻至室溫后再次緩慢浸沒于PU乳液中，1 s后取出烘干；重復上述過程至得到具有PU涂覆層（約8 μm厚）的BACM。所有材料采用環氧乙烷滅菌，進行后期生物學實驗前在無菌PBS中浸泡24 h。
1.2.2 支架材料檢測
① BACM組織學觀察：取制備的BACM，經石蠟包埋、切片后，常規行HE染色觀察脫細胞情況。② PU-BACM熒光染色觀察：取制備的PU-BACM，經冰凍包埋、切片后，吖啶橙染色，于熒光倒置相差顯微鏡下觀察。③ 支架材料力學性能測試：將BACM支架和PU-BACM復合支架沿纖維方向剪切成大小一致的啞鈴狀，在力學試驗儀上沿材料纖維方向加載應力，加載速度為10 mm/min，測定材料拉伸強度及斷裂伸長率，繪制應力-應變曲線[6]。
1.3 材料體外生物相容性評價
1.3.1 NIH-3T3與PU共培養后細胞形態觀察
用1640培養基重懸NIH-3T3至1×106個/mL濃度，將PU置于24孔板中，每孔滴加100 μL細胞懸液，37℃培養1 h后，向每孔補充900 μL DMEM培養基。培養1、7 d后經多聚甲醛固定，加入50 μL鬼筆環肽及50 μL DAPI染色，共聚焦顯微鏡觀察細胞形態。
1.3.2 細胞計數試劑盒8（cell
counting kit 8，CCK-8）法測定細胞增殖 用DMEM培養基將HBSMC重懸至5×105個/mL濃度，將直徑略小于孔徑的圓形PU、BACM、PU-BACM材料（厚度約2 mm）分別置于96孔板中，每孔滴加10 μL細胞懸液，37℃培養1 h后，向每孔補充90 μL DMEM培養基。另設2個空白孔，分別于1、3、5、7 d后向每孔加入10 μL CCK-8試劑，避光孵育4 h后，轉移液體至96孔板中，450 nm波長下測定其吸光度（A）值[14]。
1.3.3 流式細胞術檢測細胞周期
① 材料浸提液制備：稱取PU、BACM、PU-BACM材料各2 g，經環氧乙烷滅菌后于PBS中浸泡48 h；棄去PBS，加入40 mL含10%FBS的DMEM培養基，4℃條件下浸提24 h，吸取液體，經0.4 μm濾膜過濾后儲存備用。② 流式細胞術檢測：將3×105個HBSMC接種于T25培養瓶中，用6 mL含10%FBS的DMEM培養基37℃正常培養24 h后，棄去2 mL培養基，分別加入2 mL PU、BACM、PU-BACM材料浸提液，對照組加入等量DMEM培養基，繼續培養24 h后，胰蛋白酶消化收集細胞，經PBS清洗后加入1 mL預冷70%乙醇，吹打均勻。4℃固定48 h后，加入PBS，吹打離心洗去乙醇。用100 μL含碘化啶（100 μg/mL）和RNaseA（200 μg/mL）的PBS溶液37℃染色30 min，再次經PBS清洗后用300 μL PBS重懸，通過流式細胞術測定細胞周期，采用Modfit分析軟件對數據進行分析，按以下公式計算細胞增殖指數（proliferation index，PI）： （S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%。
1.4 動物膀胱修復實驗
取12只新西蘭大白兔，術前12 h開始禁食、水。采用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）行耳緣靜脈麻醉，下腹部去毛，消毒后打開腹腔，抽空膀胱內尿液，選擇膀胱表面血管較少的部位，剪開一長5 mm的小口，用4-0線將大小為8 mm×8 mm×2 mm的PU-BACM復合支架用鎖邊法縫合于膀胱損傷部位，關腹。術后3 d內肌肉注射青霉素100萬U，每天1次。術后每天觀察動物一般情況，并分別于10、20、40、60 d采用空氣栓塞法各處死3只動物。解剖觀察膀胱損傷部位修復情況；取植入材料及周邊組織，經中性甲醛固定后行HE染色觀察移植部位炎性反應、上皮再生及材料降解情況。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，各實驗組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 支架材料檢測
2.1.1 組織學及熒光染色觀察
對制備的BACM行HE染色示，支架材料呈疏松網狀結構，未見細胞，大量淺紅色膠原纖維仍保持多孔狀結構，膠原纖維在脫細胞過程中未受損。PU-BACM復合支架熒光染色可見BACM仍保留了其疏松多孔狀結構，PU成功附著于BACM表面，形成致密薄膜層，PU層連續無間斷、致密且厚度較均勻。見圖 1。
圖1
支架材料組織學及熒光染色觀察 ? BACM支架HE染色（×100） ? PU-BACM復合支架熒光染色（熒光倒置相差顯微鏡×100） ? ?2.1.2 力學性能測試
BACM和PU-BACM的應力-應變曲線見圖 2。BACM和PU-BACM的拉伸強度分別為（5.78±0.85）N和（11.88±3.21）N，斷裂伸長率分別為14.46%±3.21%和23.14%±1.32%，差異均有統計學意義（t=3.182，P=0.034；t=4.332，P=0.012），PU-BACM具有更好的力學性能。
2.2 材料體外生物相容性評價
2.2.1 NIH-3T3與PU共培養后細胞形態觀察
共聚焦顯微鏡觀察示，NIH-3T3與PU共培養后1 d，細胞能良好附著于材料表面，并向材料內部生長；7 d后細胞出現大量增殖，細胞呈紡錘狀且立體分布于材料中。見圖 3。
2.2.2 材料對HBSMC增殖的影響
培養各時間點PU組A值均顯著高于BACM組和PU-BACM組，差異有統計學意義（P＜0.05）。培養1、3 d，PU-BACM組A值略高于BACM組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；5、7 d時PU-BACM組A值顯著高于BACM組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 4。
2.2.3 流式細胞術檢測細胞周期
PU-BACM組和BACM組G1期細胞比例顯著高于對照組和PU組，G2期細胞比例顯著低于對照組和PU組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；PU-BACM組和BACM組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。PU-BACM組和BACM組S期細胞比例及PI均低于對照組和PU組，且PU-BACM組高于BACM組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
表1
流式細胞術檢測各組細胞周期（n=3，%，2.3 兔膀胱修復實驗
術后所有新西蘭大白兔均存活，無萎靡情況且排尿正常。各時間點處死動物后，可見膀胱均有完整結構，手術部位吻合良好，無漏尿。術后10 d，移植部位新生組織與正常組織界限明顯，伴有輕微紅腫現象，肉眼可觀測到材料；20 d，移植部位顏色與正常組織趨于一致，紅腫現象基本消失，材料基本降解；40 d，材料完全降解；60 d，移植部位形成與正常組織類似結構，修復基本完成。見圖 5。
HE染色示，術后10 d移植部位出現單核炎性細胞浸潤情況；20 d，炎性反應逐漸減弱，同時可見移植部位支架基本降解，有大量新生組織形成；40 d可見明顯上皮再生，新生組織排列逐漸趨于規則，支架完全降解；60 d時修復基本完成。見圖 6。
3 討論
膀胱修復與重建仍是當今醫學上亟待解決的難題。近年來隨著組織工程的發展，一些人工合成材料或天然材料被應用于膀胱修復與重建研究中，并取得一定成果[15-16]，其中BACM因富含膠原、彈性蛋白、平滑肌結構和血管框架而在組織修復研究中受到廣泛關注。一些研究中將不同的高分子聚合物作為涂層與BACM進行復合[14-15]，構建出適用于不同類型組織修復的復合支架。由于膀胱要求支架具有較強的力學性能，而經過脫細胞處理后的BACM力學強度和彈性有所下降，因此本研究中我們將PU與其進行復合，并研究復合支架在力學及生物性能上的改變。
PU是一種生物相容性良好的彈性體材料，通過對其分子結構的設計，可調控其親水性、力學強度及彈性性能[17]。在前期研究中，我們設計并合成了力學性能良好的可降解PU，并在本研究中將其與NIH-3T3細胞共培養以檢測其對細胞生長和形貌的影響。共聚焦顯微鏡觀察示，共培養1 d后NIH-3T3能在含有相互貫通的網狀結構的PU多孔支架上正常黏附生長；培養7 d后NIH-3T3大量增殖，并能在PU多孔支架中形成立體狀多細胞層，細胞呈紡錘狀，形態正常。表明制備的PU具有良好的細胞相容性，可支持細胞的黏附和增殖。
本研究采用去污劑法制備BACM，HE染色結果提示所得BACM無細胞殘存，呈疏松網狀的多孔結構，與當前研究中廣泛應用的BACM結構相符[13]。在BACM與PU的復合過程中，以BACM作為主體，采用表面涂覆法，將PU乳液以涂層形式涂覆在BACM表面，形成致密的薄膜層。熒光倒置相差顯微鏡觀察可見PU與BACM緊密結合，致密且連續的PU層在兔膀胱修復實驗中避免尿液從BACM疏松多孔結構中滲漏。
對BACM與PU-BACM復合支架的力學性能測試顯示，PU-BACM復合支架拉伸強度與斷裂伸長率分別約為BACM的2.06倍和1.60倍，表明PU-BACM復合支架比BACM具有更好的強度與彈性。劉國鋒等[13]曾采用纖維蛋白膠與BACM復合以提高BACM支架的力學性能，所得復合支架材料的力學順應性有所提高，但其拉伸強度與斷裂伸長率較BACM并無顯著性差異。因此，本研究中選用可降解PU彈性體與BACM制備復合支架大大提高了支架的拉伸強度和彈性，與膀胱具有較強擴張伸縮功能的特性相適應，為支架材料植入后膀胱正常行使功能提供了保障。
細胞增殖是評價支架材料生物相容性的重要依據。CCK-8法檢測顯示HBSMC在與PU-BACM復合支架共培養1、3 d時的細胞增殖略高于BACM，但無顯著性差異；而在5、7 d時，PU-BACM復合支架組細胞增殖高于BACM組且差異有統計學意義。可能原因為PU-BACM復合支架表面的PU薄膜具有比BACM更強的親水性，從而提高了細胞黏附率，更有利于細胞增殖；但由于接種細胞量較小，因此培養前期兩組差異不明顯，至共培養5、7 d時才出現顯著性差異。
細胞周期檢測實驗是細胞增殖實驗的重要補充，通過分析處于各時期的細胞比例，可以更精確地反映細胞活性，從而比較支架的細胞相容性。本研究細胞周期結果顯示，與支架浸提液共培養24 h后，PU-BACM組PI及S期細胞比例均顯著高于BACM組，說明PU-BACM復合支架更利于細胞生長，更能促進細胞增殖。
對復合支架的力學性能測試和體外生物學評價均表明，PU-BACM復合支架比BACM具有更好的力學性能和體外細胞相容性，且其表面致密PU薄膜能防止尿液的滲漏。為了進一步探明PU-BACM應用于膀胱修復的可行性，我們選取新西蘭大白兔建立膀胱損傷模型進行膀胱修復實驗。在膀胱作切口以建立膀胱損傷模型，并利用PU-BACM復合支架對膀胱進行修復。術后所有實驗動物生存狀況良好，能正常進食與排尿，表明PU-BACM復合支架移植至實驗動物體內后可維持膀胱的正常功能。解剖后對膀胱大體觀察可見，所有動物膀胱手術部位吻合良好，無漏尿。術后10 d移植部位有輕微紅腫情況，20 d紅腫基本消失；HE染色示術后10 d移植部位有炎性細胞聚集，20 d僅有少量炎性細胞殘留，與大體觀察結果一致。與王振顯等[18]采用脫細胞羊膜進行膀胱修復研究相比，本研究所用PU-BACM復合支架所導致的炎性反應更弱且持續時間更短。HE染色示術后40 d移植部位可見上皮再生，材料降解完全，術后60 d時移植部位新生上皮成形。
綜上述，本研究為高分子材料與BACM復合支架的制備提供了一種較好方法，所構建的PU-BACM復合支架較BACM在力學強度及彈性方面有明顯改善，更能適應膀胱的擴張伸縮功能。PU-BACM復合支架可比BACM更好地支持細胞黏附及增殖，有利于支架材料植入體內后的細胞化。在膀胱修復模型中，PU-BACM復合支架起到了應有的支撐作用，且未導致強烈的免疫反應，為膀胱修復的順利進行提供了保障，可用于進一步的膀胱修復研究。
膀胱癌、結核性攣縮膀胱、先天性膀胱缺失、創傷及炎癥等，均會引起膀胱組織損傷及功能缺失，用組織工程方法研究開發膀胱組織替代物，以恢復、維持或改善其功能，是治療膀胱組織損傷和功能缺失的一個新思路[1-2]。理想的組織工程材料應具有與正常膀胱組織相適應的機械性能、良好的生物相容性、較低的免疫原性，且支持多類細胞的黏附和增殖[3]。近年來，基于聚乙醇酸、聚乳酸和聚己內酯[4-5]的生物可降解材料由于具有良好的生物相容性、可塑性和可降解性，被應用于膀胱修復與重建研究。然而，這些人工合成材料存在無生物活性、表面親水性及細胞黏附性差，易引起無菌炎性反應的缺點。
脫細胞基質（acellular matrix，ACM）是一種具有良好醫用前景的生物材料，已有文獻報道用膀胱ACM（bladder ACM，BACM）作為泌尿系統組織工程重建材料[6-7]。但BACM缺乏組織應有的彈性[8]，導致其在膀胱修復與重建中的應用受到一定限制。聚氨酯（polyurethane，PU）是一種具有良好生物相容性和力學性能的可降解高分子材料[9]。我們在前期工作中已制備了力學性能優異的可降解PU，并對其本體結構進行了研究，利用其制備的三維多孔支架可較好地支持靜脈血管內皮細胞的黏附和增殖[10-12]。
將高分子可降解聚合物作為涂層復合到ACM中，是組織工程復合支架研究的一種方法，尤其是在對支架力學性能要求較高的領域（如血管），已有部分相關研究[13]。本研究中，我們將PU與BACM復合，構建新型PU-BACM復合支架，并對其力學性能、體內外生物相容性以及體內膀胱修復性能進行了評價，以期獲得一種有望應用于膀胱修復的復合支架。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
雄性新西蘭大白兔22只，體重3～4 kg，由四川大學華西醫院動物實驗中心提供。
人膀胱平滑肌細胞（human bladder smooth muscle cells，HBSMC）、小鼠胚胎成纖維細胞NIH-3T3（ATCC細胞庫，美國）；濾膜（Millipore公司，德國）；DMEM培養基、FBS（GIBCO公司，美國）。共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）；IX71熒光倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標儀（Biotek公司，美國）；超凈工作臺（NUAIRE公司，美國）；FC500流式細胞儀（Beckman公司，美國）；力學試驗儀（Instron公司，美國）。
1.2 支架材料制備及檢測
1.2.1 支架材料制備
① PU乳液為前期實驗制備[10]，采用冷凍干燥法制成相應大小及形狀備用。② BACM采用去污劑洗滌法制備[14]：取10只新西蘭大白兔，采用空氣栓塞法處死，取出膀胱組織，修剪成2 cm×2 cm的小片，在PBS中磁力攪拌清洗2 h后放入1%SDS液中，磁力攪拌24 h；然后放入1%Triton X-100液中磁力攪拌24 h，最后經PBS清洗后冷凍干燥，保存備用。③ PU-BACM復合支架制備：將BACM緩慢浸沒于PU乳液中，1 s后取出，置入鼓風干燥箱中40℃烘干；干燥后的支架冷卻至室溫后再次緩慢浸沒于PU乳液中，1 s后取出烘干；重復上述過程至得到具有PU涂覆層（約8 μm厚）的BACM。所有材料采用環氧乙烷滅菌，進行后期生物學實驗前在無菌PBS中浸泡24 h。
1.2.2 支架材料檢測
① BACM組織學觀察：取制備的BACM，經石蠟包埋、切片后，常規行HE染色觀察脫細胞情況。② PU-BACM熒光染色觀察：取制備的PU-BACM，經冰凍包埋、切片后，吖啶橙染色，于熒光倒置相差顯微鏡下觀察。③ 支架材料力學性能測試：將BACM支架和PU-BACM復合支架沿纖維方向剪切成大小一致的啞鈴狀，在力學試驗儀上沿材料纖維方向加載應力，加載速度為10 mm/min，測定材料拉伸強度及斷裂伸長率，繪制應力-應變曲線[6]。
1.3 材料體外生物相容性評價
1.3.1 NIH-3T3與PU共培養后細胞形態觀察
用1640培養基重懸NIH-3T3至1×106個/mL濃度，將PU置于24孔板中，每孔滴加100 μL細胞懸液，37℃培養1 h后，向每孔補充900 μL DMEM培養基。培養1、7 d后經多聚甲醛固定，加入50 μL鬼筆環肽及50 μL DAPI染色，共聚焦顯微鏡觀察細胞形態。
1.3.2 細胞計數試劑盒8（cell
counting kit 8，CCK-8）法測定細胞增殖 用DMEM培養基將HBSMC重懸至5×105個/mL濃度，將直徑略小于孔徑的圓形PU、BACM、PU-BACM材料（厚度約2 mm）分別置于96孔板中，每孔滴加10 μL細胞懸液，37℃培養1 h后，向每孔補充90 μL DMEM培養基。另設2個空白孔，分別于1、3、5、7 d后向每孔加入10 μL CCK-8試劑，避光孵育4 h后，轉移液體至96孔板中，450 nm波長下測定其吸光度（A）值[14]。
1.3.3 流式細胞術檢測細胞周期
① 材料浸提液制備：稱取PU、BACM、PU-BACM材料各2 g，經環氧乙烷滅菌后于PBS中浸泡48 h；棄去PBS，加入40 mL含10%FBS的DMEM培養基，4℃條件下浸提24 h，吸取液體，經0.4 μm濾膜過濾后儲存備用。② 流式細胞術檢測：將3×105個HBSMC接種于T25培養瓶中，用6 mL含10%FBS的DMEM培養基37℃正常培養24 h后，棄去2 mL培養基，分別加入2 mL PU、BACM、PU-BACM材料浸提液，對照組加入等量DMEM培養基，繼續培養24 h后，胰蛋白酶消化收集細胞，經PBS清洗后加入1 mL預冷70%乙醇，吹打均勻。4℃固定48 h后，加入PBS，吹打離心洗去乙醇。用100 μL含碘化啶（100 μg/mL）和RNaseA（200 μg/mL）的PBS溶液37℃染色30 min，再次經PBS清洗后用300 μL PBS重懸，通過流式細胞術測定細胞周期，采用Modfit分析軟件對數據進行分析，按以下公式計算細胞增殖指數（proliferation index，PI）： （S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%。
1.4 動物膀胱修復實驗
取12只新西蘭大白兔，術前12 h開始禁食、水。采用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）行耳緣靜脈麻醉，下腹部去毛，消毒后打開腹腔，抽空膀胱內尿液，選擇膀胱表面血管較少的部位，剪開一長5 mm的小口，用4-0線將大小為8 mm×8 mm×2 mm的PU-BACM復合支架用鎖邊法縫合于膀胱損傷部位，關腹。術后3 d內肌肉注射青霉素100萬U，每天1次。術后每天觀察動物一般情況，并分別于10、20、40、60 d采用空氣栓塞法各處死3只動物。解剖觀察膀胱損傷部位修復情況；取植入材料及周邊組織，經中性甲醛固定后行HE染色觀察移植部位炎性反應、上皮再生及材料降解情況。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，各實驗組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 支架材料檢測
2.1.1 組織學及熒光染色觀察
對制備的BACM行HE染色示，支架材料呈疏松網狀結構，未見細胞，大量淺紅色膠原纖維仍保持多孔狀結構，膠原纖維在脫細胞過程中未受損。PU-BACM復合支架熒光染色可見BACM仍保留了其疏松多孔狀結構，PU成功附著于BACM表面，形成致密薄膜層，PU層連續無間斷、致密且厚度較均勻。見圖 1。
圖1
支架材料組織學及熒光染色觀察 ? BACM支架HE染色（×100） ? PU-BACM復合支架熒光染色（熒光倒置相差顯微鏡×100） ? ?2.1.2 力學性能測試
BACM和PU-BACM的應力-應變曲線見圖 2。BACM和PU-BACM的拉伸強度分別為（5.78±0.85）N和（11.88±3.21）N，斷裂伸長率分別為14.46%±3.21%和23.14%±1.32%，差異均有統計學意義（t=3.182，P=0.034；t=4.332，P=0.012），PU-BACM具有更好的力學性能。
2.2 材料體外生物相容性評價
2.2.1 NIH-3T3與PU共培養后細胞形態觀察
共聚焦顯微鏡觀察示，NIH-3T3與PU共培養后1 d，細胞能良好附著于材料表面，并向材料內部生長；7 d后細胞出現大量增殖，細胞呈紡錘狀且立體分布于材料中。見圖 3。
2.2.2 材料對HBSMC增殖的影響
培養各時間點PU組A值均顯著高于BACM組和PU-BACM組，差異有統計學意義（P＜0.05）。培養1、3 d，PU-BACM組A值略高于BACM組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；5、7 d時PU-BACM組A值顯著高于BACM組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 4。
2.2.3 流式細胞術檢測細胞周期
PU-BACM組和BACM組G1期細胞比例顯著高于對照組和PU組，G2期細胞比例顯著低于對照組和PU組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；PU-BACM組和BACM組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。PU-BACM組和BACM組S期細胞比例及PI均低于對照組和PU組，且PU-BACM組高于BACM組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
表1
流式細胞術檢測各組細胞周期（n=3，%，2.3 兔膀胱修復實驗
術后所有新西蘭大白兔均存活，無萎靡情況且排尿正常。各時間點處死動物后，可見膀胱均有完整結構，手術部位吻合良好，無漏尿。術后10 d，移植部位新生組織與正常組織界限明顯，伴有輕微紅腫現象，肉眼可觀測到材料；20 d，移植部位顏色與正常組織趨于一致，紅腫現象基本消失，材料基本降解；40 d，材料完全降解；60 d，移植部位形成與正常組織類似結構，修復基本完成。見圖 5。
HE染色示，術后10 d移植部位出現單核炎性細胞浸潤情況；20 d，炎性反應逐漸減弱，同時可見移植部位支架基本降解，有大量新生組織形成；40 d可見明顯上皮再生，新生組織排列逐漸趨于規則，支架完全降解；60 d時修復基本完成。見圖 6。
3 討論
膀胱修復與重建仍是當今醫學上亟待解決的難題。近年來隨著組織工程的發展，一些人工合成材料或天然材料被應用于膀胱修復與重建研究中，并取得一定成果[15-16]，其中BACM因富含膠原、彈性蛋白、平滑肌結構和血管框架而在組織修復研究中受到廣泛關注。一些研究中將不同的高分子聚合物作為涂層與BACM進行復合[14-15]，構建出適用于不同類型組織修復的復合支架。由于膀胱要求支架具有較強的力學性能，而經過脫細胞處理后的BACM力學強度和彈性有所下降，因此本研究中我們將PU與其進行復合，并研究復合支架在力學及生物性能上的改變。
PU是一種生物相容性良好的彈性體材料，通過對其分子結構的設計，可調控其親水性、力學強度及彈性性能[17]。在前期研究中，我們設計并合成了力學性能良好的可降解PU，并在本研究中將其與NIH-3T3細胞共培養以檢測其對細胞生長和形貌的影響。共聚焦顯微鏡觀察示，共培養1 d后NIH-3T3能在含有相互貫通的網狀結構的PU多孔支架上正常黏附生長；培養7 d后NIH-3T3大量增殖，并能在PU多孔支架中形成立體狀多細胞層，細胞呈紡錘狀，形態正常。表明制備的PU具有良好的細胞相容性，可支持細胞的黏附和增殖。
本研究采用去污劑法制備BACM，HE染色結果提示所得BACM無細胞殘存，呈疏松網狀的多孔結構，與當前研究中廣泛應用的BACM結構相符[13]。在BACM與PU的復合過程中，以BACM作為主體，采用表面涂覆法，將PU乳液以涂層形式涂覆在BACM表面，形成致密的薄膜層。熒光倒置相差顯微鏡觀察可見PU與BACM緊密結合，致密且連續的PU層在兔膀胱修復實驗中避免尿液從BACM疏松多孔結構中滲漏。
對BACM與PU-BACM復合支架的力學性能測試顯示，PU-BACM復合支架拉伸強度與斷裂伸長率分別約為BACM的2.06倍和1.60倍，表明PU-BACM復合支架比BACM具有更好的強度與彈性。劉國鋒等[13]曾采用纖維蛋白膠與BACM復合以提高BACM支架的力學性能，所得復合支架材料的力學順應性有所提高，但其拉伸強度與斷裂伸長率較BACM并無顯著性差異。因此，本研究中選用可降解PU彈性體與BACM制備復合支架大大提高了支架的拉伸強度和彈性，與膀胱具有較強擴張伸縮功能的特性相適應，為支架材料植入后膀胱正常行使功能提供了保障。
細胞增殖是評價支架材料生物相容性的重要依據。CCK-8法檢測顯示HBSMC在與PU-BACM復合支架共培養1、3 d時的細胞增殖略高于BACM，但無顯著性差異；而在5、7 d時，PU-BACM復合支架組細胞增殖高于BACM組且差異有統計學意義。可能原因為PU-BACM復合支架表面的PU薄膜具有比BACM更強的親水性，從而提高了細胞黏附率，更有利于細胞增殖；但由于接種細胞量較小，因此培養前期兩組差異不明顯，至共培養5、7 d時才出現顯著性差異。
細胞周期檢測實驗是細胞增殖實驗的重要補充，通過分析處于各時期的細胞比例，可以更精確地反映細胞活性，從而比較支架的細胞相容性。本研究細胞周期結果顯示，與支架浸提液共培養24 h后，PU-BACM組PI及S期細胞比例均顯著高于BACM組，說明PU-BACM復合支架更利于細胞生長，更能促進細胞增殖。
對復合支架的力學性能測試和體外生物學評價均表明，PU-BACM復合支架比BACM具有更好的力學性能和體外細胞相容性，且其表面致密PU薄膜能防止尿液的滲漏。為了進一步探明PU-BACM應用于膀胱修復的可行性，我們選取新西蘭大白兔建立膀胱損傷模型進行膀胱修復實驗。在膀胱作切口以建立膀胱損傷模型，并利用PU-BACM復合支架對膀胱進行修復。術后所有實驗動物生存狀況良好，能正常進食與排尿，表明PU-BACM復合支架移植至實驗動物體內后可維持膀胱的正常功能。解剖后對膀胱大體觀察可見，所有動物膀胱手術部位吻合良好，無漏尿。術后10 d移植部位有輕微紅腫情況，20 d紅腫基本消失；HE染色示術后10 d移植部位有炎性細胞聚集，20 d僅有少量炎性細胞殘留，與大體觀察結果一致。與王振顯等[18]采用脫細胞羊膜進行膀胱修復研究相比，本研究所用PU-BACM復合支架所導致的炎性反應更弱且持續時間更短。HE染色示術后40 d移植部位可見上皮再生，材料降解完全，術后60 d時移植部位新生上皮成形。
綜上述，本研究為高分子材料與BACM復合支架的制備提供了一種較好方法，所構建的PU-BACM復合支架較BACM在力學強度及彈性方面有明顯改善，更能適應膀胱的擴張伸縮功能。PU-BACM復合支架可比BACM更好地支持細胞黏附及增殖，有利于支架材料植入體內后的細胞化。在膀胱修復模型中，PU-BACM復合支架起到了應有的支撐作用，且未導致強烈的免疫反應，為膀胱修復的順利進行提供了保障，可用于進一步的膀胱修復研究。
