引用本文： 孫正宇, 李箭. 組織工程韌帶的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(9): 1160-1166. doi: 10.7507/1002-1892.20150251 復制
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是一種致密結締組織，主要維持膝關節活動度和穩定性。它是膝關節常見損傷結構，多為撕裂或斷裂，在年輕人群中發病率較高。由于ACL血供較少，一旦損傷很難自行修復[1]。目前國內外主要采用關節鏡下重建ACL，用于重建的移植物主要有自體肌腱、同種異體移植物、人工韌帶等，但術后存在肌力下降、關節僵硬、移植物再斷裂、供區并發癥等問題[2]。組織工程韌帶以材料學和生物化學為基礎，旨在通過細胞治療方法促進ACL的再生修復，使新生韌帶組織達到與原ACL相似的機械強度與生化特性，為治療ACL損傷帶來了希望[3-4]。現廣泛查閱近年來有關組織工程韌帶構建及其修復ACL損傷的文獻，對相關的種子細胞、支架材料、生長因子及力學刺激的研究進展作一綜述。
1 種子細胞
ACL主要由膠原纖維組成（約占94%），其中以Ⅰ型膠原為主；余6%由細胞和基質蛋白組成，基質蛋白主要為彈性蛋白（＜5%）和糖蛋白（＜1%）[5]。目前用于構建組織工程韌帶的種子細胞主要為各種韌帶及肌腱來源的成纖維細胞和不同組織來源的MSCs[6]。前者主要來源于ACL、內側副韌帶（medial collateral ligament，MCL）、髕腱及跟腱等組織，其中ACL成纖維細胞（ACL fibroblast cells，ACLFs）在自我增殖、膠原及基質蛋白表達方面明顯優于其他組織來源的成纖維細胞[7]，因此成為組織工程韌帶最重要的種子細胞。在此基礎上，有學者分別用完整的和斷裂的ACL提取成纖維細胞，并將細胞種植在支架材料上進行體外培養，他們發現這兩種來源的細胞在外觀形態、新生韌帶結構以及合成肌動蛋白及整合素方面均無差異，提示將來可利用自身斷裂的ACL作為種子細胞來源[8]。進一步研究還發現，ACLFs在凝膠中移行快且表型穩定，使其在細胞學特性方面較其他部位細胞更適合作為組織工程韌帶種子細胞[9]。
另一種重要的種子細胞是MSCs，其具有增殖能力強、免疫調節、定向歸巢等優點[10]，以及成骨、成脂、成軟骨、成韌帶等多向分化潛能[11]。目前組織工程韌帶相關研究中應用最廣泛的是BMSCs。有研究證實，BMSCs能在體內韌帶損傷處大量增殖，并定向分化為韌帶樣細胞，促進韌帶組織血管化，刺激韌帶中的ACLFs向損傷部位移動，減少韌帶損傷處的細胞凋亡，促進損傷處瘢痕組織形成，使損傷韌帶修復再生[12]。多項研究已表明，韌帶組織中同樣富含MSCs和祖細胞群，而祖細胞群也具有自我更新和多向分化潛能，當韌帶損傷時，這些細胞能被積極動員并遷移至損傷部位進行自我修復，這也打破了損傷韌帶無法自行修復愈合的傳統觀念，為韌帶的修復再生提供了新思路[13-14]。
然而，雖然ACL中含有MSCs，但數量極少，修復作用有限；ACLFs屬于終末分化成熟細胞，其來源有限、增殖能力差、體外培養擴增困難、生物活性較低，無法修復損傷韌帶[15]。另一方面，BMSCs在骨髓中含量極低（約0.001%），在體外擴增時隨著傳代次數增加，其增殖能力和分化潛能均會下降，甚至出現細胞老化或轉化，逐漸失去其“干性”特點[16]。為解決一種種子細胞無法滿足組織工程韌帶構建需要的問題，有學者將MSCs和韌帶細胞或腱細胞進行共培養，成功表達了更多的膠原及腱糖蛋白。Luo等[17]通過將大鼠BMSCs和跟腱細胞進行共培養，發現與單純BMSCs對照組相比，在同一時期內共培養組細胞增殖量、增殖相關基因c-fos和肌腱相關基因的表達均明顯上升，表明跟腱細胞能促進BMSCs向肌腱分化，并刺激BMSCs增殖和相關肌腱基因的表達。在直接共培養系統中，不同種類的肌腱韌帶細胞會對MSCs的增殖、分化方向以及共培養效果起到關鍵作用，MSCs會按照與之直接接觸的肌腱韌帶細胞方向分化，并產生相應產物[18-19]。Proffen等[20]通過將ACLFs與髕下脂肪墊及外周血源性MSCs進行共培養，發現髕下脂肪墊來源的MSCs能促進ACLFs增殖及膠原合成，外周血來源的MSCs能動員ACLFs更快遷移至韌帶損傷處，從而促進韌帶修復，說明以上兩種不同來源的MSCs均能加速韌帶組織的修復再生。Canseco等[21]通過構建ACLFs和BMSCs共培養體系發現，當ACLFs/MSCs比值為1∶1時，Ⅰ 型膠原及腱糖蛋白表達量最多，Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原比值也最大，最接近宿主韌帶的組成成分，提示這種細胞比例的共培養方式最適用于構建組織工程韌 帶。
利用ACLFs和MSCs的共培養策略，不僅能將種子細胞負載在支架上植入體內，而且可利用細胞釋放出的趨化因子和細胞因子促進支架內血管形成，促進愈合反應，動員宿主韌帶中的MSCs向支架聚集，從而增強體內韌帶的再生反應。此外，MSCs具有抗炎和免疫調節作用，能夠減輕支架復合物植入體內后引起的免疫反應與炎性反應，從而保護植入物，加強韌帶修復[22]。通過共培養系統可使兩種及以上的種子細胞同時或按照一定順序進行相互作用，一方面ACLFs能為MSCs提供所需的外環境及營養支持，刺激MSCs增殖并向韌帶方向分化；另一方面MSCs能充分發揮抗炎和免疫調節作用，刺激ACLFs以及韌帶內的祖細胞向韌帶缺損處遷移聚集，促進ACLFs生成膠原和基質蛋白[20]。
2 支架材料
良好的支架材料應具有生物相容性好、機械強度高的特點，能為種子細胞的黏附、增殖、遷移和發揮功能提供場所，并能夠生物降解以便新的韌帶組織向內生長，加速ACL的再生修復。用于構建組織工程韌帶的支架材料主要包括生物材料、生物降解聚合物以及復合材料，目前以上支架材料均處于臨床研究階段，其臨床適用性還有待進一步評估[23]。
2.1 生物材料
由于天然ACL中Ⅰ型膠原含量接近90%，受此啟發，既往一些學者將膠原纖維制成支架材料，并通過體內外實驗證明兔ACLFs能夠很好地黏附于膠原支架上，并保持細胞活性，但支架植入體內后附著細胞會逐漸減少，機械強度也逐漸降低，并且6周后即被完全降解吸收[24-25]。隨后有學者開發出一種新的膠原-糖胺聚糖復合支架，它能使支架細胞快速增殖，并表達韌帶成纖維細胞表型，但其機械強度相對較差[26]。為了提高膠原支架的機械性能，許多學者通過特殊處理方式使膠原纖維以交聯式或扭曲編織制成支架，雖然在一定程度上提高了膠原支架的機械強度，但仍無法達到要求標準[27-28]。
蠶絲支架也是一種生物材料，由于生物相容性好，在三維空間構型和抗張強度方面與宿主ACL近似，在體內進行生物降解的同時能保持其原有抗張強度達1年左右，可在較長時間內維持關節穩定性，為新生韌帶的長入提供充裕時間，使新生韌帶組織在膠原纖維排布、血管化等方面與原有韌帶相近[29]。目前研究者發現，用親水性較高的蠶絲衍生物制成的支架能促進細胞更快更好地增殖[30]。鑒于此，Horan等[31]研制出了一種具有親水性的蠶絲纖維支架，該支架材料層次結構復雜，能在生物相容性、可降解性及機械強度方面滿足韌帶再生的要求。Fan等[32]將BMSCs負載到編織好的蠶絲纖維支架上，使BMSCs在支架上大量增殖并分化為韌帶樣成纖維細胞，繼而分泌出膠原纖維和腱糖蛋白；然后將細胞-支架復合物植入豬體內24周后觀察發現，其成功促進了韌帶修復。此外，還有許多生物材料支架可用于構建組織工程韌帶，例如透明質酸[33]、殼聚糖[34]、海藻酸鹽[35] 等。
2.2 生物降解聚合物
目前由于人工合成的生物降解聚合物在機械性能、降解速度以及生物相容性方面得到了極大改善，其在組織工程領域的應用也越來越廣泛。既往有學者將一種編織好的聚二氧六環酮支架植入山羊體內，發現植入后早期支架機械強度即不斷下降[36]。Lu等[37]通過將ACLFs分別負載至聚左旋乳酸（poly L-lactic acid，PLLA）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）以及聚乳酸-聚羥基乙酸（poly-lactide-co-glycolide，PLGA）所制成的支架上，結果發現PLLA支架上的細胞增殖最多，并且機械強度最好。有學者通過對PLLA支架的不同空間構型進行研究后發現，在線形、編織形、扭曲形、編織-扭曲形這4 種空間排布中，編織-扭曲形排布的支架黏彈性最好[38]。近來，靜電紡絲技術被廣泛用于制備支架材料，該技術將聚合物溶液或熔體在強電場中進行噴射紡絲，制造出直徑為幾納米至幾微米的支架纖維，并能調控支架纖維的孔隙率、直徑、強度及排布方式，獲得的支架機械強度顯著高于大多數生物降解聚合物支架。Cardwell等[39]采用該技術研制出了6種直徑排布不同的超細纖維支架，結果顯示纖維直徑較大 （＞2 μm）、排布規則的支架上MSCs增殖最快，沉積在支架上 的 膠原 及基質蛋白最多，他們還發現支架纖 維 直徑對MSCs增殖分化的影響 比 纖維排布更 大。
2.3 復合材料
任何一種單一材料均無法滿足組織工程韌帶在生化特性及力學強度方面的要求，復合材料則綜合了以上材料各自優點，成為當前組織工程韌帶支架材料的研究重點。Panas-Perez等[40]研究出一種膠原-蠶絲復合支架，支架中的蠶絲成分＞25%，其機械強度與正常ACL相當。Chung等[41]將疏水性的聚己內酯（polycaprolactone，PCL）和親水性的PGA-PCL-PGA共聚物組成的混合物制成支架，通過改變二者比例可調節支架的親水性、機械強度和降解速率。Sahoo等[42]用涂有bFGF緩釋劑的超細聚乳酸纖維和脫膠后編織好的微纖維蠶絲支架結合而成的生物復合纖維支架來模擬細胞外基質成分，以此來促進間充質祖細胞的黏附、增殖以及分化為所需的韌帶細胞，提高膠原及基質蛋白表達量，從而增強支架材料的機械強度。
目前支架制備技術還不能完全模擬天然ACL的復雜空間構型，還需進一步實驗研究來解決支架材料植入體內后所面臨的機械強度、降解速率和代謝產物等問題。見表 1。
表1
構建組織工程韌帶常用支架材料
Table1.
Common scaffold materials used in ACL tissue engineering
3 生長因子
盡管生長因子對于損傷韌帶修復的確切信號機制仍不清楚，但目前研究已證實生長因子對于種子細胞的增殖及分化、膠原及基質蛋白的合成、新生韌帶的機械強度和血管化形成都至關重要[43]。
TGF-β有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 3種類型，而BMP也屬于TGF-β家族。TGF-β在細胞的免疫調節、生長、分化、基質蛋白合成、創傷修復等方面作用顯著，對靶細胞作用的效果取決于細胞類型、分化狀態、生長條件以及與其他生長因子相互作用產生的結果，對于ACL的修復再生作用尤為顯著[44]。Wang等[44]研究證明TGF-β1能促進韌帶細胞增殖，并可直接調節或經轉錄因子 NF-κB路徑間接調節基質金屬蛋白酶2的釋放，從而使韌帶細胞快速遷移至韌帶損傷處，促進韌帶修復再生。Xie等[45]利用TGF-β1刺激ACL和MCL編碼出賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX），而LOX能催化膠原蛋白和彈性蛋白的交聯反應，進而促進細胞外基質形成，保持其穩定性，對韌帶的修復作用巨大。Hashimoto等[46]首次將重組人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）注入兔半腱肌肌腱兩端，6周后CT檢查可見肌腱兩端注射部位有2個小骨塊形成；然后切取包含2個骨塊的骨-肌腱-骨移植物用于兔ACL重建，分別于4、8周獲取韌帶標本，通過影像學、組織學、生物力學檢查發現，使用經rhBMP-2處理的移植物重建韌帶后腱-骨愈合牢固，且外觀形態和功能與正常ACL相似，表明rhBMP-2具有成骨作用以及促進腱-骨愈合的功能。Schwarting等[47]利用BMP-7刺激成骨細胞、腱-骨交界區細胞及韌帶成纖維細胞相關基因表達，用以增強這些細胞的成骨作用及成纖維細胞的轉化作用，從而促進腱-骨愈合。Dong等[48]將帶有BMP-2目的基因的慢病毒載體成功轉染至BMSCs內，再將轉染后的BMSCs移植到用于重建兔ACL的腓腸肌腱中，取重建4、8周后的韌帶標本進行生物力學和組織學檢查，提示腱-骨愈合良好，表明BMP-2基因轉染的BMSCs對腱-骨愈合有促進作用。
此外，還有許多生長因子也能促進韌帶修復再生，如IGF[49]、bFGF[50]、生長分化因子（growth differentiation factor，GDF）[51]、VEGF[52]、EGF[53]、PDGF[54]。Kurtz等[49]通過研究發現IGF-1能顯著抑制大鼠損傷跟腱的炎性反應，從而最大程度降低對跟腱功能的損害，加速跟腱愈合，但IGF-1對跟腱的生物力學強度并無明顯改善。bFGF是一種強絲裂原，能促進MSCs的增殖及遷移，并使MSCs在多次傳代后保持自身分化潛能[50]。也有學者將帶有能編碼BMP-12和BMP-13基因的腺病毒載體轉染BMSCs和ACLFs，并成功誘導兩種細胞向韌帶分化，進而分泌形成大量韌帶樣基質蛋白[51]。Wei等[52]用攜帶有TGF-β1和VEGF165基因的重組腺病毒載體轉染ACLFs，通過共同表達TGF-β1和VEGF165基因能快速促使ACLFs遷移、增殖并分泌膠原及纖維蛋白。自體富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）也能促進韌帶再生，其不僅含有大量血小板，還包含韌帶修復再生所需的多種生長因子。盡管多項體內外研究證實PRP具有促進韌帶細胞增殖和分泌膠原及基質蛋白的作用，但也有研究發現單獨使用PRP不能加強韌帶修復，因此PRP的臨床實用性還存在較大爭議[55-57]。目前仍無確鑿證據證明PRP對韌帶再生有直接作用，因此PRP還不能作為韌帶損傷的最佳治療方案。
生長因子對于細胞的作用效果不是一成不變的，常具有時效性，今后需將支架材料與生長因子更好結合起來，通過更完善的生長因子控釋技術，以達到對缺損韌帶更快、更好的修復效果。見表 2。
表2
生長因子在組織工程韌帶中的作用
Table2.
Effects of growth factors on tissue engineered ligament
4 力學刺激
力學刺激和動力負荷是構建組織工程韌帶的關鍵因素，在適當的力學刺激誘導下，新生成的韌帶組織能合成大量膠原纖維和基質蛋白，重塑新生韌帶的內部構型，使其具備足夠的抗張強度。目前相關研究已證明，循環機械張力能夠促使韌帶內的成纖維細胞排布規則有序，誘導其形成紡錘形細胞，因而能夠重塑韌帶的內部結構，提高植入物的機械強度[58]。Altman等[59]研究將張力負荷和扭轉負荷作用于BMSCs，發現即使在缺少生長因子作用的情況下，BMSCs也能不斷增殖并向韌帶方向分化，合成排布有序的膠原纖維和腱糖蛋白。Subramony等[60]將bFGF與機械刺激聯合作用于附著有人MSCs的納米支架上，結果發現與無機械負荷的對照組相比，實驗組能促進人MSCs增殖并向韌帶細胞分化，提高膠原和基質蛋白的產量。
盡管力學刺激能夠促進細胞增殖，提高韌帶相關基因的表達，但其效應與作用細胞的類型、機械刺激的頻率、持續時間、作用方向及強度大小有關[23]。有學者[61]發現在種子細胞接種至支架后早期施加機械張力，會抑制Ⅰ、Ⅱ型膠原的表達；而當MSCs增殖數量達到峰值時再施加力學刺激則會促進膠原表達。Park等[62]發現與4%循環張力組和無力學刺激對照組相比，8%循環張力刺激下的ACLFs增殖更快、合成膠原更多。Kreja等[63]將單向循環的間斷張力作用于負載有ACLFs的聚乳酸支架上，發現ACLFs表達Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維蛋白和腱糖蛋白水平明顯升高，而處于相同條件下的MSCs則無明顯變化。
通常情況下，力學刺激能引起細胞整合素介導的局部黏附和細胞骨架的變形，為了確定組織工程韌帶最佳力學刺激參數，還需進一步研究ACL形成過程中的力學傳導通路[64-65]。當力學刺激作用于支架上的種子細胞時會引起細胞的養分運輸、代謝產物和所需氧氣改變，而組織工程韌帶重建韌帶后必須能經受住關節內部復雜的應力變化，才能維持關節穩定。因此，今后還需要更多體內實驗來驗證組織工程韌帶的機械強度是否達到應對體內復雜力學環境的要求。
5 小結與展望
組織工程韌帶構建涉及到種子細胞、支架材料、生長因子、力學刺激等多個環節，以及各種要素的組合。在目前研究基礎上需要進一步探索ACL體內再生重塑過程，明確體內局部生長因子以及力學傳導通路在該過程中的相互作用機制，這對實驗過程中構建ACL再生修復所需內部環境至關重要。種子細胞及支架材料的優選及其向臨床的轉化應用研究迫在眉睫。體外精準設計的仿生組織工程韌帶在體內的轉歸及促進韌帶再生的確切機制也需進一步研究。
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是一種致密結締組織，主要維持膝關節活動度和穩定性。它是膝關節常見損傷結構，多為撕裂或斷裂，在年輕人群中發病率較高。由于ACL血供較少，一旦損傷很難自行修復[1]。目前國內外主要采用關節鏡下重建ACL，用于重建的移植物主要有自體肌腱、同種異體移植物、人工韌帶等，但術后存在肌力下降、關節僵硬、移植物再斷裂、供區并發癥等問題[2]。組織工程韌帶以材料學和生物化學為基礎，旨在通過細胞治療方法促進ACL的再生修復，使新生韌帶組織達到與原ACL相似的機械強度與生化特性，為治療ACL損傷帶來了希望[3-4]。現廣泛查閱近年來有關組織工程韌帶構建及其修復ACL損傷的文獻，對相關的種子細胞、支架材料、生長因子及力學刺激的研究進展作一綜述。
1 種子細胞
ACL主要由膠原纖維組成（約占94%），其中以Ⅰ型膠原為主；余6%由細胞和基質蛋白組成，基質蛋白主要為彈性蛋白（＜5%）和糖蛋白（＜1%）[5]。目前用于構建組織工程韌帶的種子細胞主要為各種韌帶及肌腱來源的成纖維細胞和不同組織來源的MSCs[6]。前者主要來源于ACL、內側副韌帶（medial collateral ligament，MCL）、髕腱及跟腱等組織，其中ACL成纖維細胞（ACL fibroblast cells，ACLFs）在自我增殖、膠原及基質蛋白表達方面明顯優于其他組織來源的成纖維細胞[7]，因此成為組織工程韌帶最重要的種子細胞。在此基礎上，有學者分別用完整的和斷裂的ACL提取成纖維細胞，并將細胞種植在支架材料上進行體外培養，他們發現這兩種來源的細胞在外觀形態、新生韌帶結構以及合成肌動蛋白及整合素方面均無差異，提示將來可利用自身斷裂的ACL作為種子細胞來源[8]。進一步研究還發現，ACLFs在凝膠中移行快且表型穩定，使其在細胞學特性方面較其他部位細胞更適合作為組織工程韌帶種子細胞[9]。
另一種重要的種子細胞是MSCs，其具有增殖能力強、免疫調節、定向歸巢等優點[10]，以及成骨、成脂、成軟骨、成韌帶等多向分化潛能[11]。目前組織工程韌帶相關研究中應用最廣泛的是BMSCs。有研究證實，BMSCs能在體內韌帶損傷處大量增殖，并定向分化為韌帶樣細胞，促進韌帶組織血管化，刺激韌帶中的ACLFs向損傷部位移動，減少韌帶損傷處的細胞凋亡，促進損傷處瘢痕組織形成，使損傷韌帶修復再生[12]。多項研究已表明，韌帶組織中同樣富含MSCs和祖細胞群，而祖細胞群也具有自我更新和多向分化潛能，當韌帶損傷時，這些細胞能被積極動員并遷移至損傷部位進行自我修復，這也打破了損傷韌帶無法自行修復愈合的傳統觀念，為韌帶的修復再生提供了新思路[13-14]。
然而，雖然ACL中含有MSCs，但數量極少，修復作用有限；ACLFs屬于終末分化成熟細胞，其來源有限、增殖能力差、體外培養擴增困難、生物活性較低，無法修復損傷韌帶[15]。另一方面，BMSCs在骨髓中含量極低（約0.001%），在體外擴增時隨著傳代次數增加，其增殖能力和分化潛能均會下降，甚至出現細胞老化或轉化，逐漸失去其“干性”特點[16]。為解決一種種子細胞無法滿足組織工程韌帶構建需要的問題，有學者將MSCs和韌帶細胞或腱細胞進行共培養，成功表達了更多的膠原及腱糖蛋白。Luo等[17]通過將大鼠BMSCs和跟腱細胞進行共培養，發現與單純BMSCs對照組相比，在同一時期內共培養組細胞增殖量、增殖相關基因c-fos和肌腱相關基因的表達均明顯上升，表明跟腱細胞能促進BMSCs向肌腱分化，并刺激BMSCs增殖和相關肌腱基因的表達。在直接共培養系統中，不同種類的肌腱韌帶細胞會對MSCs的增殖、分化方向以及共培養效果起到關鍵作用，MSCs會按照與之直接接觸的肌腱韌帶細胞方向分化，并產生相應產物[18-19]。Proffen等[20]通過將ACLFs與髕下脂肪墊及外周血源性MSCs進行共培養，發現髕下脂肪墊來源的MSCs能促進ACLFs增殖及膠原合成，外周血來源的MSCs能動員ACLFs更快遷移至韌帶損傷處，從而促進韌帶修復，說明以上兩種不同來源的MSCs均能加速韌帶組織的修復再生。Canseco等[21]通過構建ACLFs和BMSCs共培養體系發現，當ACLFs/MSCs比值為1∶1時，Ⅰ 型膠原及腱糖蛋白表達量最多，Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原比值也最大，最接近宿主韌帶的組成成分，提示這種細胞比例的共培養方式最適用于構建組織工程韌 帶。
利用ACLFs和MSCs的共培養策略，不僅能將種子細胞負載在支架上植入體內，而且可利用細胞釋放出的趨化因子和細胞因子促進支架內血管形成，促進愈合反應，動員宿主韌帶中的MSCs向支架聚集，從而增強體內韌帶的再生反應。此外，MSCs具有抗炎和免疫調節作用，能夠減輕支架復合物植入體內后引起的免疫反應與炎性反應，從而保護植入物，加強韌帶修復[22]。通過共培養系統可使兩種及以上的種子細胞同時或按照一定順序進行相互作用，一方面ACLFs能為MSCs提供所需的外環境及營養支持，刺激MSCs增殖并向韌帶方向分化；另一方面MSCs能充分發揮抗炎和免疫調節作用，刺激ACLFs以及韌帶內的祖細胞向韌帶缺損處遷移聚集，促進ACLFs生成膠原和基質蛋白[20]。
2 支架材料
良好的支架材料應具有生物相容性好、機械強度高的特點，能為種子細胞的黏附、增殖、遷移和發揮功能提供場所，并能夠生物降解以便新的韌帶組織向內生長，加速ACL的再生修復。用于構建組織工程韌帶的支架材料主要包括生物材料、生物降解聚合物以及復合材料，目前以上支架材料均處于臨床研究階段，其臨床適用性還有待進一步評估[23]。
2.1 生物材料
由于天然ACL中Ⅰ型膠原含量接近90%，受此啟發，既往一些學者將膠原纖維制成支架材料，并通過體內外實驗證明兔ACLFs能夠很好地黏附于膠原支架上，并保持細胞活性，但支架植入體內后附著細胞會逐漸減少，機械強度也逐漸降低，并且6周后即被完全降解吸收[24-25]。隨后有學者開發出一種新的膠原-糖胺聚糖復合支架，它能使支架細胞快速增殖，并表達韌帶成纖維細胞表型，但其機械強度相對較差[26]。為了提高膠原支架的機械性能，許多學者通過特殊處理方式使膠原纖維以交聯式或扭曲編織制成支架，雖然在一定程度上提高了膠原支架的機械強度，但仍無法達到要求標準[27-28]。
蠶絲支架也是一種生物材料，由于生物相容性好，在三維空間構型和抗張強度方面與宿主ACL近似，在體內進行生物降解的同時能保持其原有抗張強度達1年左右，可在較長時間內維持關節穩定性，為新生韌帶的長入提供充裕時間，使新生韌帶組織在膠原纖維排布、血管化等方面與原有韌帶相近[29]。目前研究者發現，用親水性較高的蠶絲衍生物制成的支架能促進細胞更快更好地增殖[30]。鑒于此，Horan等[31]研制出了一種具有親水性的蠶絲纖維支架，該支架材料層次結構復雜，能在生物相容性、可降解性及機械強度方面滿足韌帶再生的要求。Fan等[32]將BMSCs負載到編織好的蠶絲纖維支架上，使BMSCs在支架上大量增殖并分化為韌帶樣成纖維細胞，繼而分泌出膠原纖維和腱糖蛋白；然后將細胞-支架復合物植入豬體內24周后觀察發現，其成功促進了韌帶修復。此外，還有許多生物材料支架可用于構建組織工程韌帶，例如透明質酸[33]、殼聚糖[34]、海藻酸鹽[35] 等。
2.2 生物降解聚合物
目前由于人工合成的生物降解聚合物在機械性能、降解速度以及生物相容性方面得到了極大改善，其在組織工程領域的應用也越來越廣泛。既往有學者將一種編織好的聚二氧六環酮支架植入山羊體內，發現植入后早期支架機械強度即不斷下降[36]。Lu等[37]通過將ACLFs分別負載至聚左旋乳酸（poly L-lactic acid，PLLA）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）以及聚乳酸-聚羥基乙酸（poly-lactide-co-glycolide，PLGA）所制成的支架上，結果發現PLLA支架上的細胞增殖最多，并且機械強度最好。有學者通過對PLLA支架的不同空間構型進行研究后發現，在線形、編織形、扭曲形、編織-扭曲形這4 種空間排布中，編織-扭曲形排布的支架黏彈性最好[38]。近來，靜電紡絲技術被廣泛用于制備支架材料，該技術將聚合物溶液或熔體在強電場中進行噴射紡絲，制造出直徑為幾納米至幾微米的支架纖維，并能調控支架纖維的孔隙率、直徑、強度及排布方式，獲得的支架機械強度顯著高于大多數生物降解聚合物支架。Cardwell等[39]采用該技術研制出了6種直徑排布不同的超細纖維支架，結果顯示纖維直徑較大 （＞2 μm）、排布規則的支架上MSCs增殖最快，沉積在支架上 的 膠原 及基質蛋白最多，他們還發現支架纖 維 直徑對MSCs增殖分化的影響 比 纖維排布更 大。
2.3 復合材料
任何一種單一材料均無法滿足組織工程韌帶在生化特性及力學強度方面的要求，復合材料則綜合了以上材料各自優點，成為當前組織工程韌帶支架材料的研究重點。Panas-Perez等[40]研究出一種膠原-蠶絲復合支架，支架中的蠶絲成分＞25%，其機械強度與正常ACL相當。Chung等[41]將疏水性的聚己內酯（polycaprolactone，PCL）和親水性的PGA-PCL-PGA共聚物組成的混合物制成支架，通過改變二者比例可調節支架的親水性、機械強度和降解速率。Sahoo等[42]用涂有bFGF緩釋劑的超細聚乳酸纖維和脫膠后編織好的微纖維蠶絲支架結合而成的生物復合纖維支架來模擬細胞外基質成分，以此來促進間充質祖細胞的黏附、增殖以及分化為所需的韌帶細胞，提高膠原及基質蛋白表達量，從而增強支架材料的機械強度。
目前支架制備技術還不能完全模擬天然ACL的復雜空間構型，還需進一步實驗研究來解決支架材料植入體內后所面臨的機械強度、降解速率和代謝產物等問題。見表 1。
表1
構建組織工程韌帶常用支架材料
Table1.
Common scaffold materials used in ACL tissue engineering
3 生長因子
盡管生長因子對于損傷韌帶修復的確切信號機制仍不清楚，但目前研究已證實生長因子對于種子細胞的增殖及分化、膠原及基質蛋白的合成、新生韌帶的機械強度和血管化形成都至關重要[43]。
TGF-β有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 3種類型，而BMP也屬于TGF-β家族。TGF-β在細胞的免疫調節、生長、分化、基質蛋白合成、創傷修復等方面作用顯著，對靶細胞作用的效果取決于細胞類型、分化狀態、生長條件以及與其他生長因子相互作用產生的結果，對于ACL的修復再生作用尤為顯著[44]。Wang等[44]研究證明TGF-β1能促進韌帶細胞增殖，并可直接調節或經轉錄因子 NF-κB路徑間接調節基質金屬蛋白酶2的釋放，從而使韌帶細胞快速遷移至韌帶損傷處，促進韌帶修復再生。Xie等[45]利用TGF-β1刺激ACL和MCL編碼出賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX），而LOX能催化膠原蛋白和彈性蛋白的交聯反應，進而促進細胞外基質形成，保持其穩定性，對韌帶的修復作用巨大。Hashimoto等[46]首次將重組人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）注入兔半腱肌肌腱兩端，6周后CT檢查可見肌腱兩端注射部位有2個小骨塊形成；然后切取包含2個骨塊的骨-肌腱-骨移植物用于兔ACL重建，分別于4、8周獲取韌帶標本，通過影像學、組織學、生物力學檢查發現，使用經rhBMP-2處理的移植物重建韌帶后腱-骨愈合牢固，且外觀形態和功能與正常ACL相似，表明rhBMP-2具有成骨作用以及促進腱-骨愈合的功能。Schwarting等[47]利用BMP-7刺激成骨細胞、腱-骨交界區細胞及韌帶成纖維細胞相關基因表達，用以增強這些細胞的成骨作用及成纖維細胞的轉化作用，從而促進腱-骨愈合。Dong等[48]將帶有BMP-2目的基因的慢病毒載體成功轉染至BMSCs內，再將轉染后的BMSCs移植到用于重建兔ACL的腓腸肌腱中，取重建4、8周后的韌帶標本進行生物力學和組織學檢查，提示腱-骨愈合良好，表明BMP-2基因轉染的BMSCs對腱-骨愈合有促進作用。
此外，還有許多生長因子也能促進韌帶修復再生，如IGF[49]、bFGF[50]、生長分化因子（growth differentiation factor，GDF）[51]、VEGF[52]、EGF[53]、PDGF[54]。Kurtz等[49]通過研究發現IGF-1能顯著抑制大鼠損傷跟腱的炎性反應，從而最大程度降低對跟腱功能的損害，加速跟腱愈合，但IGF-1對跟腱的生物力學強度并無明顯改善。bFGF是一種強絲裂原，能促進MSCs的增殖及遷移，并使MSCs在多次傳代后保持自身分化潛能[50]。也有學者將帶有能編碼BMP-12和BMP-13基因的腺病毒載體轉染BMSCs和ACLFs，并成功誘導兩種細胞向韌帶分化，進而分泌形成大量韌帶樣基質蛋白[51]。Wei等[52]用攜帶有TGF-β1和VEGF165基因的重組腺病毒載體轉染ACLFs，通過共同表達TGF-β1和VEGF165基因能快速促使ACLFs遷移、增殖并分泌膠原及纖維蛋白。自體富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）也能促進韌帶再生，其不僅含有大量血小板，還包含韌帶修復再生所需的多種生長因子。盡管多項體內外研究證實PRP具有促進韌帶細胞增殖和分泌膠原及基質蛋白的作用，但也有研究發現單獨使用PRP不能加強韌帶修復，因此PRP的臨床實用性還存在較大爭議[55-57]。目前仍無確鑿證據證明PRP對韌帶再生有直接作用，因此PRP還不能作為韌帶損傷的最佳治療方案。
生長因子對于細胞的作用效果不是一成不變的，常具有時效性，今后需將支架材料與生長因子更好結合起來，通過更完善的生長因子控釋技術，以達到對缺損韌帶更快、更好的修復效果。見表 2。
表2
生長因子在組織工程韌帶中的作用
Table2.
Effects of growth factors on tissue engineered ligament
4 力學刺激
力學刺激和動力負荷是構建組織工程韌帶的關鍵因素，在適當的力學刺激誘導下，新生成的韌帶組織能合成大量膠原纖維和基質蛋白，重塑新生韌帶的內部構型，使其具備足夠的抗張強度。目前相關研究已證明，循環機械張力能夠促使韌帶內的成纖維細胞排布規則有序，誘導其形成紡錘形細胞，因而能夠重塑韌帶的內部結構，提高植入物的機械強度[58]。Altman等[59]研究將張力負荷和扭轉負荷作用于BMSCs，發現即使在缺少生長因子作用的情況下，BMSCs也能不斷增殖并向韌帶方向分化，合成排布有序的膠原纖維和腱糖蛋白。Subramony等[60]將bFGF與機械刺激聯合作用于附著有人MSCs的納米支架上，結果發現與無機械負荷的對照組相比，實驗組能促進人MSCs增殖并向韌帶細胞分化，提高膠原和基質蛋白的產量。
盡管力學刺激能夠促進細胞增殖，提高韌帶相關基因的表達，但其效應與作用細胞的類型、機械刺激的頻率、持續時間、作用方向及強度大小有關[23]。有學者[61]發現在種子細胞接種至支架后早期施加機械張力，會抑制Ⅰ、Ⅱ型膠原的表達；而當MSCs增殖數量達到峰值時再施加力學刺激則會促進膠原表達。Park等[62]發現與4%循環張力組和無力學刺激對照組相比，8%循環張力刺激下的ACLFs增殖更快、合成膠原更多。Kreja等[63]將單向循環的間斷張力作用于負載有ACLFs的聚乳酸支架上，發現ACLFs表達Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維蛋白和腱糖蛋白水平明顯升高，而處于相同條件下的MSCs則無明顯變化。
通常情況下，力學刺激能引起細胞整合素介導的局部黏附和細胞骨架的變形，為了確定組織工程韌帶最佳力學刺激參數，還需進一步研究ACL形成過程中的力學傳導通路[64-65]。當力學刺激作用于支架上的種子細胞時會引起細胞的養分運輸、代謝產物和所需氧氣改變，而組織工程韌帶重建韌帶后必須能經受住關節內部復雜的應力變化，才能維持關節穩定。因此，今后還需要更多體內實驗來驗證組織工程韌帶的機械強度是否達到應對體內復雜力學環境的要求。
5 小結與展望
組織工程韌帶構建涉及到種子細胞、支架材料、生長因子、力學刺激等多個環節，以及各種要素的組合。在目前研究基礎上需要進一步探索ACL體內再生重塑過程，明確體內局部生長因子以及力學傳導通路在該過程中的相互作用機制，這對實驗過程中構建ACL再生修復所需內部環境至關重要。種子細胞及支架材料的優選及其向臨床的轉化應用研究迫在眉睫。體外精準設計的仿生組織工程韌帶在體內的轉歸及促進韌帶再生的確切機制也需進一步研究。
