引用本文： 張銘華, 張施洋, 趙增輝, 李維朝, 蔣電明. 鹽酸氨基葡萄糖對關節內出血引起的軟骨損傷修復作用研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(5): 562-568. doi: 10.7507/1002-1892.20160114 復制
關節內出血引起的軟骨損傷（blood-induced joint damage，BJD）常見于韌帶拉傷、關節囊撕裂等運動創傷，關節鏡檢查、關節穿刺等外科手術，以及血友病[1-2]。關節內出血會引起軟骨基質代謝障礙、軟骨細胞凋亡，進而對關節軟骨造成一系列損傷，BJD早期無相關癥狀，但遠期可能導致骨關節炎等臨床疾病[3]。鹽酸氨基葡萄糖（glucosamine-hydrochloride，Glu/Ch）是蛋白聚糖的前體物質，能促進關節軟骨基質的合成，抑制基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、炎性因子等損傷關節軟骨物質的產生，且具有優良的生物安全性，目前多用于骨關節炎的預防和治療[4-5]。本課題組在前期研究中，觀察了關節內出血對關節軟骨膠原蛋白含量的影響，使用Glu/Ch對關節軟骨損傷進行干預，結果顯示Glu/Ch能減少Ⅱ型膠原的丟失，存在一定修復作用[6]。為進一步探究Glu/Ch對BJD的修復作用，我們將Glu/Ch用于兔膝關節出血模型，檢測關節損傷標志物血清軟骨寡聚基質蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）、血清硫酸軟骨素846（chondroitin sulfate 846，CS846）、尿Ⅱ型膠原羧基端前肽（C-terminal telopepide of typeⅡcollagen，CTX-Ⅱ）以及炎性因子IL-1β、TNF-α水平，觀察關節軟骨組織學改變及MMP-13表達，評估不同劑量Glu/Ch在關節出血中對關節軟骨的修復作用，為BJD的臨床治療提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
32只健康成年新西蘭大白兔，雌雄各半，體質量2.3～2.7 kg，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。
CS846 ELISA試劑盒（IBEX公司，加拿大）；CTX-ⅡELISA試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司）；COMP ELISA試劑盒（上海希美生物科技有限公司）；IL-1β、TNF-αELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；阿爾新藍、番紅O、鹽酸胍、戊巴比妥（Sigma-Aldrich公司，美國）；考馬斯亮藍染色液（江蘇碧云天生物技術公司）；兔抗兔MMP-13抗體（北京博奧森生物技術有限公司）。TE2000-U倒置顯微鏡（Nikon公司，日本）；Multiskan全波長酶標儀（Thermo Fisher公司，美國）；低溫離心機（Eppendorf公司，德國）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
取32只新西蘭大白兔隨機分為4組，每組8只；分別為高劑量Glu/Ch組（A組）、低劑量Glu/Ch組（B組）、陽性對照組（C組）、陰性對照組（D組）。A、B、C組參照van Vulpen等[7]方法制備關節腔出血動物模型。具體步驟：禁食、禁飲2 h后，腹腔注射3%戊巴比妥（1 mL/kg）麻醉；自耳緣靜脈采集自體血1?mL，注射入左膝關節腔內；在關節腔另一側插入針頭，有血液流出則表明血液成功注入關節腔內；每天向左膝關節腔注射血液1次，連續5 d，完成關節腔出血模型的制備。D組不制備關節腔出血模型。
建模后第1天起，A、B組用Glu/Ch溶液（6?mL/ kg）灌胃，Glu/Ch劑量分別為250、21.5?mg/ kg，每天1次，連續8周。C、D組用同等劑量蒸餾水進行灌胃。
1.3 觀測指標
1.3.1 關節損傷標志物及炎性因子檢測
建模后3、7 d及2、8周，分別采集各組實驗動物血液（耳緣靜脈取血）及尿液。8周時采用空氣栓塞法處死全部動物，用1 mL PBS反復沖洗關節腔（3～5次），收集沖洗液；于4℃以離心半徑13.5 cm、2 500 r/min離心10 min；取上清，—80℃留存備用。根據ELISA試劑盒說明書操作步驟，檢測血清COMP、CS846濃度，尿CTX-Ⅱ濃度，以及關節腔沖洗液IL-1β、TNF-α濃度。
1.3.2 關節軟骨MMP-13蛋白表達檢測
建模后8 周，完整切取各組動物左側股骨內、外側髁。各組隨機取4個標本置于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，片厚5 μm。取部分切片常規行免疫組織化學染色，倒置顯微鏡高倍鏡（×400）下觀察，MMP-13陽性表達產物為棕褐色顆粒。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測視野中棕褐色顆粒積分吸光度（IA）值，作為MMP-13表達量。
1.3.3 關節軟骨蛋白聚糖含量測定
取部分切片常規脫蠟至水后，分別行阿爾新藍、番紅O染色，中性樹脂封片，倒置顯微鏡下蛋白聚糖分別呈藍色或橘紅色染色。高倍鏡（×400）下觀察，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算陽性染色面積占組織總面積百分比[8]。
參照文獻[9-10]方法半定量檢測關節軟骨蛋白多糖含量。各組隨機取4個標本PBS沖洗，按照100?mg軟骨∶1?mL鹽酸胍溶液（4 mmol/L）混合后，4℃孵育72?h；室溫下，以離心半徑13.5 cm、3?000?r/ min離心10 min，取上清液；與考馬斯亮藍染色液混合后，室溫放置15 min，轉移至96孔板，用酶標儀讀取595?nm處吸光度（A）值，作為關節軟骨蛋白多糖相對含量。
1.4 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 關節損傷標志物檢測
COMP：建模后3 d，A、B、C組COMP濃度顯著高于D組，B、C組高于A組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P>0.05）。7 d，A、B組COMP濃度下降，A、B、D組間比較差異均無統計學意義（P>0.05），且均低于C組（P<0.05）。2、8周，各組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
CS846：各時間點各組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
CTX-Ⅱ：各時間點A、B、C組CTX-Ⅱ濃度均顯著高于D組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。3?d，A、B、C組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；7 d，B、C組顯著高于A組，差異有統計學意義（P<0.05），B、C組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；2、8周，B、C組顯著高于A組，C組高于B組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
建模后各時間點各組關節損傷標志物濃度比較（n=4，2.2 炎性因子檢測
建模后8周，C組TNF-α濃度顯著高于A、B、D組，A、B組高于D組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。A、B、D組IL-1β濃度顯著低于C組，A、D組低于B組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、D組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
建模后8周各組炎性因子濃度比較（n=4，ng/L，2.3 關節軟骨MMP-13蛋白表達檢測
鏡下觀察示，建模后8周A、B、C組可見棕黃色顆粒分布于軟骨組織內；D組幾乎無棕黃色顆粒（圖 1）。A、B、C、D組MMP-13表達量分別為17?895.63±3 531.30、31 017.16±7 820.45、77 701.99± 14?856.64、4 064.35±432.019。C組MMP-13表達量顯著高于A、B、D組、A、B組高于D組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖1
建模后8周各組軟骨組織MMP-13免疫組織化學染色（×400） ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ? ?圖 2 建模后8周各組阿爾新藍染色觀察（×400） ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ? ?圖 3 建模后8周各組番紅O染色觀察（×400） ?A組 ?B組 ?C組 ?D組
Figure1.
Immunohistochemical observation of MMP-13 in cartilage at 8 weeks after modeling (×400) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ? ?Fig. 2 Alcian blue staining observation at 8 weeks after modeling (×400) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ? ?Fig. 3 Safranin-O staining observation at 8 weeks after modeling (×400) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D
2.4 關節軟骨蛋白聚糖含量檢測
鏡下觀察示，各組均見陽性染色，其中D組染色范圍最大、著色最深，其次分別為A、B、C組（圖 2、3）。A、B、C、D組阿爾新藍陽性染色面積百分比分別為69.79%±12.72%、51.90%±17.64%、14.64%±5.93%、93.46%±3.79%；番紅O陽性染色面積百分比分別為59.32%±7.13%、41.38%±4.72%、17.43%±11.09%、79.69%±5.44%。兩種陽性染色面積百分比各組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。
A、B、C、D組關節軟骨蛋白多糖相對含量分別為2.29±0.08、1.72±0.06、0.81±0.11、2.67±0.15，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
3 討論
BJD包括炎性反應和關節軟骨損傷，這是血液中的紅細胞、單核細胞等多種因素作用于關節多個部位的結果[11]。有學者認為，關節出血最先累及的是滑膜，引起滑膜炎性反應，釋放炎性因子，引起繼發的軟骨損傷[12]。也有學者認為，關節內出血直接作用于軟骨，關節軟骨的損害先于滑膜病變[13]。提示滑膜炎癥和軟骨損傷是BJD的兩個核心環節。Glu/Ch能夠增加關節軟骨的彈性及柔韌性，對類風濕性關節炎和骨關節炎具有減緩病情進展的作用[14-15]，提示其可能在BJD中也能發揮類似功效。本研究采用新西蘭大白兔成功建立了關節出血模型，并使用Glu/Ch進行干預，觀察該藥物在軟骨損傷和炎性反應中發揮的作用，探討其能否在BJD病程中修復關節軟骨。
關節軟骨主要由軟骨細胞、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）和水構成。ECM對于軟骨細胞的代謝、生長至關重要，其主要成分是蛋白聚糖和膠原。參與ECM代謝的生物大分子主要包括具有降解作用的MMP和合成作用的組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）。MMP-13對于Ⅱ型膠原和蛋白多糖具有強烈的降解作用，與天然拮抗劑TIMPs共同維持ECM降解、合成動態平衡。在病理狀態下，TIMPs活性下降，MMP-13表達上調，造成ECM持續降解，從而引起軟骨細胞受損。這一失衡可能由滑膜分泌的IL-1β、TNF-α等炎性因子介導。IL-1β具有上調MMP、下調TIMPs、促進滑膜細胞黏附因子表達的作用，從而加重了軟骨吸收和滑膜炎癥。此外，IL-1β還誘導軟骨細胞凋亡、抑制軟骨細胞增殖。TNF-α能夠增加局部毛細血管通透性，加重局部組織水腫和炎性反應[16]。
本研究中，A、B組關節液炎性因子IL-1β濃度顯著低于C組。Navarro等[17]研究表明，Glu/Ch通過抑制NF-κB的p50和p65兩個亞基進入細胞核，抑制IL-1在軟骨細胞內的信號轉導，阻止IL-1β一系列級聯反應對關節損傷具有抗炎作用。Glu/Ch抑制IL-1β活性的另一途徑是促進非活性IL-1受體Ⅱ的表達，該受體與IL-1結合，阻斷了其傳導的驗證效應，競爭性抑制IL-1β[18]。另外，本研究A、B組TNF-α濃度也明顯低于C組，提示在BJD疾病發展過程中，Glu/Ch能有效降低各種炎性因子的表達。其意義在于：一方面，減少了IL-1β、TNF-α等炎性因子對關節軟骨的直接損傷作用；另一方面，“出血-滑膜炎-再出血”的惡性循環是關節腔積血導致關節軟骨功能受損的重要機制[11]，Glu/Ch通過減少炎性反應，遏制了這一循環。另外，A、B組與C組比較MMP-13表達量也顯著減少，蛋白多糖分布范圍顯著增多，表明Glu/Ch抑制了IL-1β、TNF-α釋放介導的MMP-13上調，恢復了MMP與TIMPs的平衡狀態，從而減少ECM的過度降解，達到延緩軟骨細胞受損病情進展的功效。
ECM合成與分解代謝的中間產物，可以反映關節軟骨受損程度，根據來源不同分為CS846（蛋白多糖）、CTX-Ⅱ（Ⅱ型膠原）、COMP（非蛋白聚糖成分）。COMP水平變化反映了軟骨和滑膜組織的更新，可以預測骨關節炎病情的進展。研究表明，血清和尿液中的COMP每增加1 U，軟骨丟失風險增高6倍[19]。一項為期1年的臨床研究發現，尿CTX-Ⅱ水平升高和1年后關節軟骨厚度降低相關[20]。Roemer等[21]研究表明，血清CS846、COMP及尿CTX-Ⅱ聯合檢測能夠反映影像學可見的關節損害與軟骨丟失。本研究中，組織學觀察和蛋白多糖含量檢測結果均提示Glu/Ch能有效減少蛋白多糖降解，而蛋白聚糖分解代謝中間產物CS846在A、B組顯著低于C組，進一步驗證了Glu/Ch可以通過減少軟骨內蛋白多糖降解這一機制，達到修復軟骨損傷的作用。而A、B組尿CTX-Ⅱ、血清COMP濃度也顯著低于C組，可能是由于Glu/Ch對炎性反應和MMP表達的抑制，在ECM合成和分解代謝的其他環節發揮作用，從而對關節軟骨進行保護。
本研究還觀察了Glu/Ch保護關節軟骨的劑量-效應關系，根據文獻報道選擇了21.5 mg/kg和250?mg/kg兩種不同劑量[22-23]。目前，多數學者推薦應用高劑量Glu/Ch，以維持更高的血藥濃度，取得確切療效[23]。本研究中，高劑量Glu/Ch在早期（建模3 d）能顯著降低COMP濃度，而低劑量Glu/Ch在7?d后才表現出這一效應。另外，高劑量Glu/Ch還表現出更理想的抗炎作用，A組關節液IL-1β濃度顯著低于B組，從而降低了炎癥引發的MMP上調與關節損傷。雖然兩組MMP-13表達量差異無統計學意義，但阿爾新藍和番紅O染色均表明高劑量Glu/Ch能顯著提高軟骨組織中蛋白多糖含量，這與目前研究結果一致[24-25]。
綜上述，Glu/Ch在兔關節出血引起的關節損傷中，對關節軟骨具有一定保護作用，在炎性反應和軟骨損傷這兩個BJD核心環節中發揮作用，降低炎性反應介導的ECM降解、代謝失衡，遏制“出血-滑膜炎-再出血”這一惡性循環，這一作用在高劑量給藥時表現更顯著。但本研究僅研究了Glu/Ch的短期效應，其對BJD的遠期影響，需要在今后研究中加以探討。
關節內出血引起的軟骨損傷（blood-induced joint damage，BJD）常見于韌帶拉傷、關節囊撕裂等運動創傷，關節鏡檢查、關節穿刺等外科手術，以及血友病[1-2]。關節內出血會引起軟骨基質代謝障礙、軟骨細胞凋亡，進而對關節軟骨造成一系列損傷，BJD早期無相關癥狀，但遠期可能導致骨關節炎等臨床疾病[3]。鹽酸氨基葡萄糖（glucosamine-hydrochloride，Glu/Ch）是蛋白聚糖的前體物質，能促進關節軟骨基質的合成，抑制基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、炎性因子等損傷關節軟骨物質的產生，且具有優良的生物安全性，目前多用于骨關節炎的預防和治療[4-5]。本課題組在前期研究中，觀察了關節內出血對關節軟骨膠原蛋白含量的影響，使用Glu/Ch對關節軟骨損傷進行干預，結果顯示Glu/Ch能減少Ⅱ型膠原的丟失，存在一定修復作用[6]。為進一步探究Glu/Ch對BJD的修復作用，我們將Glu/Ch用于兔膝關節出血模型，檢測關節損傷標志物血清軟骨寡聚基質蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）、血清硫酸軟骨素846（chondroitin sulfate 846，CS846）、尿Ⅱ型膠原羧基端前肽（C-terminal telopepide of typeⅡcollagen，CTX-Ⅱ）以及炎性因子IL-1β、TNF-α水平，觀察關節軟骨組織學改變及MMP-13表達，評估不同劑量Glu/Ch在關節出血中對關節軟骨的修復作用，為BJD的臨床治療提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
32只健康成年新西蘭大白兔，雌雄各半，體質量2.3～2.7 kg，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。
CS846 ELISA試劑盒（IBEX公司，加拿大）；CTX-ⅡELISA試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司）；COMP ELISA試劑盒（上海希美生物科技有限公司）；IL-1β、TNF-αELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；阿爾新藍、番紅O、鹽酸胍、戊巴比妥（Sigma-Aldrich公司，美國）；考馬斯亮藍染色液（江蘇碧云天生物技術公司）；兔抗兔MMP-13抗體（北京博奧森生物技術有限公司）。TE2000-U倒置顯微鏡（Nikon公司，日本）；Multiskan全波長酶標儀（Thermo Fisher公司，美國）；低溫離心機（Eppendorf公司，德國）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
取32只新西蘭大白兔隨機分為4組，每組8只；分別為高劑量Glu/Ch組（A組）、低劑量Glu/Ch組（B組）、陽性對照組（C組）、陰性對照組（D組）。A、B、C組參照van Vulpen等[7]方法制備關節腔出血動物模型。具體步驟：禁食、禁飲2 h后，腹腔注射3%戊巴比妥（1 mL/kg）麻醉；自耳緣靜脈采集自體血1?mL，注射入左膝關節腔內；在關節腔另一側插入針頭，有血液流出則表明血液成功注入關節腔內；每天向左膝關節腔注射血液1次，連續5 d，完成關節腔出血模型的制備。D組不制備關節腔出血模型。
建模后第1天起，A、B組用Glu/Ch溶液（6?mL/ kg）灌胃，Glu/Ch劑量分別為250、21.5?mg/ kg，每天1次，連續8周。C、D組用同等劑量蒸餾水進行灌胃。
1.3 觀測指標
1.3.1 關節損傷標志物及炎性因子檢測
建模后3、7 d及2、8周，分別采集各組實驗動物血液（耳緣靜脈取血）及尿液。8周時采用空氣栓塞法處死全部動物，用1 mL PBS反復沖洗關節腔（3～5次），收集沖洗液；于4℃以離心半徑13.5 cm、2 500 r/min離心10 min；取上清，—80℃留存備用。根據ELISA試劑盒說明書操作步驟，檢測血清COMP、CS846濃度，尿CTX-Ⅱ濃度，以及關節腔沖洗液IL-1β、TNF-α濃度。
1.3.2 關節軟骨MMP-13蛋白表達檢測
建模后8 周，完整切取各組動物左側股骨內、外側髁。各組隨機取4個標本置于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，片厚5 μm。取部分切片常規行免疫組織化學染色，倒置顯微鏡高倍鏡（×400）下觀察，MMP-13陽性表達產物為棕褐色顆粒。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測視野中棕褐色顆粒積分吸光度（IA）值，作為MMP-13表達量。
1.3.3 關節軟骨蛋白聚糖含量測定
取部分切片常規脫蠟至水后，分別行阿爾新藍、番紅O染色，中性樹脂封片，倒置顯微鏡下蛋白聚糖分別呈藍色或橘紅色染色。高倍鏡（×400）下觀察，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算陽性染色面積占組織總面積百分比[8]。
參照文獻[9-10]方法半定量檢測關節軟骨蛋白多糖含量。各組隨機取4個標本PBS沖洗，按照100?mg軟骨∶1?mL鹽酸胍溶液（4 mmol/L）混合后，4℃孵育72?h；室溫下，以離心半徑13.5 cm、3?000?r/ min離心10 min，取上清液；與考馬斯亮藍染色液混合后，室溫放置15 min，轉移至96孔板，用酶標儀讀取595?nm處吸光度（A）值，作為關節軟骨蛋白多糖相對含量。
1.4 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 關節損傷標志物檢測
COMP：建模后3 d，A、B、C組COMP濃度顯著高于D組，B、C組高于A組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P>0.05）。7 d，A、B組COMP濃度下降，A、B、D組間比較差異均無統計學意義（P>0.05），且均低于C組（P<0.05）。2、8周，各組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
CS846：各時間點各組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
CTX-Ⅱ：各時間點A、B、C組CTX-Ⅱ濃度均顯著高于D組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。3?d，A、B、C組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；7 d，B、C組顯著高于A組，差異有統計學意義（P<0.05），B、C組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；2、8周，B、C組顯著高于A組，C組高于B組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
建模后各時間點各組關節損傷標志物濃度比較（n=4，2.2 炎性因子檢測
建模后8周，C組TNF-α濃度顯著高于A、B、D組，A、B組高于D組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。A、B、D組IL-1β濃度顯著低于C組，A、D組低于B組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、D組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
建模后8周各組炎性因子濃度比較（n=4，ng/L，2.3 關節軟骨MMP-13蛋白表達檢測
鏡下觀察示，建模后8周A、B、C組可見棕黃色顆粒分布于軟骨組織內；D組幾乎無棕黃色顆粒（圖 1）。A、B、C、D組MMP-13表達量分別為17?895.63±3 531.30、31 017.16±7 820.45、77 701.99± 14?856.64、4 064.35±432.019。C組MMP-13表達量顯著高于A、B、D組、A、B組高于D組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖1
建模后8周各組軟骨組織MMP-13免疫組織化學染色（×400） ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ? ?圖 2 建模后8周各組阿爾新藍染色觀察（×400） ?A組 ?B組 ?C組 ?D組 ? ?圖 3 建模后8周各組番紅O染色觀察（×400） ?A組 ?B組 ?C組 ?D組
Figure1.
Immunohistochemical observation of MMP-13 in cartilage at 8 weeks after modeling (×400) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ? ?Fig. 2 Alcian blue staining observation at 8 weeks after modeling (×400) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ? ?Fig. 3 Safranin-O staining observation at 8 weeks after modeling (×400) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D
2.4 關節軟骨蛋白聚糖含量檢測
鏡下觀察示，各組均見陽性染色，其中D組染色范圍最大、著色最深，其次分別為A、B、C組（圖 2、3）。A、B、C、D組阿爾新藍陽性染色面積百分比分別為69.79%±12.72%、51.90%±17.64%、14.64%±5.93%、93.46%±3.79%；番紅O陽性染色面積百分比分別為59.32%±7.13%、41.38%±4.72%、17.43%±11.09%、79.69%±5.44%。兩種陽性染色面積百分比各組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。
A、B、C、D組關節軟骨蛋白多糖相對含量分別為2.29±0.08、1.72±0.06、0.81±0.11、2.67±0.15，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
3 討論
BJD包括炎性反應和關節軟骨損傷，這是血液中的紅細胞、單核細胞等多種因素作用于關節多個部位的結果[11]。有學者認為，關節出血最先累及的是滑膜，引起滑膜炎性反應，釋放炎性因子，引起繼發的軟骨損傷[12]。也有學者認為，關節內出血直接作用于軟骨，關節軟骨的損害先于滑膜病變[13]。提示滑膜炎癥和軟骨損傷是BJD的兩個核心環節。Glu/Ch能夠增加關節軟骨的彈性及柔韌性，對類風濕性關節炎和骨關節炎具有減緩病情進展的作用[14-15]，提示其可能在BJD中也能發揮類似功效。本研究采用新西蘭大白兔成功建立了關節出血模型，并使用Glu/Ch進行干預，觀察該藥物在軟骨損傷和炎性反應中發揮的作用，探討其能否在BJD病程中修復關節軟骨。
關節軟骨主要由軟骨細胞、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）和水構成。ECM對于軟骨細胞的代謝、生長至關重要，其主要成分是蛋白聚糖和膠原。參與ECM代謝的生物大分子主要包括具有降解作用的MMP和合成作用的組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）。MMP-13對于Ⅱ型膠原和蛋白多糖具有強烈的降解作用，與天然拮抗劑TIMPs共同維持ECM降解、合成動態平衡。在病理狀態下，TIMPs活性下降，MMP-13表達上調，造成ECM持續降解，從而引起軟骨細胞受損。這一失衡可能由滑膜分泌的IL-1β、TNF-α等炎性因子介導。IL-1β具有上調MMP、下調TIMPs、促進滑膜細胞黏附因子表達的作用，從而加重了軟骨吸收和滑膜炎癥。此外，IL-1β還誘導軟骨細胞凋亡、抑制軟骨細胞增殖。TNF-α能夠增加局部毛細血管通透性，加重局部組織水腫和炎性反應[16]。
本研究中，A、B組關節液炎性因子IL-1β濃度顯著低于C組。Navarro等[17]研究表明，Glu/Ch通過抑制NF-κB的p50和p65兩個亞基進入細胞核，抑制IL-1在軟骨細胞內的信號轉導，阻止IL-1β一系列級聯反應對關節損傷具有抗炎作用。Glu/Ch抑制IL-1β活性的另一途徑是促進非活性IL-1受體Ⅱ的表達，該受體與IL-1結合，阻斷了其傳導的驗證效應，競爭性抑制IL-1β[18]。另外，本研究A、B組TNF-α濃度也明顯低于C組，提示在BJD疾病發展過程中，Glu/Ch能有效降低各種炎性因子的表達。其意義在于：一方面，減少了IL-1β、TNF-α等炎性因子對關節軟骨的直接損傷作用；另一方面，“出血-滑膜炎-再出血”的惡性循環是關節腔積血導致關節軟骨功能受損的重要機制[11]，Glu/Ch通過減少炎性反應，遏制了這一循環。另外，A、B組與C組比較MMP-13表達量也顯著減少，蛋白多糖分布范圍顯著增多，表明Glu/Ch抑制了IL-1β、TNF-α釋放介導的MMP-13上調，恢復了MMP與TIMPs的平衡狀態，從而減少ECM的過度降解，達到延緩軟骨細胞受損病情進展的功效。
ECM合成與分解代謝的中間產物，可以反映關節軟骨受損程度，根據來源不同分為CS846（蛋白多糖）、CTX-Ⅱ（Ⅱ型膠原）、COMP（非蛋白聚糖成分）。COMP水平變化反映了軟骨和滑膜組織的更新，可以預測骨關節炎病情的進展。研究表明，血清和尿液中的COMP每增加1 U，軟骨丟失風險增高6倍[19]。一項為期1年的臨床研究發現，尿CTX-Ⅱ水平升高和1年后關節軟骨厚度降低相關[20]。Roemer等[21]研究表明，血清CS846、COMP及尿CTX-Ⅱ聯合檢測能夠反映影像學可見的關節損害與軟骨丟失。本研究中，組織學觀察和蛋白多糖含量檢測結果均提示Glu/Ch能有效減少蛋白多糖降解，而蛋白聚糖分解代謝中間產物CS846在A、B組顯著低于C組，進一步驗證了Glu/Ch可以通過減少軟骨內蛋白多糖降解這一機制，達到修復軟骨損傷的作用。而A、B組尿CTX-Ⅱ、血清COMP濃度也顯著低于C組，可能是由于Glu/Ch對炎性反應和MMP表達的抑制，在ECM合成和分解代謝的其他環節發揮作用，從而對關節軟骨進行保護。
本研究還觀察了Glu/Ch保護關節軟骨的劑量-效應關系，根據文獻報道選擇了21.5 mg/kg和250?mg/kg兩種不同劑量[22-23]。目前，多數學者推薦應用高劑量Glu/Ch，以維持更高的血藥濃度，取得確切療效[23]。本研究中，高劑量Glu/Ch在早期（建模3 d）能顯著降低COMP濃度，而低劑量Glu/Ch在7?d后才表現出這一效應。另外，高劑量Glu/Ch還表現出更理想的抗炎作用，A組關節液IL-1β濃度顯著低于B組，從而降低了炎癥引發的MMP上調與關節損傷。雖然兩組MMP-13表達量差異無統計學意義，但阿爾新藍和番紅O染色均表明高劑量Glu/Ch能顯著提高軟骨組織中蛋白多糖含量，這與目前研究結果一致[24-25]。
綜上述，Glu/Ch在兔關節出血引起的關節損傷中，對關節軟骨具有一定保護作用，在炎性反應和軟骨損傷這兩個BJD核心環節中發揮作用，降低炎性反應介導的ECM降解、代謝失衡，遏制“出血-滑膜炎-再出血”這一惡性循環，這一作用在高劑量給藥時表現更顯著。但本研究僅研究了Glu/Ch的短期效應，其對BJD的遠期影響，需要在今后研究中加以探討。
