引用本文： 朱元正, 易陽艷. 3-D 成球培養 MSCs 的研究進展及臨床應用前景. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(4): 497-503. doi: 10.7507/1002-1892.201612056 復制
MSCs 是多能干細胞家族中的一員，因其強大的自我更新與多向分化能力而備受關注。最初，MSCs 從骨髓中提取，稱為 BMSCs[1]，在體外培養時表現為一種成纖維細胞形態的貼壁細胞。早期研究發現[2]，MSCs 還能從脂肪、臍帶、軟骨、牙齦等多種結締組織中提取。這些 MSCs 具有與 BMSCs 類似的生物學特性，能在特定環境下形成干細胞巢，并分化為神經、心肌、肝臟、骨、軟骨、脂肪、上皮等多種組織細胞[3]。因此，MSCs 在再生醫學中被視為修復組織損傷和對抗缺血性疾病的理想種子細胞。
然而，近年研究發現傳統貼壁培養擴增后的 MSCs 在臨床應用及動物實驗中存活率較低，且生物活性與治療效果均達不到其理論高度[4]。究其原因，許多學者認為傳統的 2-D 貼壁細胞培養法雖簡便易行，但貼壁培養法提供的平面生長環境與細胞在生物體內生長的微環境大相徑庭，且改變了細胞生長的原始形態，使得細胞的生物學特性無法充分表達[5]。而 3-D 培養模式可以給細胞提供一個更加接近于體內生長的環境，增加了細胞外基質（extra-cellular matrixc，ECM）的分泌，增強了細胞之間的接觸，更有利于激發MSCs的生物活性[6]。現探討 3-D 懸浮成球培養模式下獲取的 MSCs 細胞球，較傳統 2-D 貼壁培養模式下的 MSCs 在旁分泌、增殖、分化、抗凋亡等生物學功能上的變化，以及造成這些變化的生物學機制，并分析 MSCs 細胞球的治療優勢與臨床應用前景。
1 細胞成球培養技術及原理
在常規的干細胞貼壁培養時，原本懸浮在培養液中的干細胞會逐漸沉積并黏附在培養瓶底面，稱為貼壁。后來，為了模擬細胞在生物體內的生長環境，學者們開創了 3-D 培養體系，3-D 培養體系為細胞的體外培養提供了一個支持細胞-細胞和細胞-ECM 間相互作用、交換信號的平臺。3-D 培養體系中有支架模型和無支架模型，3-D 成球培養屬于無支架模型中的常見方法，該原理是利用貼壁細胞趨向聚集成團的生物學特性，從而形成球狀的細胞聚合體。此方法通常選用低黏附力或無黏附力的培養基，使懸浮細胞通過細胞間的相互作用聚集成團。早期，旋轉培養法和溶液覆蓋法都曾用于促進細胞的聚集[7]。轉瓶培養法通過持續攪拌高密度細胞懸液來減小細胞與培養瓶壁之間的接觸，加大細胞與細胞之間的接觸，從而促使細胞聚集成團；溶液覆蓋法則通過瓊脂來防止細胞貼壁。這兩種方法最終只能形成形態不一的細胞球。另一個廣泛運用的方法是懸滴法[8]，通過將細胞包裹在懸滴中來防止細胞與培養皿壁的接觸，再通過重力作用及細胞間的相互作用使細胞在懸滴底部聚集并形成細胞球，此方法獲得的細胞球大小均勻，且可通過操縱懸滴來控制細胞球的大小，而且通過懸滴法還可實現多種細胞的共混培養。此外，還有一種新型技術，采用生物隔膜將 2-D 培養下的細胞轉化為 3-D 培養，隔膜通常采用水凝膠、殼聚糖、透明質酸、海藻酸鈣等生物材料，且這些材料已被證實對細胞的遷移、增殖、分泌等生物功能有促進作用[9]。還有通過熱力釋放 ECM、低速離心等方法誘導細胞聚集[10]。
通常情況下，在低黏附力的培養環境中，細胞與細胞之間先通過整合蛋白與 ECM 的接觸形成一個結構松散的多細胞團塊，之后細胞之間的接觸愈加頻繁，通過鈣黏蛋白相互建立連接，此時原本松散的細胞團塊逐漸壓縮，最終變成致密的多細胞聚合體，即細胞球[11]。但采用有黏附力的生物材料制備細胞球，成球原理則完全不同。細胞先被生物材料黏附，并在材料上伸展，然后再收起偽足變為球形聚集成團[12]。細胞球一旦形成，則可模擬生物體內細胞生存的微環境，細胞與細胞之間由細胞外基質連接，留有一定的間隙可供外界氧氣和養分的供給，以及代謝廢物的排出。此外，與復雜支架模型中的細胞相比，細胞球在顯微鏡下更容易被觀察，更符合實驗需求[8]。
2 MSCs 細胞球的生物學功能
2.1 MSCs 細胞球的多向分化潛能
MSCs 的分化能力與培養基中所添加的生物材料密切相關，不同生物材料具備不同的生物力學，其中彈力和黏附力是決定 MSCs 分化方向的關鍵因素。以脂肪組織為例，有研究[13]發現負壓吸引與靜態懸吊有利于脂肪前體細胞誘導組織再生，而固定與壓迫則抑制再生，組織學結果提示，低張力的微環境更利于脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的增殖與成脂分化。究其原因，學者們進一步研究發現[14]，經原子力顯微鏡檢測出人體成熟脂肪細胞的彈力為（0.9±0.8）kPa，而 ADSCs 的彈力為（2.5±1.2）kPa，高于成熟脂肪細胞。因此，ADSCs 向成熟脂肪細胞分化的過程中需要在低張力環境下降低其彈性力學。所以，彈力較低的生物材料（2～3 kPa）可在體外無化學誘導的環境下促進 ADSCs 的成脂分化。若采用彈力較大的生物材料（11～30 kPa）則會誘導 ADSCs 成軟骨分化[15]。此外，還有研究發現[16]將 3-D 懸浮培養的 MSCs 包埋于無黏附力的透明質酸中，MSCs 的細胞骨架發生改變，具體表現為剛度變低、應力纖維和黏著斑減少，這種改變有利于 MSCs 的成脂分化；反之包埋于黏附力較強的殼聚糖中，其細胞骨架的剛度變高，應力纖維和黏著斑也隨之增多，成脂分化能力受抑制，而成骨分化能力增強。此外，還有研究表明[17]3-D 懸浮培養的 MSCs 細胞球中 Nanog、Sox-2、POU5FI/OCT4 等多能干細胞標記物的表達較貼壁培養的 MSCs 明顯增強，進一步證明了 3-D 成球培養可增強 MSCs 的多向分化潛能。
2.2 MSCs 細胞球的壽命及增殖能力
有研究表明[18]體外 3-D 成球培養可延長 MSCs 的壽命，減緩 MSCs 的老化，具體表現在 3-D 培養的 MSCs 細胞球高表達抗凋亡基因 Bcl-2，低表達促凋亡基因 Bax。Lee 等[19]在小鼠缺血的肢端組織中注射 MSCs 細胞球與貼壁培養的 MSCs 進行比較，結果表明注射 MSCs 細胞球的組織成活面積大于對照組，且經免疫組織化學染色發現注射 MSCs 細胞球的組織中增殖細胞核抗原表達明顯高于對照組。該研究表明 MSCs 細胞球在生物體內移植區中較 MSCs 有更強的增殖能力，若用 MSCs 細胞球替代 MSCs，可優化傳統干細胞療法的治療效果。由此可見，3-D 培養 MSCs 可成為施行干細胞療法前預處理 MSCs、增強細胞活性的一種手段。關于 3-D 培養增強 MSCs 細胞活性和存活能力的機制，目前仍未完全闡明，有學者認為[20]細胞球核心部分細胞處于低氧狀態，正是這種低氧環境下產生的缺氧誘導因子（hypoxic inducible factor，HIF）作用于 MSCs，提高了 MSCs 的多向分化能力以及對缺血缺氧環境的耐受能力；也有學者認為[21]是細胞間接觸增多，信號交換頻繁所致。
2.3 MSCs 細胞球的旁分泌作用
與 2-D 貼壁培養的 MSCs 相比，3-D 培養的 MSCs 細胞球具有更強大的旁分泌作用，其分泌的抗炎因子、細胞生長因子對提高干細胞療法的治療效果有著重要意義。比如，BMSCs 細胞球分泌的抗炎因子 TNF-α 刺激基因 6（TNF-α stimulated gene 6，TSG-6）能有效控制小鼠心肌梗死的炎性反應，保護心肌細胞[6]；MSCs 細胞球通過提高前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）分泌來調控巨噬細胞的活性[22]；IL-24 的分泌能降低腫瘤細胞的活性[23]。此外，MSCs 細胞球旁分泌的多種細胞生長因子如 VEGF、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、FGF、趨化因子受體 4（chemokine receptor 4，CXCR4）、單核細胞趨化蛋白 3、趨化因子 RANTES、基質細胞衍生因子1和血管生成素等，與貼壁培養的 MSCs 相比均有增加[24]。這些細胞因子的釋放對治療缺血性疾病和在組織移植早期快速啟動血管新生都有著重要意義。同時，HGF 的抗纖維化作用及 TGF-β3 減少瘢痕增生作用均已被證實[25]，而 MSCs 細胞球旁分泌 HGF 和 TGF-β3 的能力顯著強于單層貼壁培養的 MSCs[11]，因此 MSCs 細胞球比 MSCs 具有更強大的抑制瘢痕形成的作用。
3 3-D 成球培養法增強 MSCs 生物功能的機制
與傳統的 2-D 貼壁培養 MSCs 相比，3-D 培養的 MSCs 細胞球在分化能力、存活能力、旁分泌能力等多項功能中均表現出顯著優勢。造成這些變化的主要因素在于 3-D 培養下 MSCs 的形態差異、細胞間作用力的增強、ECM 分泌增多和低氧微環境的刺激。近年大量研究證明，這些因素都參與調控 MSCs 的生物功能，并對其調控機制展開了更深層面的研究。
3.1 MSCs形態與細胞骨架的改變
與貼壁培養的 MSCs 相比，3-D 培養的 MSCs 細胞球在細胞形態、細胞骨架、黏附力、張力等屬性上均有著顯著差異，而這些差異正是影響 MSCs 生物學功能的因素。從形態學角度分析，MSCs 細胞球的表層細胞形態規則呈扁平狀，而中央區域的細胞呈不規則的球形。細胞形態對其分化潛力有著重要影響，比如在中央區球形的 MSCs 表面張力較低，表現出向脂肪細胞分化的傾向；而周邊的細胞收縮力大，更容易向骨細胞分化[26]。
3.2 細胞接觸的作用
在探索如何提高移植區 MSCs 的存活率時，有許多學者嘗試采用缺氧預處理 MSCs 提高干細胞對缺血缺氧環境的耐受，采用生物支架給干細胞提供可攀附的基礎，添加生長因子增強干細胞的存活等多種方法，但這些思路都忽視了一個關鍵問題，就是增強細胞間的接觸。3-D 培養的 MSCs 細胞球在這個問題上有極大突破，每個細胞球都可視為一個高密度的細胞集合體，給細胞之間的物質交換提供了良好的微環境。有研究表明[26]MSCs 細胞球中細胞接觸的作用主要表現在鈣黏蛋白信號通路與縫隙連接作用增強，可促進 MSCs 的存活、增殖、分化、旁分泌能力。鈣黏蛋白是一種細胞內黏附蛋白，它可以在組織修復與再生時參與細胞分類及細胞聚集的信號識別[27]。N-鈣黏蛋白在高密度的間葉細胞中高表達，參與細胞的增殖與分化，在動物實驗中人為地抑制 N-鈣黏蛋白表達，則間葉細胞成軟骨分化能力減弱，肢體發育受阻[28]。在體外實驗中，由殼聚糖生物隔膜制備的 MSCs 細胞球中可檢測到 N-鈣黏蛋白和 P-選擇蛋白的表達，兩者與 MSCs 的自我更新以及成脂、成軟骨、成骨分化均有一定聯系[29]。N-鈣黏蛋白除了調控 MSCs 的增殖和分化作用，還可促進細胞因子的分泌。有研究發現[30]，N-鈣黏蛋白能通過活化細胞外信號調節激酶以及加強細胞接觸來促進 VEGF 的分泌。
連接蛋白-43 是重要的縫隙連接蛋白，由細胞接觸增多而產生，在 3-D 培養的 MSCs 細胞球中高表達[31]。連接蛋白-43 已被證實與 MSCs 成脂、成軟骨、成骨分化有著不同的調控作用。在成脂分化早期，連接蛋白-43 表達逐漸增強，而在脂肪細胞成熟過程中逐漸減弱；若抑制連接蛋白-43 表達，則 MSCs 成脂分化受抑制，成骨分化潛能增強；而在成軟骨分化過程中均可檢測到連接蛋白-43 的表達[32]。因此，細胞接觸的增多可同時激活鈣黏蛋白及連接蛋白，對 MSCs 分化能力的調控有著重要意義。
3.3 ECM 的作用
最理想的 MSCs 體外培養模型應具備體內干細胞巢的微環境，ECM 是不可缺少的成分。ECM 是由動物細胞合成并分泌到細胞外、分布在細胞表面或細胞之間的大分子，包括膠原蛋白、黏多糖、層粘連蛋白、纖維連接蛋白、彈性蛋白等[33]。3-D 懸浮培養模式給予 MSCs 更寬裕的生長空間，ECM 的釋放也明顯高于傳統貼壁培養 MSCs，可形成一定規模的 ECM 網[34]。在材料學上，ECM 被視為一種具有生物活性的天然生物材料，它對組織細胞起支撐、保護、營養的作用，為干細胞的增殖、分化、旁分泌提供了舒適的環境，并且通過細胞膜表面的整合蛋白將信號傳入細胞內，系統地調控細胞的生命活動[35]。此外，干細胞療法中單純的干細胞注射療效并不理想，其主要原因之一在于局部炎性反應募集了大量巨噬細胞，巨噬細胞可吞噬部分干細胞，導致治療效果降低。而 ECM 可以充當干細胞療法中對抗巨噬細胞的屏障。近年來，學者們通過大量動物實驗證明，采用 3-D 培養法預處理 MSCs 并以細胞球的形式注入生物體內，可提高移植區的種子細胞密度，增強 MSCs 對炎性細胞吞噬作用及缺血缺氧環境的耐受，提高 MSCs 的存活率及增殖能力，在缺血心肌的修復、軟骨修復及脂肪組織修復中均有突出作用[36]。
3.4 低氧微環境對 MSCs 的作用
MSCs 細胞球是個復雜的多細胞聚合體，細胞球的大小直接關系單個細胞的活性，目前雖然對 3-D 培養 MSCs 細胞球的最適粒徑無權威報道，但學者們普遍認為粒徑過大會損傷 MSCs 的活性，其主要原因在于粒徑過大，中央的細胞難以接受外界營養物質和氧氣的供給，易發生中央區域的細胞壞死[37]。而適當控制細胞球的粒徑可使 MSCs 處于輕度缺氧狀態，反而能增強 MSCs 的抗氧化、抗凋亡能力。因為在低氧微環境中，HIF 的產生可刺激 VEGF、FGF-2、HGF、CXCR4 等細胞因子以及 PGE-2，TSG-6 等抗炎因子的分泌；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和抗凋亡因子 Bcl-2 的高表達，可增強細胞的抗凋亡能力，延長細胞壽命[20]。然而，除了低氧微環境，糖酵解產物如丙酮酸和乳酸也可活化 HIF 的轉錄，并在缺氧環境下維持 HIF 的穩定表達[38]。傳統貼壁培養的 MSCs 因缺乏對移植后這種惡劣微環境的適應而過早凋亡，失去治療能力，而 3-D 成球培養形成的低氧微環境恰好可以模擬臨床上缺血再灌注損傷、難愈性創面、組織移植等病理模型，若在移植前通過 3-D 成球培養預處理，可誘導 MSCs 提前適應低氧環境，激活 HIF、SOD 等多種抗氧化基因，釋放多種促血管化細胞因子及抗炎因子，從而增強移植后 MSCs 的存活率和治療效果。
4 MSCs 細胞球的應用前景
傳統的干細胞療法可視為一種離散的干細胞移植術，移植后干細胞的活性和存活時間均不理想。與之相比，移植 3-D 培養獲得的 MSCs 細胞球具有以下優勢：① MSCs 細胞球可視為一種富含 ECM 的多細胞聚合體，ECM 的富集給干細胞提供了一個適宜的微環境來對抗移植后的短期高強度炎性反應，降低微環境中的細胞毒性。② ECM 與細胞間作用力增強了干細胞移植后的黏附力和存活力，為干細胞定向分化提供了信號傳遞的媒介。③ 干細胞對移植后低氧環境的適應能力增強，在低氧誘導因子的激發下，多種促血管化細胞因子的釋放有利于早期的血管新生和宿主受損組織的保留。基于以上優勢，3-D 培養獲得的 MSCs 細胞球在難愈性創面愈合、缺血組織修復以及組織重塑方面具有廣闊的應用前景。
4.1 MSCs 細胞球在創面及缺血組織修復中的應用前景
在臨床上對于難愈性創面、缺血組織的修復上常采用干細胞療法，即通過細針將干細胞精準注入損傷區域，種子細胞的存活能力、再生能力直接決定最終治療效果。所以我們認為，可在注射前先對種子細胞進行預處理，使零散細胞聚集成團，并以 ECM 和生物材料作為包埋細胞團的生物隔膜，既可營養種子細胞，激發其生物活性，又可在移植后發揮屏障作用抵抗炎性細胞的吞噬，大量細胞因子的釋放還能促進移植區早期血管新生，這正是 3-D 成球培養模式下獲得的 MSCs 細胞球的臨床優勢所在。研究表明，牙齦來源的 MSCs（gingiva derived stem cells，G-MSCs）成球培養后對化療后口腔黏膜炎的治療效果顯著大于貼壁培養的 G-MSCs，且通過靜脈注射 G-MSCs 細胞球發現其具有很強的歸巢能力，可自主向受損組織區域遷移[39]。2015 年日本東京大學 Yoshimura 的研究團隊[40]將透明質酸溶液中形成的 ADSCs 微球注入小鼠缺血再灌注損傷的脂肪墊中，取得了理想的治療效果；同時，該實驗與單純注射 ADSCs 的對照組相比，無論是早期抑制炎性反應和血管新生，還是后期脂肪組織再生方面，均具有突出效果。在腦梗死大鼠模型中[41]，采用頸動脈注射 3-D 成球培養的 MSCs 細胞球同樣獲得了理想治療效果，術后 24 h，MSCs 細胞球組腦組織損傷面積減少了 55%，明顯高出貼壁培養的 MSCs 治療組（27.5%），且術后 14 d MSCs 細胞球組的腦組織保留率高達 72.9%，同樣明顯高出 MSCs 治療組（42.6%）。治療效果顯著提升的原因主要在于注射后受損區域 MSCs 細胞球的高存活率，以及 MSCs 細胞球注射早期降低組織炎性反應以及促進血管新生的作用；該研究還意外發現，單純頸動脈注射貼壁培養 MSCs 的大鼠均出現小動脈栓塞癥狀，造成不同程度視力損傷，還有部分大鼠在注射后出現大腦中動脈栓塞；而這些并發癥在 MSCs 細胞球治療組均未出現。該實驗組認為其主要原因在于細胞體積，MSCs 細胞球的體積較貼壁培養 MSCs 減小了約 40%，故不易造成小動脈栓塞。此研究為提高干細胞血管內注射的治療效果和有效避免并發癥方面提供了有效解決方案。
4.2 MSCs 細胞球在組織工程中的應用前景
MSCs 細胞球在組織重塑及與生物支架復合方面較傳統貼壁培養的 MSCs 更具優勢。根據前文所述，通過對包埋 MSCs 材料剛度、黏附力的調控，可誘導 MSCs 的定向分化。與體外實驗的化學誘導相比，這種生物力學的誘導因素更具臨床應用價值。此外，成球培養的 MSCs 更適合擔當組織工程中的種子細胞，MSCs 細胞球的分化能力、存活能力、旁分泌能力均優于貼壁培養的 MSCs，對于組織缺損的修復有重要價值[42]。這類研究多用于骨組織和軟骨組織的修復，主要表現在 MSCs 細胞球在軟骨內成骨和膜內成骨方面具有突出表現，從而加速骨組織修復。而且，ECM 的作用和細胞間作用力可促進成骨因子的釋放，微環境的改變加速了 MSCs 成骨分化的進程[43]。在軟骨修復模型中有研究發現，MSCs 細胞球憑借其出色的黏附力持久貼附于軟骨缺損部位表面，促進軟骨修復[44]。還有研究將軟骨細胞與滑膜干細胞共混 3-D 成球培養后，注射至軟骨缺損部位，局部微環境中 ECM 的含量顯著增多，修復效率明顯提高[45]。由此可見，3-D 成球培養法可成為修復組織缺損中預處理種子細胞的一種手段，更加高效地誘導組織新生。
5 小結及展望
3-D 培養的 MSCs 細胞球已被證實較傳統貼壁培養的 MSCs 在抗凋亡、抗炎、多向分化及旁分泌細胞因子等生物功能方面均有顯著提升，為臨床上提高干細胞療法的治療效果提供了新的思路。目前，盡管對 3-D 成球培養增強 MSCs 生物活性的機制以及相關信號通路有一定了解，但還有大量問題需要進一步深入研究。比如，在 3-D 培養模式下誘導 MSCs 聚集成球的信號通路；MSCs 細胞球抗凋亡作用的具體機制；MSCs 細胞球細胞骨架與其生物學功能增強有何聯系；3-D 成球培養過程中生物力學的改變影響細胞分化的機制；MSCs 細胞球粒徑控制在什么范圍可達到促進細胞生物活性而不至于導致中央區細胞缺氧壞死的程度，這對建立長期而穩定的 MSCs 3-D 成球培養模式尤為重要。揭開這些問題有助于進一步了解 MSCs 細胞球的理化性質，建立更加穩定的 3-D 成球培養體系，推動 MSCs 細胞球的臨床應用。
MSCs 是多能干細胞家族中的一員，因其強大的自我更新與多向分化能力而備受關注。最初，MSCs 從骨髓中提取，稱為 BMSCs[1]，在體外培養時表現為一種成纖維細胞形態的貼壁細胞。早期研究發現[2]，MSCs 還能從脂肪、臍帶、軟骨、牙齦等多種結締組織中提取。這些 MSCs 具有與 BMSCs 類似的生物學特性，能在特定環境下形成干細胞巢，并分化為神經、心肌、肝臟、骨、軟骨、脂肪、上皮等多種組織細胞[3]。因此，MSCs 在再生醫學中被視為修復組織損傷和對抗缺血性疾病的理想種子細胞。
然而，近年研究發現傳統貼壁培養擴增后的 MSCs 在臨床應用及動物實驗中存活率較低，且生物活性與治療效果均達不到其理論高度[4]。究其原因，許多學者認為傳統的 2-D 貼壁細胞培養法雖簡便易行，但貼壁培養法提供的平面生長環境與細胞在生物體內生長的微環境大相徑庭，且改變了細胞生長的原始形態，使得細胞的生物學特性無法充分表達[5]。而 3-D 培養模式可以給細胞提供一個更加接近于體內生長的環境，增加了細胞外基質（extra-cellular matrixc，ECM）的分泌，增強了細胞之間的接觸，更有利于激發MSCs的生物活性[6]。現探討 3-D 懸浮成球培養模式下獲取的 MSCs 細胞球，較傳統 2-D 貼壁培養模式下的 MSCs 在旁分泌、增殖、分化、抗凋亡等生物學功能上的變化，以及造成這些變化的生物學機制，并分析 MSCs 細胞球的治療優勢與臨床應用前景。
1 細胞成球培養技術及原理
在常規的干細胞貼壁培養時，原本懸浮在培養液中的干細胞會逐漸沉積并黏附在培養瓶底面，稱為貼壁。后來，為了模擬細胞在生物體內的生長環境，學者們開創了 3-D 培養體系，3-D 培養體系為細胞的體外培養提供了一個支持細胞-細胞和細胞-ECM 間相互作用、交換信號的平臺。3-D 培養體系中有支架模型和無支架模型，3-D 成球培養屬于無支架模型中的常見方法，該原理是利用貼壁細胞趨向聚集成團的生物學特性，從而形成球狀的細胞聚合體。此方法通常選用低黏附力或無黏附力的培養基，使懸浮細胞通過細胞間的相互作用聚集成團。早期，旋轉培養法和溶液覆蓋法都曾用于促進細胞的聚集[7]。轉瓶培養法通過持續攪拌高密度細胞懸液來減小細胞與培養瓶壁之間的接觸，加大細胞與細胞之間的接觸，從而促使細胞聚集成團；溶液覆蓋法則通過瓊脂來防止細胞貼壁。這兩種方法最終只能形成形態不一的細胞球。另一個廣泛運用的方法是懸滴法[8]，通過將細胞包裹在懸滴中來防止細胞與培養皿壁的接觸，再通過重力作用及細胞間的相互作用使細胞在懸滴底部聚集并形成細胞球，此方法獲得的細胞球大小均勻，且可通過操縱懸滴來控制細胞球的大小，而且通過懸滴法還可實現多種細胞的共混培養。此外，還有一種新型技術，采用生物隔膜將 2-D 培養下的細胞轉化為 3-D 培養，隔膜通常采用水凝膠、殼聚糖、透明質酸、海藻酸鈣等生物材料，且這些材料已被證實對細胞的遷移、增殖、分泌等生物功能有促進作用[9]。還有通過熱力釋放 ECM、低速離心等方法誘導細胞聚集[10]。
通常情況下，在低黏附力的培養環境中，細胞與細胞之間先通過整合蛋白與 ECM 的接觸形成一個結構松散的多細胞團塊，之后細胞之間的接觸愈加頻繁，通過鈣黏蛋白相互建立連接，此時原本松散的細胞團塊逐漸壓縮，最終變成致密的多細胞聚合體，即細胞球[11]。但采用有黏附力的生物材料制備細胞球，成球原理則完全不同。細胞先被生物材料黏附，并在材料上伸展，然后再收起偽足變為球形聚集成團[12]。細胞球一旦形成，則可模擬生物體內細胞生存的微環境，細胞與細胞之間由細胞外基質連接，留有一定的間隙可供外界氧氣和養分的供給，以及代謝廢物的排出。此外，與復雜支架模型中的細胞相比，細胞球在顯微鏡下更容易被觀察，更符合實驗需求[8]。
2 MSCs 細胞球的生物學功能
2.1 MSCs 細胞球的多向分化潛能
MSCs 的分化能力與培養基中所添加的生物材料密切相關，不同生物材料具備不同的生物力學，其中彈力和黏附力是決定 MSCs 分化方向的關鍵因素。以脂肪組織為例，有研究[13]發現負壓吸引與靜態懸吊有利于脂肪前體細胞誘導組織再生，而固定與壓迫則抑制再生，組織學結果提示，低張力的微環境更利于脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的增殖與成脂分化。究其原因，學者們進一步研究發現[14]，經原子力顯微鏡檢測出人體成熟脂肪細胞的彈力為（0.9±0.8）kPa，而 ADSCs 的彈力為（2.5±1.2）kPa，高于成熟脂肪細胞。因此，ADSCs 向成熟脂肪細胞分化的過程中需要在低張力環境下降低其彈性力學。所以，彈力較低的生物材料（2～3 kPa）可在體外無化學誘導的環境下促進 ADSCs 的成脂分化。若采用彈力較大的生物材料（11～30 kPa）則會誘導 ADSCs 成軟骨分化[15]。此外，還有研究發現[16]將 3-D 懸浮培養的 MSCs 包埋于無黏附力的透明質酸中，MSCs 的細胞骨架發生改變，具體表現為剛度變低、應力纖維和黏著斑減少，這種改變有利于 MSCs 的成脂分化；反之包埋于黏附力較強的殼聚糖中，其細胞骨架的剛度變高，應力纖維和黏著斑也隨之增多，成脂分化能力受抑制，而成骨分化能力增強。此外，還有研究表明[17]3-D 懸浮培養的 MSCs 細胞球中 Nanog、Sox-2、POU5FI/OCT4 等多能干細胞標記物的表達較貼壁培養的 MSCs 明顯增強，進一步證明了 3-D 成球培養可增強 MSCs 的多向分化潛能。
2.2 MSCs 細胞球的壽命及增殖能力
有研究表明[18]體外 3-D 成球培養可延長 MSCs 的壽命，減緩 MSCs 的老化，具體表現在 3-D 培養的 MSCs 細胞球高表達抗凋亡基因 Bcl-2，低表達促凋亡基因 Bax。Lee 等[19]在小鼠缺血的肢端組織中注射 MSCs 細胞球與貼壁培養的 MSCs 進行比較，結果表明注射 MSCs 細胞球的組織成活面積大于對照組，且經免疫組織化學染色發現注射 MSCs 細胞球的組織中增殖細胞核抗原表達明顯高于對照組。該研究表明 MSCs 細胞球在生物體內移植區中較 MSCs 有更強的增殖能力，若用 MSCs 細胞球替代 MSCs，可優化傳統干細胞療法的治療效果。由此可見，3-D 培養 MSCs 可成為施行干細胞療法前預處理 MSCs、增強細胞活性的一種手段。關于 3-D 培養增強 MSCs 細胞活性和存活能力的機制，目前仍未完全闡明，有學者認為[20]細胞球核心部分細胞處于低氧狀態，正是這種低氧環境下產生的缺氧誘導因子（hypoxic inducible factor，HIF）作用于 MSCs，提高了 MSCs 的多向分化能力以及對缺血缺氧環境的耐受能力；也有學者認為[21]是細胞間接觸增多，信號交換頻繁所致。
2.3 MSCs 細胞球的旁分泌作用
與 2-D 貼壁培養的 MSCs 相比，3-D 培養的 MSCs 細胞球具有更強大的旁分泌作用，其分泌的抗炎因子、細胞生長因子對提高干細胞療法的治療效果有著重要意義。比如，BMSCs 細胞球分泌的抗炎因子 TNF-α 刺激基因 6（TNF-α stimulated gene 6，TSG-6）能有效控制小鼠心肌梗死的炎性反應，保護心肌細胞[6]；MSCs 細胞球通過提高前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）分泌來調控巨噬細胞的活性[22]；IL-24 的分泌能降低腫瘤細胞的活性[23]。此外，MSCs 細胞球旁分泌的多種細胞生長因子如 VEGF、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、FGF、趨化因子受體 4（chemokine receptor 4，CXCR4）、單核細胞趨化蛋白 3、趨化因子 RANTES、基質細胞衍生因子1和血管生成素等，與貼壁培養的 MSCs 相比均有增加[24]。這些細胞因子的釋放對治療缺血性疾病和在組織移植早期快速啟動血管新生都有著重要意義。同時，HGF 的抗纖維化作用及 TGF-β3 減少瘢痕增生作用均已被證實[25]，而 MSCs 細胞球旁分泌 HGF 和 TGF-β3 的能力顯著強于單層貼壁培養的 MSCs[11]，因此 MSCs 細胞球比 MSCs 具有更強大的抑制瘢痕形成的作用。
3 3-D 成球培養法增強 MSCs 生物功能的機制
與傳統的 2-D 貼壁培養 MSCs 相比，3-D 培養的 MSCs 細胞球在分化能力、存活能力、旁分泌能力等多項功能中均表現出顯著優勢。造成這些變化的主要因素在于 3-D 培養下 MSCs 的形態差異、細胞間作用力的增強、ECM 分泌增多和低氧微環境的刺激。近年大量研究證明，這些因素都參與調控 MSCs 的生物功能，并對其調控機制展開了更深層面的研究。
3.1 MSCs形態與細胞骨架的改變
與貼壁培養的 MSCs 相比，3-D 培養的 MSCs 細胞球在細胞形態、細胞骨架、黏附力、張力等屬性上均有著顯著差異，而這些差異正是影響 MSCs 生物學功能的因素。從形態學角度分析，MSCs 細胞球的表層細胞形態規則呈扁平狀，而中央區域的細胞呈不規則的球形。細胞形態對其分化潛力有著重要影響，比如在中央區球形的 MSCs 表面張力較低，表現出向脂肪細胞分化的傾向；而周邊的細胞收縮力大，更容易向骨細胞分化[26]。
3.2 細胞接觸的作用
在探索如何提高移植區 MSCs 的存活率時，有許多學者嘗試采用缺氧預處理 MSCs 提高干細胞對缺血缺氧環境的耐受，采用生物支架給干細胞提供可攀附的基礎，添加生長因子增強干細胞的存活等多種方法，但這些思路都忽視了一個關鍵問題，就是增強細胞間的接觸。3-D 培養的 MSCs 細胞球在這個問題上有極大突破，每個細胞球都可視為一個高密度的細胞集合體，給細胞之間的物質交換提供了良好的微環境。有研究表明[26]MSCs 細胞球中細胞接觸的作用主要表現在鈣黏蛋白信號通路與縫隙連接作用增強，可促進 MSCs 的存活、增殖、分化、旁分泌能力。鈣黏蛋白是一種細胞內黏附蛋白，它可以在組織修復與再生時參與細胞分類及細胞聚集的信號識別[27]。N-鈣黏蛋白在高密度的間葉細胞中高表達，參與細胞的增殖與分化，在動物實驗中人為地抑制 N-鈣黏蛋白表達，則間葉細胞成軟骨分化能力減弱，肢體發育受阻[28]。在體外實驗中，由殼聚糖生物隔膜制備的 MSCs 細胞球中可檢測到 N-鈣黏蛋白和 P-選擇蛋白的表達，兩者與 MSCs 的自我更新以及成脂、成軟骨、成骨分化均有一定聯系[29]。N-鈣黏蛋白除了調控 MSCs 的增殖和分化作用，還可促進細胞因子的分泌。有研究發現[30]，N-鈣黏蛋白能通過活化細胞外信號調節激酶以及加強細胞接觸來促進 VEGF 的分泌。
連接蛋白-43 是重要的縫隙連接蛋白，由細胞接觸增多而產生，在 3-D 培養的 MSCs 細胞球中高表達[31]。連接蛋白-43 已被證實與 MSCs 成脂、成軟骨、成骨分化有著不同的調控作用。在成脂分化早期，連接蛋白-43 表達逐漸增強，而在脂肪細胞成熟過程中逐漸減弱；若抑制連接蛋白-43 表達，則 MSCs 成脂分化受抑制，成骨分化潛能增強；而在成軟骨分化過程中均可檢測到連接蛋白-43 的表達[32]。因此，細胞接觸的增多可同時激活鈣黏蛋白及連接蛋白，對 MSCs 分化能力的調控有著重要意義。
3.3 ECM 的作用
最理想的 MSCs 體外培養模型應具備體內干細胞巢的微環境，ECM 是不可缺少的成分。ECM 是由動物細胞合成并分泌到細胞外、分布在細胞表面或細胞之間的大分子，包括膠原蛋白、黏多糖、層粘連蛋白、纖維連接蛋白、彈性蛋白等[33]。3-D 懸浮培養模式給予 MSCs 更寬裕的生長空間，ECM 的釋放也明顯高于傳統貼壁培養 MSCs，可形成一定規模的 ECM 網[34]。在材料學上，ECM 被視為一種具有生物活性的天然生物材料，它對組織細胞起支撐、保護、營養的作用，為干細胞的增殖、分化、旁分泌提供了舒適的環境，并且通過細胞膜表面的整合蛋白將信號傳入細胞內，系統地調控細胞的生命活動[35]。此外，干細胞療法中單純的干細胞注射療效并不理想，其主要原因之一在于局部炎性反應募集了大量巨噬細胞，巨噬細胞可吞噬部分干細胞，導致治療效果降低。而 ECM 可以充當干細胞療法中對抗巨噬細胞的屏障。近年來，學者們通過大量動物實驗證明，采用 3-D 培養法預處理 MSCs 并以細胞球的形式注入生物體內，可提高移植區的種子細胞密度，增強 MSCs 對炎性細胞吞噬作用及缺血缺氧環境的耐受，提高 MSCs 的存活率及增殖能力，在缺血心肌的修復、軟骨修復及脂肪組織修復中均有突出作用[36]。
3.4 低氧微環境對 MSCs 的作用
MSCs 細胞球是個復雜的多細胞聚合體，細胞球的大小直接關系單個細胞的活性，目前雖然對 3-D 培養 MSCs 細胞球的最適粒徑無權威報道，但學者們普遍認為粒徑過大會損傷 MSCs 的活性，其主要原因在于粒徑過大，中央的細胞難以接受外界營養物質和氧氣的供給，易發生中央區域的細胞壞死[37]。而適當控制細胞球的粒徑可使 MSCs 處于輕度缺氧狀態，反而能增強 MSCs 的抗氧化、抗凋亡能力。因為在低氧微環境中，HIF 的產生可刺激 VEGF、FGF-2、HGF、CXCR4 等細胞因子以及 PGE-2，TSG-6 等抗炎因子的分泌；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和抗凋亡因子 Bcl-2 的高表達，可增強細胞的抗凋亡能力，延長細胞壽命[20]。然而，除了低氧微環境，糖酵解產物如丙酮酸和乳酸也可活化 HIF 的轉錄，并在缺氧環境下維持 HIF 的穩定表達[38]。傳統貼壁培養的 MSCs 因缺乏對移植后這種惡劣微環境的適應而過早凋亡，失去治療能力，而 3-D 成球培養形成的低氧微環境恰好可以模擬臨床上缺血再灌注損傷、難愈性創面、組織移植等病理模型，若在移植前通過 3-D 成球培養預處理，可誘導 MSCs 提前適應低氧環境，激活 HIF、SOD 等多種抗氧化基因，釋放多種促血管化細胞因子及抗炎因子，從而增強移植后 MSCs 的存活率和治療效果。
4 MSCs 細胞球的應用前景
傳統的干細胞療法可視為一種離散的干細胞移植術，移植后干細胞的活性和存活時間均不理想。與之相比，移植 3-D 培養獲得的 MSCs 細胞球具有以下優勢：① MSCs 細胞球可視為一種富含 ECM 的多細胞聚合體，ECM 的富集給干細胞提供了一個適宜的微環境來對抗移植后的短期高強度炎性反應，降低微環境中的細胞毒性。② ECM 與細胞間作用力增強了干細胞移植后的黏附力和存活力，為干細胞定向分化提供了信號傳遞的媒介。③ 干細胞對移植后低氧環境的適應能力增強，在低氧誘導因子的激發下，多種促血管化細胞因子的釋放有利于早期的血管新生和宿主受損組織的保留。基于以上優勢，3-D 培養獲得的 MSCs 細胞球在難愈性創面愈合、缺血組織修復以及組織重塑方面具有廣闊的應用前景。
4.1 MSCs 細胞球在創面及缺血組織修復中的應用前景
在臨床上對于難愈性創面、缺血組織的修復上常采用干細胞療法，即通過細針將干細胞精準注入損傷區域，種子細胞的存活能力、再生能力直接決定最終治療效果。所以我們認為，可在注射前先對種子細胞進行預處理，使零散細胞聚集成團，并以 ECM 和生物材料作為包埋細胞團的生物隔膜，既可營養種子細胞，激發其生物活性，又可在移植后發揮屏障作用抵抗炎性細胞的吞噬，大量細胞因子的釋放還能促進移植區早期血管新生，這正是 3-D 成球培養模式下獲得的 MSCs 細胞球的臨床優勢所在。研究表明，牙齦來源的 MSCs（gingiva derived stem cells，G-MSCs）成球培養后對化療后口腔黏膜炎的治療效果顯著大于貼壁培養的 G-MSCs，且通過靜脈注射 G-MSCs 細胞球發現其具有很強的歸巢能力，可自主向受損組織區域遷移[39]。2015 年日本東京大學 Yoshimura 的研究團隊[40]將透明質酸溶液中形成的 ADSCs 微球注入小鼠缺血再灌注損傷的脂肪墊中，取得了理想的治療效果；同時，該實驗與單純注射 ADSCs 的對照組相比，無論是早期抑制炎性反應和血管新生，還是后期脂肪組織再生方面，均具有突出效果。在腦梗死大鼠模型中[41]，采用頸動脈注射 3-D 成球培養的 MSCs 細胞球同樣獲得了理想治療效果，術后 24 h，MSCs 細胞球組腦組織損傷面積減少了 55%，明顯高出貼壁培養的 MSCs 治療組（27.5%），且術后 14 d MSCs 細胞球組的腦組織保留率高達 72.9%，同樣明顯高出 MSCs 治療組（42.6%）。治療效果顯著提升的原因主要在于注射后受損區域 MSCs 細胞球的高存活率，以及 MSCs 細胞球注射早期降低組織炎性反應以及促進血管新生的作用；該研究還意外發現，單純頸動脈注射貼壁培養 MSCs 的大鼠均出現小動脈栓塞癥狀，造成不同程度視力損傷，還有部分大鼠在注射后出現大腦中動脈栓塞；而這些并發癥在 MSCs 細胞球治療組均未出現。該實驗組認為其主要原因在于細胞體積，MSCs 細胞球的體積較貼壁培養 MSCs 減小了約 40%，故不易造成小動脈栓塞。此研究為提高干細胞血管內注射的治療效果和有效避免并發癥方面提供了有效解決方案。
4.2 MSCs 細胞球在組織工程中的應用前景
MSCs 細胞球在組織重塑及與生物支架復合方面較傳統貼壁培養的 MSCs 更具優勢。根據前文所述，通過對包埋 MSCs 材料剛度、黏附力的調控，可誘導 MSCs 的定向分化。與體外實驗的化學誘導相比，這種生物力學的誘導因素更具臨床應用價值。此外，成球培養的 MSCs 更適合擔當組織工程中的種子細胞，MSCs 細胞球的分化能力、存活能力、旁分泌能力均優于貼壁培養的 MSCs，對于組織缺損的修復有重要價值[42]。這類研究多用于骨組織和軟骨組織的修復，主要表現在 MSCs 細胞球在軟骨內成骨和膜內成骨方面具有突出表現，從而加速骨組織修復。而且，ECM 的作用和細胞間作用力可促進成骨因子的釋放，微環境的改變加速了 MSCs 成骨分化的進程[43]。在軟骨修復模型中有研究發現，MSCs 細胞球憑借其出色的黏附力持久貼附于軟骨缺損部位表面，促進軟骨修復[44]。還有研究將軟骨細胞與滑膜干細胞共混 3-D 成球培養后，注射至軟骨缺損部位，局部微環境中 ECM 的含量顯著增多，修復效率明顯提高[45]。由此可見，3-D 成球培養法可成為修復組織缺損中預處理種子細胞的一種手段，更加高效地誘導組織新生。
5 小結及展望
3-D 培養的 MSCs 細胞球已被證實較傳統貼壁培養的 MSCs 在抗凋亡、抗炎、多向分化及旁分泌細胞因子等生物功能方面均有顯著提升，為臨床上提高干細胞療法的治療效果提供了新的思路。目前，盡管對 3-D 成球培養增強 MSCs 生物活性的機制以及相關信號通路有一定了解，但還有大量問題需要進一步深入研究。比如，在 3-D 培養模式下誘導 MSCs 聚集成球的信號通路；MSCs 細胞球抗凋亡作用的具體機制；MSCs 細胞球細胞骨架與其生物學功能增強有何聯系；3-D 成球培養過程中生物力學的改變影響細胞分化的機制；MSCs 細胞球粒徑控制在什么范圍可達到促進細胞生物活性而不至于導致中央區細胞缺氧壞死的程度，這對建立長期而穩定的 MSCs 3-D 成球培養模式尤為重要。揭開這些問題有助于進一步了解 MSCs 細胞球的理化性質，建立更加穩定的 3-D 成球培養體系，推動 MSCs 細胞球的臨床應用。