引用本文： 黃志峰, 李波, 李強, 黃振飛, 尹博, 馬培, 吳志宏, 邱貴興, 許德榮. 復合透明質酸鈉的硫酸鈣可注射材料促進骨再生的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(6): 730-737. doi: 10.7507/1002-1892.201612145 復制
骨缺損的治療一直是困擾骨科醫生的難題。自體骨和同種異體骨的臨床應用受到取骨量和相關并發癥的限制[1-2]。理想的骨替代材料需要具備生物相容性、骨傳導性、骨誘導性、可降解性和（或）機械支撐作用[1]。研究表明，天然或人工合成的有機聚合物作為骨替代材料，具有較理想的機械性能和成骨性能[3-5]。此外，天然材料還具有良好生物相容性，常用的天然材料有膠原、殼聚糖、絲素蛋白、藻酸鹽和透明質酸等。其中，透明質酸參與并影響了細胞增殖、分化和黏附等多種功能，并在骨與軟骨發育過程中起到重要作用[6]。采用透明質酸鈉制備骨替代材料已獲得廣泛研究[3, 5, 7]。目前，硫酸鈣已用于臨床修復骨缺損[8-9]，但硫酸鈣材料存在降解速度過快和成骨相對延后造成新缺損的風險[10-11]。我們設想將透明質酸鈉溶液和硫酸鈣混合制備成可注射材料，在提高材料成骨性能同時達到微創修復骨缺損的目的。為此，我們進行了本研究，旨在探索硫酸鈣和透明質酸鈉溶液最適混合比例，并進行體內外實驗進行驗證。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
小鼠前成骨細胞株（MC3T3-E1）購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心。5 月齡新西蘭大白兔 12 只，體質量 3.0～3.5 kg，雌雄不限，由中國醫學科學院北京協和醫院實驗動物中心提供；實驗前適應性飼養 1 個月。
0.1% 透明質酸鈉溶液、0.1% 交聯透明質酸鈉溶液（Sakigaku 公司，日本）；硫酸鈣（Sigma-Aldrich 公司，美國）；α-MEM 培養基、雙抗溶液（1% 青霉素/鏈霉素）、FBS、0.05% 胰酶-EDTA、4% 多聚甲醛（GIBCO 公司，美國）；ELISA 試劑盒（Cloud-Clone 公司，美國）；細胞增殖-毒性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8；日本同仁化學研究所）。酶標儀（Thermo 公司，美國）；24 孔離心機（Ependorf 公司，德國）；TE2000-U 倒置相差顯微鏡（Nikon 公司，日本）。
1.2 復合材料制備及穩定性檢測
1.2.1 復合材料制備 參考文獻[12]及實驗前反復調試，確定硫酸鈣粉末和透明質酸鈉溶液比例為 2∶1（W/V）時，所得膏狀物具有良好可注射性以及在液體中的穩定性。因此，本研究選擇該比例進行實驗。于超凈工作臺，將硫酸鈣分別與透明質酸鈉溶液、交聯透明質酸鈉溶液、PBS 溶液，按照 2∶1 比例混合，充分機械攪拌至均勻膏狀，制備 3 種復合材料，分別記作 CA+HA、CA+HAC 以及 CA。全程無菌操作，將獲得的樣本置于密閉無菌容器中備用。
1.2.2 復合材料穩定性檢測 ① 將 3 種復合材料完全浸泡于 PBS 溶液，于 0、24 h 以及 3、7 d 時，肉眼觀察材料形狀變化。② 對 3 種復合材料進行 X 線衍射分析。
1.3 復合材料浸提液制備
取 3 種復合材料，參照 ISO10993-5 中檢測方法[13]，制作浸提液。CA 組：將硫酸鈣和 PBS 溶液混合所得的復合材料浸泡于含 10%FBS 和 1% 雙抗的 α-MEM 培養基中，置于 37℃ 細胞培養箱中 72 h，吸出液體并用直徑為 0.22 μm 的過濾器過濾；取過濾液以離心半徑 14 cm，2 000 r/min 離心 10 min，吸取上清液，置于 4℃ 冰箱中備用。同法制作 CA+HA 組和 CA+HAC 組浸提液，備用。
1.4 小鼠 MC3T3-E1 細胞培養
取小鼠 MC3T3-E1 細胞，用含 10%FBS 和 1% 雙抗的 α-MEM 培養基培養，置于 37℃、5% CO 2 細胞培養箱中，每 3 天換液 1 次；待細胞融合至 90% 左右時進行傳代培養。取第 5 代細胞，以 2.5 mL 0.05% 胰酶-EDTA 溶液消化 5 min，吹打成細胞懸液，以離心半徑 14 cm，1 200 r/min 離心 5 min，棄上清，用培養基吹打細胞制成不同濃度細胞懸液進行以下實驗。
1.5 浸提液對 MC3T3-E1 細胞活力的影響
取制備的 3 種復合材料浸提液，紫外線照射 30 min 再次滅菌。取 MC3T3-E1 細胞懸液計數后接種至 96 孔板，每孔 1×104 個細胞；分別加入 3 種復合材料浸提液進行培養，以單純培養基（含 10%FBS 和 1% 雙抗的 α-MEM 培養基）培養作為對照組。于培養后 6、12、24 h，各組取 3 孔用 CCK-8 試劑盒檢測細胞活性。各孔分別加入 100 μL CCK-8 溶液，30 min 后取上清用酶標儀測量 450 nm 波長處吸光度（A）值，代表細胞活性。
1.6 浸提液對 MC3T3-E1 細胞成骨分化的影響
1.6.1 細胞增殖實驗及浸提液濃度選擇 取含 10%FBS 和 1% 雙抗的 α-MEM 培養基分別與 3 種復合材料浸提液，按照 3∶1、1∶1、1∶3 比例混合，獲得濃度為 25%、50%、75% 的浸提液。取 MC3T3-E1 細胞懸液，計數后接種至 96 孔板，每孔 5×103 個細胞，分別以濃度為 25%、50%、75% 以及 100%（不稀釋）的 3 種復合材料浸提液進行培養，以單純培養基培養作為對照組。置于 37℃、5%CO 2 細胞培養箱中培養，培養 1、3、5 d 各組取 3 孔采用 CCK-8 法檢測細胞活性，操作步驟同 1.5。比較不同濃度浸提液對 MC3T3-E1 細胞促增殖作用差異，選擇最佳濃度進行細胞成骨分化實驗。
1.6.2 MC3T3-E1 細胞成骨分化檢測 取 3 種復合材料，參照 1.3 浸提液制備方法，采用成骨分化培養基（含 50 μg/mL L-抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、100 nmol/L 地塞米松、10%FBS 和 1% 雙抗的 α-MEM 培養基）配置最佳濃度浸提液。取 MC3T3-E1 細胞懸液，計數后接種至 96 孔板，每孔 1×104 個細胞，采用 3 種復合材料最佳濃度浸提液進行培養，以單純成骨分化培養基培養作為對照組。置于 37℃、5%CO 2 細胞培養箱中培養，每 2 天更換 1 次培養基。于培養 1、7、14、21 d 吸取上清培養液，用 ELISA 試劑盒檢測培養液中 ALP、Ⅰ型膠原（colla-gen typeⅠ，COL-Ⅰ）及骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）濃度。
1.7 復合材料體內成骨作用觀察
取 12 只新西蘭大白兔，參照文獻[14]方法制作股骨髁骨缺損模型。首先，耳緣靜脈注射 10% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，于雙膝關節外側作切口，逐層切開，顯露股骨髁外髁并鉆孔（直徑 6 mm、深 10 mm）。然后，隨機取 6 只動物，一側下肢骨缺損處注入 CA；另一側不作處理，作為空白對照；另 6 只動物一側下肢骨缺損處注入 CA+HA，另一側注入 CA+HAC。
植入后 6、12 周各取 6 只動物，各組3個樣本。采用過量麻醉法處死后，取出股骨下段標本。首先行 Micro-CT 掃描，觀察骨缺損區成骨情況，選擇感興趣區域計算骨組織占組織體積的百分比（bone volume/tissue volume，BV/TV）；然后將標本浸泡于 4% 多聚甲醛溶液中，脫鈣，制備石蠟切片，常規行 HE 染色，光鏡下觀察缺損區骨組織形成情況。
1.8 統計學方法
采用 GraphPad Prism 軟件進行統計分析。數據以均數±標準差表示；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Bonforroni 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 復合材料穩定性檢測
將 3 種復合材料浸泡至 PBS 溶液后，CA 立即發生潰散；CA+HA 及 CA+HAC 浸泡至 7 d 時僅發生膨脹，均無明顯潰散，保持穩定性。見圖 1。
圖1
各組復合材料浸泡于 PBS 溶液后形態觀察
從左至右分別為 0、24 h 及 3、7 d a. CA；b. CA+HA；c. CA+HAC
Figure1. Stability of materials in PBSFrom left to right for 0 hour, 24 hours, 3 days, and 7 days a. CA; b. CA+HA; c. CA+HAC
X 線衍射分析顯示，3 種復合材料衍射光譜均與 CaSO 4·2H 2O 保持一致，提示硫酸鈣和透明質酸鈉或者交聯透明質酸鈉混合后，未發生化學反應生成新的物質。見圖 2。
圖2
CA+HA X 線衍射分析比對結果
上：CA+HA；下：CaSO4·2H2O
Figure2. X-ray diffraction analysis result of CA+HAUpper for CA+HA; lower for CaSO4·2H2O
2.2 浸提液對 MC3T3-E1 細胞活力的影響
培養 6、12、24 h，CA 組 A 值均低于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；CA+HA 組、CA+HAC 組A 值與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；CA+HA 組A 值高于 CA 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；CA+HAC 組與 CA 組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
CCK-8 法檢測各組細胞活性
Figure3.
CCK-8 results for biocompatibility
2.3 浸提液對 MC3T3-E1 細胞增殖的影響
3 種復合材料相同濃度的浸提液培養細胞后，細胞增殖變化趨勢一致。見圖 4。取培養 5 d 時各組檢測數據進行比較分析。其中，25%、50% 濃度浸提液培養 5 d 時 CA 組、CA+HA 組和 CA+HAC 組 A 值均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。75%、100% 濃度浸提液培養 5 d 時 CA+HA 組A 值高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；CA+HAC 組和 CA 組A 值雖高于對照組，但差異無統計學意義（P>0.05）。綜合檢測結果，選擇 50% 濃度浸提液進行后續實驗。
圖4
CCK-8 法檢測不同濃度復合材料浸提液對細胞增殖活性的影響
a. 25% 濃度組；b. 50% 濃度組；c. 75% 濃度組；d. 100% 濃度組
Figure4. Effects of extracts with different concentrations on proliferation of MC3T3-E1 cells by CCK-8a. 25% extracts; b. 50% extracts; c. 75% extracts; d. 100% extracts
2.4 MC3T3-E1 細胞成骨分化檢測
CA 組 ALP 濃度于 14 d 達峰值，21 d 略降低；其余各組 ALP 濃度均呈逐漸增加趨勢。培養 14、21 d 時，CA+HA 組、CA+HAC 組 ALP 濃度均顯著高于對照組、CA 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；其余各時間點各組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 5a。
圖5
ELISA 檢測各組成骨標志物濃度
a. ALP；b. COL-Ⅰ；c. OCN
Figure5. Osteogenic biomarker concentrations at different time points by ELISAa. ALP; b. COL-I; c. OCN
CA 組 COL-Ⅰ濃度于 14 d 達峰值，21 d 略降低；其余各組 COL-Ⅰ濃度均呈逐漸增加趨勢。培養 14 d 時，CA 組、CA+HA 組、CA+HAC 組 COL-Ⅰ濃度均顯著高于對照組，21 d 時 CA+HA 組、CA+HAC 組 COL-Ⅰ濃度亦顯著高于對照組、CA 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；其余各時間點各組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 5b。
除 CA 組外，其余各組 OCN 濃度均呈逐漸增加趨勢。14、21 d 時 CA+HA 組、CA+HAC 組 OCN 濃度均顯著高于對照組和 CA 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；其余各時間點各組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 5c。
2.5 材料體內成骨作用觀察
2.5.1 Micro-CT 觀察 6、12 周，空白對照組無明顯成骨，其余各組新生骨小梁均逐漸增加，其中 CA 組新生骨小梁明顯少于 CA+HA 組和 CA+HAC 組。見圖 6。 6 周時，CA 組、CA+HA 組和 CA+HAC 組 BV/TV 分別為 0.47%±0.07%、2.85%±0.59%、4.65%±1.56%；12 周時分別為 15.33%±2.81%、19.70%±3.22%、22.46%±3.17%。組內比較，各組 12 周時 BV/TV 均較 6 周時提高，比較差異有統計學意義（P<0.05）。組間比較，6、12 周時 CA+HA 組、CA+HAC 組均高于 CA 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；CA+HA 組和 CA+HAC 組間差異無統計學意義（P>0.05）。
圖6
植入后 6、12 周各組 Mirco-CT 觀察
從左至右分別為空白對照組、CA 組、CA+HA 組和 CA+HAC 組 箭頭示植入材料區域 a. 植入 6 周；b. 植入 12 周
Figure6. Micro-CT results in each group at 6 and 12 weeksFrom left to right for control, CA, CA+HA, and CA+HAC groups Arrow indicated implants a. At 6 weeks; b. At 12 weeks
2.5.2 HE 染色觀察 6 周時，CA 組缺損處無成形骨組織，CA+HA 組、CA+HAC 組可見少量新生類骨小梁組織；12 周時，CA 組可見到細條索狀骨組織形成，CA+HA 組和 CA+HAC 組均見條索狀骨組織，明顯優于 CA 組，但兩組間無顯著差異（圖 7）。
圖7
植入后 6、12 周各組 HE 染色觀察（×40）
從左至右分別為 CA 組、CA+HA 組、CA+HAC 組 箭頭示條索狀新生骨 a. 植入 6 周；b. 植入 12 周
Figure7. HE staining observation in each group at 6 and 12 weeks (×40)From left to right for CA, CA+HA, and CA+HAC groups Arrow indicated streak new bone a. At 6 weeks; b. At 12 weeks
3 討論
理想的骨替代材料應具有良好生物相容性、骨傳導性、骨誘導性和生物降解能力[1, 15]。骨骼由有機物和無機物組成，所以人工骨替代材料往往為無機材料和有機材料的混合物[3-5, 16-17]，可以制備成顆粒、塊狀固體和軟膏狀等。可注射材料由于可以微創操作，縮短了手術時間、減少創傷和醫療費用[18]，日益受到研究者的重視。
本研究選擇已用于臨床的硫酸鈣粉劑和透明質酸鈉溶液，按照 2∶1（W/V）比例混合，成功制備可注射骨替代材料。本研究選擇該比例是基于保持材料可注射性基礎上盡可能增加固體比例考慮，與文獻報道的比例[14, 18]一致。我們認為本研究采用的復合材料制備方法其優點是取材便捷、經濟、制作簡便。經 X 線衍射分析證實，制備的復合材料無新物質生成，提示材料組分安全。
因制備的復合材料為膏狀，無法在培養板底部形成一個均勻形態供細胞附著；另外材料組分可以與 CCK-8 顯色試劑反應，會影響 A 值檢測結果，所以我們選擇材料浸提液進行生物相容性以及促成骨分化相關研究。檢測結果顯示，本研究制作的復合材料具有良好生物相容性和促進小鼠 MC3T3-E1 細胞增殖和成骨分化的能力。分析其機制可能有以下 3 點：① 硫酸鈣成骨作用。醫用硫酸鈣特殊的晶體結構可以阻止軟組織長入，為血管和成骨細胞的長入提供基質。有學者認為硫酸鈣在周圍有骨或骨膜存在的情況下，具有刺激骨再生的作用[6, 19]。成骨細胞可以附著于硫酸鈣，并在此基礎上成骨；而破骨細胞會吸收硫酸鈣，形成生物降解。硫酸鈣加速骨形成可能與局部溶解后鈣離子濃度提高有關[20]。如果有鈣鹽存在，磷酸酶就能促使局部聚集的鈣離子增加，在適宜生物基礎條件下，如存在生長因子和成骨細胞，就能加速骨形成。有學者在硫酸鈣的基礎上加入鋰鎂金屬[21]，來防止硫酸鈣降解過程中周圍環境 pH 值下降，復合材料具有良好的成血管效應和成骨分化作用。
② 透明質酸的支架效應。透明質酸具有三維多孔結構，有利于植入短期內實現豐富的血管再生，使支架材料形成充足的支持結構，可作為一種良好的骨誘導支架材料[22]。透明質酸交聯后形成的網狀結構，為細胞提供了類似細胞外基質的微環境，有利于細胞的黏附和生長，也有利于細胞間信號的傳導[23-24]。
③ 透明質酸的分子信號效應。透明質酸可以和多種分子相互作用，如蛋白聚糖、神經聚糖和多能聚糖等；還可作用于多種受體，如 CD44（細胞表面糖蛋白）、透明質酸介導的運動受體（receptor for hyaluronan-mediated motility，RHAMM）、toll樣受體（toll-like receptor，TLRs）、透明質酸胞吞受體、細胞間黏附分子 1 和淋巴內皮透明質酸受體。其中 CD44、RHAMM 和 TLRs 由間充質細胞表達。CD44 是 HA 的主要受體[25-26]，參與細胞增殖、分化和運動等多種功能，在骨與軟骨代謝、炎性反應和腫瘤生成等過程中發揮重要作用。RHAMM 是 HA 的另一重要受體[27]，影響細胞運動并在細胞和生長因子相互作用的過程中發揮關鍵調節作用。敲除 CD44 基因后，RHAMM 基因可起到代償作用。TLRs 參與 HA 對于 BMSCs 的信號調節[28]。HA 作用于 CD44 與 RHAMM 受體，促進間充質細胞向骨與軟骨細胞分化。HA 能早期誘導 ALP 分泌，上調骨鈣素基因表達水平，且可與 DEX、hBMP-2 相互作用影響細胞增殖與分化。本研究結果顯示，透明質酸鈉復合硫酸鈣后可以加速骨形成，其促進成骨的分子機制，可能和鈣離子的協同作用有關，仍需進一步研究來證實。
綜上述，本研究通過將硫酸鈣和透明質酸鈉（或其交聯產品）溶液以 2∶1（W/V）比例混合后，成功制備可注射性骨替代材料。該復合材料具有良好生物相容性，具有促進小鼠前成骨細胞增殖以及分化的作用；將其植入新西蘭大白兔體內后，具有優于單純硫酸鈣的成骨能力。作為一種潛在的骨替代材料，有望應用于骨缺損性疾病的治療。
骨缺損的治療一直是困擾骨科醫生的難題。自體骨和同種異體骨的臨床應用受到取骨量和相關并發癥的限制[1-2]。理想的骨替代材料需要具備生物相容性、骨傳導性、骨誘導性、可降解性和（或）機械支撐作用[1]。研究表明，天然或人工合成的有機聚合物作為骨替代材料，具有較理想的機械性能和成骨性能[3-5]。此外，天然材料還具有良好生物相容性，常用的天然材料有膠原、殼聚糖、絲素蛋白、藻酸鹽和透明質酸等。其中，透明質酸參與并影響了細胞增殖、分化和黏附等多種功能，并在骨與軟骨發育過程中起到重要作用[6]。采用透明質酸鈉制備骨替代材料已獲得廣泛研究[3, 5, 7]。目前，硫酸鈣已用于臨床修復骨缺損[8-9]，但硫酸鈣材料存在降解速度過快和成骨相對延后造成新缺損的風險[10-11]。我們設想將透明質酸鈉溶液和硫酸鈣混合制備成可注射材料，在提高材料成骨性能同時達到微創修復骨缺損的目的。為此，我們進行了本研究，旨在探索硫酸鈣和透明質酸鈉溶液最適混合比例，并進行體內外實驗進行驗證。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
小鼠前成骨細胞株（MC3T3-E1）購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心。5 月齡新西蘭大白兔 12 只，體質量 3.0～3.5 kg，雌雄不限，由中國醫學科學院北京協和醫院實驗動物中心提供；實驗前適應性飼養 1 個月。
0.1% 透明質酸鈉溶液、0.1% 交聯透明質酸鈉溶液（Sakigaku 公司，日本）；硫酸鈣（Sigma-Aldrich 公司，美國）；α-MEM 培養基、雙抗溶液（1% 青霉素/鏈霉素）、FBS、0.05% 胰酶-EDTA、4% 多聚甲醛（GIBCO 公司，美國）；ELISA 試劑盒（Cloud-Clone 公司，美國）；細胞增殖-毒性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8；日本同仁化學研究所）。酶標儀（Thermo 公司，美國）；24 孔離心機（Ependorf 公司，德國）；TE2000-U 倒置相差顯微鏡（Nikon 公司，日本）。
1.2 復合材料制備及穩定性檢測
1.2.1 復合材料制備 參考文獻[12]及實驗前反復調試，確定硫酸鈣粉末和透明質酸鈉溶液比例為 2∶1（W/V）時，所得膏狀物具有良好可注射性以及在液體中的穩定性。因此，本研究選擇該比例進行實驗。于超凈工作臺，將硫酸鈣分別與透明質酸鈉溶液、交聯透明質酸鈉溶液、PBS 溶液，按照 2∶1 比例混合，充分機械攪拌至均勻膏狀，制備 3 種復合材料，分別記作 CA+HA、CA+HAC 以及 CA。全程無菌操作，將獲得的樣本置于密閉無菌容器中備用。
1.2.2 復合材料穩定性檢測 ① 將 3 種復合材料完全浸泡于 PBS 溶液，于 0、24 h 以及 3、7 d 時，肉眼觀察材料形狀變化。② 對 3 種復合材料進行 X 線衍射分析。
1.3 復合材料浸提液制備
取 3 種復合材料，參照 ISO10993-5 中檢測方法[13]，制作浸提液。CA 組：將硫酸鈣和 PBS 溶液混合所得的復合材料浸泡于含 10%FBS 和 1% 雙抗的 α-MEM 培養基中，置于 37℃ 細胞培養箱中 72 h，吸出液體并用直徑為 0.22 μm 的過濾器過濾；取過濾液以離心半徑 14 cm，2 000 r/min 離心 10 min，吸取上清液，置于 4℃ 冰箱中備用。同法制作 CA+HA 組和 CA+HAC 組浸提液，備用。
1.4 小鼠 MC3T3-E1 細胞培養
取小鼠 MC3T3-E1 細胞，用含 10%FBS 和 1% 雙抗的 α-MEM 培養基培養，置于 37℃、5% CO 2 細胞培養箱中，每 3 天換液 1 次；待細胞融合至 90% 左右時進行傳代培養。取第 5 代細胞，以 2.5 mL 0.05% 胰酶-EDTA 溶液消化 5 min，吹打成細胞懸液，以離心半徑 14 cm，1 200 r/min 離心 5 min，棄上清，用培養基吹打細胞制成不同濃度細胞懸液進行以下實驗。
1.5 浸提液對 MC3T3-E1 細胞活力的影響
取制備的 3 種復合材料浸提液，紫外線照射 30 min 再次滅菌。取 MC3T3-E1 細胞懸液計數后接種至 96 孔板，每孔 1×104 個細胞；分別加入 3 種復合材料浸提液進行培養，以單純培養基（含 10%FBS 和 1% 雙抗的 α-MEM 培養基）培養作為對照組。于培養后 6、12、24 h，各組取 3 孔用 CCK-8 試劑盒檢測細胞活性。各孔分別加入 100 μL CCK-8 溶液，30 min 后取上清用酶標儀測量 450 nm 波長處吸光度（A）值，代表細胞活性。
1.6 浸提液對 MC3T3-E1 細胞成骨分化的影響
1.6.1 細胞增殖實驗及浸提液濃度選擇 取含 10%FBS 和 1% 雙抗的 α-MEM 培養基分別與 3 種復合材料浸提液，按照 3∶1、1∶1、1∶3 比例混合，獲得濃度為 25%、50%、75% 的浸提液。取 MC3T3-E1 細胞懸液，計數后接種至 96 孔板，每孔 5×103 個細胞，分別以濃度為 25%、50%、75% 以及 100%（不稀釋）的 3 種復合材料浸提液進行培養，以單純培養基培養作為對照組。置于 37℃、5%CO 2 細胞培養箱中培養，培養 1、3、5 d 各組取 3 孔采用 CCK-8 法檢測細胞活性，操作步驟同 1.5。比較不同濃度浸提液對 MC3T3-E1 細胞促增殖作用差異，選擇最佳濃度進行細胞成骨分化實驗。
1.6.2 MC3T3-E1 細胞成骨分化檢測 取 3 種復合材料，參照 1.3 浸提液制備方法，采用成骨分化培養基（含 50 μg/mL L-抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、100 nmol/L 地塞米松、10%FBS 和 1% 雙抗的 α-MEM 培養基）配置最佳濃度浸提液。取 MC3T3-E1 細胞懸液，計數后接種至 96 孔板，每孔 1×104 個細胞，采用 3 種復合材料最佳濃度浸提液進行培養，以單純成骨分化培養基培養作為對照組。置于 37℃、5%CO 2 細胞培養箱中培養，每 2 天更換 1 次培養基。于培養 1、7、14、21 d 吸取上清培養液，用 ELISA 試劑盒檢測培養液中 ALP、Ⅰ型膠原（colla-gen typeⅠ，COL-Ⅰ）及骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）濃度。
1.7 復合材料體內成骨作用觀察
取 12 只新西蘭大白兔，參照文獻[14]方法制作股骨髁骨缺損模型。首先，耳緣靜脈注射 10% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，于雙膝關節外側作切口，逐層切開，顯露股骨髁外髁并鉆孔（直徑 6 mm、深 10 mm）。然后，隨機取 6 只動物，一側下肢骨缺損處注入 CA；另一側不作處理，作為空白對照；另 6 只動物一側下肢骨缺損處注入 CA+HA，另一側注入 CA+HAC。
植入后 6、12 周各取 6 只動物，各組3個樣本。采用過量麻醉法處死后，取出股骨下段標本。首先行 Micro-CT 掃描，觀察骨缺損區成骨情況，選擇感興趣區域計算骨組織占組織體積的百分比（bone volume/tissue volume，BV/TV）；然后將標本浸泡于 4% 多聚甲醛溶液中，脫鈣，制備石蠟切片，常規行 HE 染色，光鏡下觀察缺損區骨組織形成情況。
1.8 統計學方法
采用 GraphPad Prism 軟件進行統計分析。數據以均數±標準差表示；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Bonforroni 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 復合材料穩定性檢測
將 3 種復合材料浸泡至 PBS 溶液后，CA 立即發生潰散；CA+HA 及 CA+HAC 浸泡至 7 d 時僅發生膨脹，均無明顯潰散，保持穩定性。見圖 1。
圖1
各組復合材料浸泡于 PBS 溶液后形態觀察
從左至右分別為 0、24 h 及 3、7 d a. CA；b. CA+HA；c. CA+HAC
Figure1. Stability of materials in PBSFrom left to right for 0 hour, 24 hours, 3 days, and 7 days a. CA; b. CA+HA; c. CA+HAC
X 線衍射分析顯示，3 種復合材料衍射光譜均與 CaSO 4·2H 2O 保持一致，提示硫酸鈣和透明質酸鈉或者交聯透明質酸鈉混合后，未發生化學反應生成新的物質。見圖 2。
圖2
CA+HA X 線衍射分析比對結果
上：CA+HA；下：CaSO4·2H2O
Figure2. X-ray diffraction analysis result of CA+HAUpper for CA+HA; lower for CaSO4·2H2O
2.2 浸提液對 MC3T3-E1 細胞活力的影響
培養 6、12、24 h，CA 組 A 值均低于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；CA+HA 組、CA+HAC 組A 值與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；CA+HA 組A 值高于 CA 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；CA+HAC 組與 CA 組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
CCK-8 法檢測各組細胞活性
Figure3.
CCK-8 results for biocompatibility
2.3 浸提液對 MC3T3-E1 細胞增殖的影響
3 種復合材料相同濃度的浸提液培養細胞后，細胞增殖變化趨勢一致。見圖 4。取培養 5 d 時各組檢測數據進行比較分析。其中，25%、50% 濃度浸提液培養 5 d 時 CA 組、CA+HA 組和 CA+HAC 組 A 值均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。75%、100% 濃度浸提液培養 5 d 時 CA+HA 組A 值高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；CA+HAC 組和 CA 組A 值雖高于對照組，但差異無統計學意義（P>0.05）。綜合檢測結果，選擇 50% 濃度浸提液進行后續實驗。
圖4
CCK-8 法檢測不同濃度復合材料浸提液對細胞增殖活性的影響
a. 25% 濃度組；b. 50% 濃度組；c. 75% 濃度組；d. 100% 濃度組
Figure4. Effects of extracts with different concentrations on proliferation of MC3T3-E1 cells by CCK-8a. 25% extracts; b. 50% extracts; c. 75% extracts; d. 100% extracts
2.4 MC3T3-E1 細胞成骨分化檢測
CA 組 ALP 濃度于 14 d 達峰值，21 d 略降低；其余各組 ALP 濃度均呈逐漸增加趨勢。培養 14、21 d 時，CA+HA 組、CA+HAC 組 ALP 濃度均顯著高于對照組、CA 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；其余各時間點各組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 5a。
圖5
ELISA 檢測各組成骨標志物濃度
a. ALP；b. COL-Ⅰ；c. OCN
Figure5. Osteogenic biomarker concentrations at different time points by ELISAa. ALP; b. COL-I; c. OCN
CA 組 COL-Ⅰ濃度于 14 d 達峰值，21 d 略降低；其余各組 COL-Ⅰ濃度均呈逐漸增加趨勢。培養 14 d 時，CA 組、CA+HA 組、CA+HAC 組 COL-Ⅰ濃度均顯著高于對照組，21 d 時 CA+HA 組、CA+HAC 組 COL-Ⅰ濃度亦顯著高于對照組、CA 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；其余各時間點各組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 5b。
除 CA 組外，其余各組 OCN 濃度均呈逐漸增加趨勢。14、21 d 時 CA+HA 組、CA+HAC 組 OCN 濃度均顯著高于對照組和 CA 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；其余各時間點各組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 5c。
2.5 材料體內成骨作用觀察
2.5.1 Micro-CT 觀察 6、12 周，空白對照組無明顯成骨，其余各組新生骨小梁均逐漸增加，其中 CA 組新生骨小梁明顯少于 CA+HA 組和 CA+HAC 組。見圖 6。 6 周時，CA 組、CA+HA 組和 CA+HAC 組 BV/TV 分別為 0.47%±0.07%、2.85%±0.59%、4.65%±1.56%；12 周時分別為 15.33%±2.81%、19.70%±3.22%、22.46%±3.17%。組內比較，各組 12 周時 BV/TV 均較 6 周時提高，比較差異有統計學意義（P<0.05）。組間比較，6、12 周時 CA+HA 組、CA+HAC 組均高于 CA 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；CA+HA 組和 CA+HAC 組間差異無統計學意義（P>0.05）。
圖6
植入后 6、12 周各組 Mirco-CT 觀察
從左至右分別為空白對照組、CA 組、CA+HA 組和 CA+HAC 組 箭頭示植入材料區域 a. 植入 6 周；b. 植入 12 周
Figure6. Micro-CT results in each group at 6 and 12 weeksFrom left to right for control, CA, CA+HA, and CA+HAC groups Arrow indicated implants a. At 6 weeks; b. At 12 weeks
2.5.2 HE 染色觀察 6 周時，CA 組缺損處無成形骨組織，CA+HA 組、CA+HAC 組可見少量新生類骨小梁組織；12 周時，CA 組可見到細條索狀骨組織形成，CA+HA 組和 CA+HAC 組均見條索狀骨組織，明顯優于 CA 組，但兩組間無顯著差異（圖 7）。
圖7
植入后 6、12 周各組 HE 染色觀察（×40）
從左至右分別為 CA 組、CA+HA 組、CA+HAC 組 箭頭示條索狀新生骨 a. 植入 6 周；b. 植入 12 周
Figure7. HE staining observation in each group at 6 and 12 weeks (×40)From left to right for CA, CA+HA, and CA+HAC groups Arrow indicated streak new bone a. At 6 weeks; b. At 12 weeks
3 討論
理想的骨替代材料應具有良好生物相容性、骨傳導性、骨誘導性和生物降解能力[1, 15]。骨骼由有機物和無機物組成，所以人工骨替代材料往往為無機材料和有機材料的混合物[3-5, 16-17]，可以制備成顆粒、塊狀固體和軟膏狀等。可注射材料由于可以微創操作，縮短了手術時間、減少創傷和醫療費用[18]，日益受到研究者的重視。
本研究選擇已用于臨床的硫酸鈣粉劑和透明質酸鈉溶液，按照 2∶1（W/V）比例混合，成功制備可注射骨替代材料。本研究選擇該比例是基于保持材料可注射性基礎上盡可能增加固體比例考慮，與文獻報道的比例[14, 18]一致。我們認為本研究采用的復合材料制備方法其優點是取材便捷、經濟、制作簡便。經 X 線衍射分析證實，制備的復合材料無新物質生成，提示材料組分安全。
因制備的復合材料為膏狀，無法在培養板底部形成一個均勻形態供細胞附著；另外材料組分可以與 CCK-8 顯色試劑反應，會影響 A 值檢測結果，所以我們選擇材料浸提液進行生物相容性以及促成骨分化相關研究。檢測結果顯示，本研究制作的復合材料具有良好生物相容性和促進小鼠 MC3T3-E1 細胞增殖和成骨分化的能力。分析其機制可能有以下 3 點：① 硫酸鈣成骨作用。醫用硫酸鈣特殊的晶體結構可以阻止軟組織長入，為血管和成骨細胞的長入提供基質。有學者認為硫酸鈣在周圍有骨或骨膜存在的情況下，具有刺激骨再生的作用[6, 19]。成骨細胞可以附著于硫酸鈣，并在此基礎上成骨；而破骨細胞會吸收硫酸鈣，形成生物降解。硫酸鈣加速骨形成可能與局部溶解后鈣離子濃度提高有關[20]。如果有鈣鹽存在，磷酸酶就能促使局部聚集的鈣離子增加，在適宜生物基礎條件下，如存在生長因子和成骨細胞，就能加速骨形成。有學者在硫酸鈣的基礎上加入鋰鎂金屬[21]，來防止硫酸鈣降解過程中周圍環境 pH 值下降，復合材料具有良好的成血管效應和成骨分化作用。
② 透明質酸的支架效應。透明質酸具有三維多孔結構，有利于植入短期內實現豐富的血管再生，使支架材料形成充足的支持結構，可作為一種良好的骨誘導支架材料[22]。透明質酸交聯后形成的網狀結構，為細胞提供了類似細胞外基質的微環境，有利于細胞的黏附和生長，也有利于細胞間信號的傳導[23-24]。
③ 透明質酸的分子信號效應。透明質酸可以和多種分子相互作用，如蛋白聚糖、神經聚糖和多能聚糖等；還可作用于多種受體，如 CD44（細胞表面糖蛋白）、透明質酸介導的運動受體（receptor for hyaluronan-mediated motility，RHAMM）、toll樣受體（toll-like receptor，TLRs）、透明質酸胞吞受體、細胞間黏附分子 1 和淋巴內皮透明質酸受體。其中 CD44、RHAMM 和 TLRs 由間充質細胞表達。CD44 是 HA 的主要受體[25-26]，參與細胞增殖、分化和運動等多種功能，在骨與軟骨代謝、炎性反應和腫瘤生成等過程中發揮重要作用。RHAMM 是 HA 的另一重要受體[27]，影響細胞運動并在細胞和生長因子相互作用的過程中發揮關鍵調節作用。敲除 CD44 基因后，RHAMM 基因可起到代償作用。TLRs 參與 HA 對于 BMSCs 的信號調節[28]。HA 作用于 CD44 與 RHAMM 受體，促進間充質細胞向骨與軟骨細胞分化。HA 能早期誘導 ALP 分泌，上調骨鈣素基因表達水平，且可與 DEX、hBMP-2 相互作用影響細胞增殖與分化。本研究結果顯示，透明質酸鈉復合硫酸鈣后可以加速骨形成，其促進成骨的分子機制，可能和鈣離子的協同作用有關，仍需進一步研究來證實。
綜上述，本研究通過將硫酸鈣和透明質酸鈉（或其交聯產品）溶液以 2∶1（W/V）比例混合后，成功制備可注射性骨替代材料。該復合材料具有良好生物相容性，具有促進小鼠前成骨細胞增殖以及分化的作用；將其植入新西蘭大白兔體內后，具有優于單純硫酸鈣的成骨能力。作為一種潛在的骨替代材料，有望應用于骨缺損性疾病的治療。
