引用本文： 邢飛, 李浪, 劉明, 段鑫, 龍也, 項舟. 原位組織工程技術在骨與軟骨修復領域的應用進展. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(10): 1358-1364. doi: 10.7507/1002-1892.201712118 復制
對于由創傷、退變、感染、遺傳、腫瘤等多種原因引起的大段骨缺損與大面積軟骨缺損，一直是臨床骨科醫生需要面對的治療難題之一。目前，臨床中骨缺損與軟骨缺損的治療主要依靠自體/異體骨移植、骨搬運、骨膜移植等治療手段，但這些手段存在治療周期長、手術創傷大、免疫排斥、失敗率高等缺點[1]。而以細胞生物學、材料科學、工程學為基礎發展起來的組織工程技術為骨與軟骨缺損的治療提供了一個新的方向[2]。組織工程技術主要是通過體外分離培養獲得種子細胞，并將其接種于支架材料上構建組織工程修復材料并植入骨與軟骨缺損處進行修復。但體外構建組織工程骨與軟骨修復材料往往需要經歷長時間種子細胞的分離、培養、擴增等過程。同時，同種異體種子細胞移植同樣存在一定的免疫炎性反應。隨著生物材料技術以及相關再生醫學技術的發展，為了彌補傳統組織工程的不足，組織工程學者提出了“原位組織工程”這一新概念。原位組織工程又稱原位誘導再生，是指避免應用外來種子細胞，利用生物支架材料的理化性質與體內微環境相互作用誘導自體細胞遷移、黏附，同時促進細胞在支架材料上增殖分化，從而實現組織缺損的原位再生。原位誘導再生的特點包括：① 未添加外源性種子細胞，避免免疫排斥反應的發生；② 利用自體體內細胞進行修復，避免體外長期分離培養種子細胞時間久、易污染的情況發生；③ 將生物體當成一個完整的生物反應器，充分利用體內微環境進行組織缺損的修復[3]。近年來，利用原位組織工程技術構建的相關生物材料，在治療骨、軟骨、皮膚、神經等多種組織缺損方面展現出了良好的修復效果，為解決臨床中骨與軟骨缺損治療難題提供了一定的理論依據[4]。現將原位組織工程技術在骨與軟骨修復領域的研究進展綜述如下。
1 原位組織工程三要素
1.1 種子細胞
原位組織工程技術雖然無需引入外源性種子細胞，但需募集自體內有修復能力的種子細胞。BMSCs 由于其良好的增殖活性和多向分化能力，是最早應用于組織工程修復領域的種子細胞。研究證明[5]BMSCs 在創傷條件下可以動員進入外周血，最終歸巢至組織缺損區域進行組織修復。Fu 等[6]發現應用集落刺激因子和半胱氨酸-其他氨基酸-半胱氨酸趨化因子受體（Cys-X-Cys chemokine receptor，CXCR）拮抗劑（AMD3100）等藥物，同樣可以促進 BMSCs 動員進入外周血當中。在骨與軟骨缺損修復領域，BMSCs 不僅具備良好的成骨和成軟骨分化能力，并且是最易動員募集到缺損區域進行修復的一種干細胞。目前大量研究主要集中在利用多種不同的方法，募集動員 BMSCs 進入骨與軟骨缺損區域進行組織修復[7-8]。
骨膜是包被在長骨干表面的一層特殊結締組織，包含有成骨細胞、成纖維細胞等骨膜來源細胞，在臨床上可應用于大面積軟骨缺損的治療。研究發現骨膜來源細胞（periosteum-derived cells，PDCs）可以分化為成骨細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞，比 BMSCs 具備更高的增殖活性，同時可以表達 CD29、CD140 等典型 MSCs 表面標記，因此理論上可以應用 PDCs 進行組織工程修復[9]。在骨折發生后的早期過程中，機體自發開始骨膜動員，骨折周圍骨膜開始增厚，產生自發炎性反應，骨膜內 PDCs 開始增殖、分化為成骨細胞參與骨修復過程[10]。因此 PDCs 是在原位組織工程中一種具備廣大應用前景的成骨前體細胞。但目前有關 PDCs 的研究報道相對較少，其有效性仍需要進一步探索發現。
組織工程骨修復材料的關鍵問題在于如何促進修復材料的血管化，因此許多研究者利用相關物理化學方法募集動員內皮細胞至骨缺損部位，促進骨修復材料的血管化[11-13]。然而，內皮細胞作為一種成熟的體外終末分化細胞，存在易老化、存活力低、黏附能力弱等缺點。內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）主要存在于骨髓中，作為內皮細胞的前體細胞，具備增殖能力強、易分化等特點。目前有研究嘗試通過相關技術手段募集動員骨髓中的 EPCs，應用于原位組織工程修復中[14-15]。但如何高效持續大量地動員體內種子細胞至組織缺損部位進行修復，依然是亟待解決的一個難題。
1.2 細胞因子
細胞因子在原位組織工程中起著誘導細胞趨化遷移、促進增殖分化等作用，還可以特異性地與細胞表面相關分子受體結合，促進細胞黏附。許多因子對干細胞的遷移趨化起著十分重要的作用。基質細胞衍生因子（stromal-derived factor，SDF）是目前研究應用最多的一種細胞趨化因子。SDF-1α 又稱半胱氨酸-其他氨基酸-半胱氨酸趨化因子配體 12（Cys-X-Cys chemokine ligand 12，CXCL12），是一種促進自身宿主細胞遷移的細胞因子，可以特異性結合細胞膜上受體 CXCR4，對 MSCs、內皮祖細胞、造血干細胞、神經干細胞、平滑肌前體細胞等細胞進行募集趨化[16]。Liu 等[17]研究證明 SDF-1 在促進內源性骨缺損修復方面發揮著十分重要的作用。此外，趨化家族中的 CXCL9、CXCL16 同樣具備促進細胞趨化遷移的作用。胸腺表達趨化因子又稱胸腺趨化因子 25［chemokine （C-C motif） ligand 25，CCL25］，是一種可以特異結合于 MSCs 表面人趨化因子受體 9，對人 MSCs 具備良好趨化能力的細胞因子[18]。單核細胞趨化蛋白 1（mono-cyte chemotactic protein 1，MCP-1）是 CC 趨化因子家族中的一種，是一種對單核細胞和巨噬細胞具備特異性趨化能力的細胞因子。還有研究發現 MCP-1 拮抗劑可以終止小鼠成骨模型早期成骨過程[19]，此研究證明 MCP-1 在細胞募集以及骨再生過程中起著十分重要的作用。但 MCP-1 對骨再生影響的生物學機制研究尚且不足。VEGF 是一種可以通過調節相關信號通路，定向趨化遷移內皮細胞促進血管形成的細胞因子[20]。PDGF 是一種促進細胞分裂的堿性低分子量蛋白，可以促進 BMSCs、平滑肌細胞的趨化增殖[21]。此外還有很多細胞因子對內源性種子細胞存在趨化作用，包括肝細胞生長因子、TGF-α、IGF、EGF、血管素等[22]。
原位組織工程領域中應用的細胞因子在生物體內存在半衰期短、易降解等不足，這極大地限制了細胞因子對體內細胞的募集遷移作用，因此許多研究通過相關物理化學方法改進細胞因子在體內的狀態，進而促進細胞因子的長期有效釋放。有研究利用殼聚糖納米顆粒技術包裹 SDF-1α 因子，可以有效改善 SDF-1α 的降解速度，從而使 SDF-1α 緩慢釋放，持續對體內周圍微環境發揮其生物學效應[23]。Dutta 等[24]將聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］為原料構建的 PLGA 納米微球用來包被 SDF-1α，最長可以達到持續超過 60 d 的緩慢釋放。但是此研究存在早期釋放量過大超過治療量的風險。Tang 等[25]對構建的細胞因子納米顆粒進行活性氧（reactive oxygen species，ROS）改性，使構建的細胞因子納米顆粒在遇見 ROS 時，可以釋放細胞因子進行修復動員，在一定程度上控制細胞因子在體內的釋放過程。但目前研究中所構建的細胞因子載體在保證細胞因子活性的前提下，依然無法精確控制細胞因子的釋放速度。因此，如何在保證細胞因子活性的前提下促進細胞因子持續高效可控地釋放，依然是組織工程學者亟待解決的問題。
目前，如何更加全面詳細地觀察鑒定細胞因子體內與體外對目的細胞的遷移作用，同樣是原位組織工程領域一個亟待解決的問題。目前體外研究細胞因子對種子細胞的遷移趨化作用，主要是通過 Boyden 小室試驗[26]和 Transwell 小室[27]完成。而采用熒光標記體內細胞后利用活體熒光顯微鏡可以用于體內觀察某一器官或組織內細胞因子對目的細胞的遷移趨化作用[24]。
1.3 支架材料
支架材料作為原位組織工程的核心部分，在組織修復方面起著十分重要的作用。支架材料可以作為細胞、細胞因子的載體，將細胞募集到組織缺損處，防止隨著周圍液體交換而流失；此外，支架材料的三維結構可以模擬細胞外基質促進定植的干細胞增殖分化，引導新生組織長入。與傳統的組織工程支架材料相比，原位組織工程中理想的支架材料更應具有以下特點：① 支架材料內部具備合理的微觀結構，可以為募集而來的目的細胞提供良好的黏附、增殖環境；② 支架材料具備更好的理化性質，能有效地結合細胞因子；③ 支架材料在不影響細胞因子活性的前提下，可以持續長久地釋放細胞因子，動員體內細胞富集于受損組織處進行組織修復。
目前用于原位組織工程修復的支架材料主要分為天然高分子材料和合成高分子材料兩大類。天然高分子材料主要包括海藻酸鈉、膠原、絲素蛋白、殼聚糖、纖維素等[28]。合成高分子材料主要包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚羥丁酯、聚原酸酯等[29]。目前研究者們為了克服單一來源材料支架的不足，往往利用多種不同來源材料構建出細胞因子/支架復合體系，用于原位組織工程的修復[30-31]。
在支架制作方面，利用傳統制作方法構建的原位組織工程支架材料在內部結構復雜性、個體性以及通聯性等方面仍存在一定不足。而目前越來越多的研究者利用 3D 打印技術構建原位組織工程支架材料用于組織缺損的修復當中[32-34]。與傳統方法相比，3D 打印技術可以精確控制支架材料內部微觀結構，因此在原位組織工程領域具備良好的應用前景。
2 原位組織工程技術在骨修復方面的應用
傳統的組織工程技術主要通過體外構建種子細胞/支架材料復合體系植入骨缺損部位進行修復。植入體內的外源性種子細胞因營養物質缺乏、免疫炎性反應、無法黏附定植于支架材料上，大大降低了組織工程骨修復材料的修復效果，同時種子細胞凋亡引起的周圍免疫炎性反應會抑制骨修復過程[35]。Li 等[36]通過熒光素酶和綠色熒光蛋白雙熒光染料標記小鼠 BMSCs 后，植入小鼠骨折模型體內，發現全身系統的 BMSCs 可以遷移至損傷部位，參與骨的修復再生。Xu 等[34]將標記后的人 BMSCs 通過鼠尾靜脈注入下頜骨缺損動物模型中，發現循環的 BMSCs 同樣促進骨缺損的修復與再生。基于此原理發展起來的原位組織工程技術主要通過改變支架材料特性，募集動員體內種子細胞進行修復，避免了長期體外細胞培養的過程，因此在骨缺損修復方面具有良好的應用前景。
2.1 細胞因子 SDF-1α 聯合不同支架材料促進骨缺損原位修復
SDF-1α 可以募集內源性干細胞與祖細胞進入損傷部位進行組織修復再生[37]。在原位組織工程骨修復領域，目前已有許多研究者利用 SDF-1α 結合支架材料，募集成骨前體細胞與 BMSCs 進行異位成骨與骨缺損修復實驗。
在異位成骨方面，Eman 等[38]利用構建好的生物陶瓷/明膠/SDF-1α 復合支架體系植入裸鼠皮下 6 周后取材，行免疫組織化學染色發現骨鈣素、Ⅰ型膠原、CD31 等成骨、成血管標志表達陽性。此外，Niu 等[39]利用 SDF-1α/硅化膠原復合體系植入小鼠模型皮下 6 周后同樣發現有異位成骨。在原位骨缺損修復方面，許多研究證實了 SDF-1α 聯合支架材料的原位骨缺損修復能力。有研究[40]利用低劑量 SDF-1α/BMP 聯合膠原支架材料植入小鼠顱骨缺損處 4 周后，相比于對照組有更多的骨基質形成。Shi 等[41]利用膠原結合的方法將 SDF-1α 整合到胎牛脫鈣骨中，體外構建出了一個功能性骨修復材料，在植入小鼠股骨干缺損 3 d 后，材料可以有效動員內源性 CD4+及 c-Kit+ 干細胞至缺損處，并且早期可以檢測到骨鈣素與骨保護素的大量表達。雖然目前已有許多研究證實 SDF-1α 聯合支架材料具備異位成骨以及骨缺損修復的能力，但其體內修復的生物學機制仍需進一步探索發現。
2.2 其他細胞因子聯合不同支架材料促進骨缺損修復
BMP 是一種可以誘導 MSCs 向成骨方向分化的細胞因子，同樣具有誘導周圍干細胞發生遷移、分化，促進新骨形成的作用。Jovanovic 等[42]構建了重組人 BMP-2/明膠復合海綿支架植入犬齒槽骨缺損處，展現了良好的骨缺損修復能力，他們認為 BMP 募集了周圍的 MSCs，進而促進了原位骨形成。Allegrini 等[43]構建了 BMP-2/羥基磷灰石多孔復合支架材料用于修復兔上頜骨缺損，結果發現混合支架材料組有新生骨組織產生，而單純多孔羥基磷灰石材料則無明顯骨組織生成。但目前單獨利用 BMP 聯合支架材料進行原位骨缺損修復的研究仍較少，BMP 是否可以促進原位骨修復能力仍需進一步研究證實。
此外，有研究者發現不應用細胞因子，而使用改性的單純支架募集干細胞進行骨缺損修復，同樣展現了良好的修復效果。Sun 等[44]體外構建了膠原支架材料并進行硅化后，可以通過調節免疫單核細胞的表達，進而募集 BMSCs 和內皮前體細胞，促進小鼠顱骨缺損的成骨和成血管作用。
3 原位組織工程技術在軟骨修復方面的應用
關節軟骨中不含有血管、神經、淋巴管等結構，其營養物質主要來源于周圍關節液的滲透作用。軟骨細胞作為終末期分化細胞，代謝率較低，一旦發生損傷，很難自我痊愈。目前對于關節軟骨缺損的治療主要依靠骨膜移植、自體軟骨移植等手段，這些方法存在來源有限、創傷大等不足。而原位組織工程技術為軟骨缺損的修復提供了新的方向。
原位組織工程軟骨修復主要通過植入可降解多孔支架材料，誘導自體干細胞聚集于缺損區域并分化為軟骨細胞，來實現軟骨缺損的修復。Cook 等[45]利用整合了 BMP-7 的支架材料募集周圍的 BMSCs，對軟骨缺損展現了良好的修復能力。Filová等[46]將干細胞募集因子添加到預先構建好的一種透明質酸/Ⅰ型膠原/纖維蛋白復合水凝膠，實現了對關節軟骨的原位修復。Chen 等[47]利用 SDF-1α 聯合膠原支架材料，通過細胞募集作用在動物模型中展現了良好的關節軟骨修復能力，并且一定程度上促進了關節軟骨的再生，形成了類似天然軟骨的類軟骨結構。
此外，越來越多研究通過利用負載干細胞募集因子的支架材料聯合微骨折技術，對軟骨缺損進行原位關節修復。微骨折技術是一種通過軟骨下骨微小骨折，促進骨髓腔內 MSCs 進入關節腔內進行原位修復的手術。張洪亮等[48]利用單純凝血酶活化的富血小板血漿聯合微骨折技術，對兔全層膝關節軟骨展現了良好的修復能力。Dai 等[49]通過構建一定孔隙結構的 PLGA 支架材料聯合微骨折技術，對兔膝關節軟骨展現了良好的軟骨再生能力。該研究主要利用了自身種子細胞進行修復，并未添加任何外源性種子細胞。
4 總結與展望
運用原位組織工程技術構建新型組織工程修復支架材料，不依賴外源性種子細胞，通過支架材料自身的理化性質募集動員修復細胞至缺損部位進行修復，是近年研究熱點。許多研究從體內、外實驗多方面證實了原位組織工程支架對骨缺損與軟骨缺損修復的可能性，為后期早日應用于臨床提供了理論依據。目前構建的原位組織工程支架材料對體內修復細胞的趨化作用研究尚且不足。相信隨著對原位組織工程支架材料的生物學機制研究進一步深入，原位組織工程技術在骨與軟骨組織工程領域具備更廣闊的應用前景。
對于由創傷、退變、感染、遺傳、腫瘤等多種原因引起的大段骨缺損與大面積軟骨缺損，一直是臨床骨科醫生需要面對的治療難題之一。目前，臨床中骨缺損與軟骨缺損的治療主要依靠自體/異體骨移植、骨搬運、骨膜移植等治療手段，但這些手段存在治療周期長、手術創傷大、免疫排斥、失敗率高等缺點[1]。而以細胞生物學、材料科學、工程學為基礎發展起來的組織工程技術為骨與軟骨缺損的治療提供了一個新的方向[2]。組織工程技術主要是通過體外分離培養獲得種子細胞，并將其接種于支架材料上構建組織工程修復材料并植入骨與軟骨缺損處進行修復。但體外構建組織工程骨與軟骨修復材料往往需要經歷長時間種子細胞的分離、培養、擴增等過程。同時，同種異體種子細胞移植同樣存在一定的免疫炎性反應。隨著生物材料技術以及相關再生醫學技術的發展，為了彌補傳統組織工程的不足，組織工程學者提出了“原位組織工程”這一新概念。原位組織工程又稱原位誘導再生，是指避免應用外來種子細胞，利用生物支架材料的理化性質與體內微環境相互作用誘導自體細胞遷移、黏附，同時促進細胞在支架材料上增殖分化，從而實現組織缺損的原位再生。原位誘導再生的特點包括：① 未添加外源性種子細胞，避免免疫排斥反應的發生；② 利用自體體內細胞進行修復，避免體外長期分離培養種子細胞時間久、易污染的情況發生；③ 將生物體當成一個完整的生物反應器，充分利用體內微環境進行組織缺損的修復[3]。近年來，利用原位組織工程技術構建的相關生物材料，在治療骨、軟骨、皮膚、神經等多種組織缺損方面展現出了良好的修復效果，為解決臨床中骨與軟骨缺損治療難題提供了一定的理論依據[4]。現將原位組織工程技術在骨與軟骨修復領域的研究進展綜述如下。
1 原位組織工程三要素
1.1 種子細胞
原位組織工程技術雖然無需引入外源性種子細胞，但需募集自體內有修復能力的種子細胞。BMSCs 由于其良好的增殖活性和多向分化能力，是最早應用于組織工程修復領域的種子細胞。研究證明[5]BMSCs 在創傷條件下可以動員進入外周血，最終歸巢至組織缺損區域進行組織修復。Fu 等[6]發現應用集落刺激因子和半胱氨酸-其他氨基酸-半胱氨酸趨化因子受體（Cys-X-Cys chemokine receptor，CXCR）拮抗劑（AMD3100）等藥物，同樣可以促進 BMSCs 動員進入外周血當中。在骨與軟骨缺損修復領域，BMSCs 不僅具備良好的成骨和成軟骨分化能力，并且是最易動員募集到缺損區域進行修復的一種干細胞。目前大量研究主要集中在利用多種不同的方法，募集動員 BMSCs 進入骨與軟骨缺損區域進行組織修復[7-8]。
骨膜是包被在長骨干表面的一層特殊結締組織，包含有成骨細胞、成纖維細胞等骨膜來源細胞，在臨床上可應用于大面積軟骨缺損的治療。研究發現骨膜來源細胞（periosteum-derived cells，PDCs）可以分化為成骨細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞，比 BMSCs 具備更高的增殖活性，同時可以表達 CD29、CD140 等典型 MSCs 表面標記，因此理論上可以應用 PDCs 進行組織工程修復[9]。在骨折發生后的早期過程中，機體自發開始骨膜動員，骨折周圍骨膜開始增厚，產生自發炎性反應，骨膜內 PDCs 開始增殖、分化為成骨細胞參與骨修復過程[10]。因此 PDCs 是在原位組織工程中一種具備廣大應用前景的成骨前體細胞。但目前有關 PDCs 的研究報道相對較少，其有效性仍需要進一步探索發現。
組織工程骨修復材料的關鍵問題在于如何促進修復材料的血管化，因此許多研究者利用相關物理化學方法募集動員內皮細胞至骨缺損部位，促進骨修復材料的血管化[11-13]。然而，內皮細胞作為一種成熟的體外終末分化細胞，存在易老化、存活力低、黏附能力弱等缺點。內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）主要存在于骨髓中，作為內皮細胞的前體細胞，具備增殖能力強、易分化等特點。目前有研究嘗試通過相關技術手段募集動員骨髓中的 EPCs，應用于原位組織工程修復中[14-15]。但如何高效持續大量地動員體內種子細胞至組織缺損部位進行修復，依然是亟待解決的一個難題。
1.2 細胞因子
細胞因子在原位組織工程中起著誘導細胞趨化遷移、促進增殖分化等作用，還可以特異性地與細胞表面相關分子受體結合，促進細胞黏附。許多因子對干細胞的遷移趨化起著十分重要的作用。基質細胞衍生因子（stromal-derived factor，SDF）是目前研究應用最多的一種細胞趨化因子。SDF-1α 又稱半胱氨酸-其他氨基酸-半胱氨酸趨化因子配體 12（Cys-X-Cys chemokine ligand 12，CXCL12），是一種促進自身宿主細胞遷移的細胞因子，可以特異性結合細胞膜上受體 CXCR4，對 MSCs、內皮祖細胞、造血干細胞、神經干細胞、平滑肌前體細胞等細胞進行募集趨化[16]。Liu 等[17]研究證明 SDF-1 在促進內源性骨缺損修復方面發揮著十分重要的作用。此外，趨化家族中的 CXCL9、CXCL16 同樣具備促進細胞趨化遷移的作用。胸腺表達趨化因子又稱胸腺趨化因子 25［chemokine （C-C motif） ligand 25，CCL25］，是一種可以特異結合于 MSCs 表面人趨化因子受體 9，對人 MSCs 具備良好趨化能力的細胞因子[18]。單核細胞趨化蛋白 1（mono-cyte chemotactic protein 1，MCP-1）是 CC 趨化因子家族中的一種，是一種對單核細胞和巨噬細胞具備特異性趨化能力的細胞因子。還有研究發現 MCP-1 拮抗劑可以終止小鼠成骨模型早期成骨過程[19]，此研究證明 MCP-1 在細胞募集以及骨再生過程中起著十分重要的作用。但 MCP-1 對骨再生影響的生物學機制研究尚且不足。VEGF 是一種可以通過調節相關信號通路，定向趨化遷移內皮細胞促進血管形成的細胞因子[20]。PDGF 是一種促進細胞分裂的堿性低分子量蛋白，可以促進 BMSCs、平滑肌細胞的趨化增殖[21]。此外還有很多細胞因子對內源性種子細胞存在趨化作用，包括肝細胞生長因子、TGF-α、IGF、EGF、血管素等[22]。
原位組織工程領域中應用的細胞因子在生物體內存在半衰期短、易降解等不足，這極大地限制了細胞因子對體內細胞的募集遷移作用，因此許多研究通過相關物理化學方法改進細胞因子在體內的狀態，進而促進細胞因子的長期有效釋放。有研究利用殼聚糖納米顆粒技術包裹 SDF-1α 因子，可以有效改善 SDF-1α 的降解速度，從而使 SDF-1α 緩慢釋放，持續對體內周圍微環境發揮其生物學效應[23]。Dutta 等[24]將聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］為原料構建的 PLGA 納米微球用來包被 SDF-1α，最長可以達到持續超過 60 d 的緩慢釋放。但是此研究存在早期釋放量過大超過治療量的風險。Tang 等[25]對構建的細胞因子納米顆粒進行活性氧（reactive oxygen species，ROS）改性，使構建的細胞因子納米顆粒在遇見 ROS 時，可以釋放細胞因子進行修復動員，在一定程度上控制細胞因子在體內的釋放過程。但目前研究中所構建的細胞因子載體在保證細胞因子活性的前提下，依然無法精確控制細胞因子的釋放速度。因此，如何在保證細胞因子活性的前提下促進細胞因子持續高效可控地釋放，依然是組織工程學者亟待解決的問題。
目前，如何更加全面詳細地觀察鑒定細胞因子體內與體外對目的細胞的遷移作用，同樣是原位組織工程領域一個亟待解決的問題。目前體外研究細胞因子對種子細胞的遷移趨化作用，主要是通過 Boyden 小室試驗[26]和 Transwell 小室[27]完成。而采用熒光標記體內細胞后利用活體熒光顯微鏡可以用于體內觀察某一器官或組織內細胞因子對目的細胞的遷移趨化作用[24]。
1.3 支架材料
支架材料作為原位組織工程的核心部分，在組織修復方面起著十分重要的作用。支架材料可以作為細胞、細胞因子的載體，將細胞募集到組織缺損處，防止隨著周圍液體交換而流失；此外，支架材料的三維結構可以模擬細胞外基質促進定植的干細胞增殖分化，引導新生組織長入。與傳統的組織工程支架材料相比，原位組織工程中理想的支架材料更應具有以下特點：① 支架材料內部具備合理的微觀結構，可以為募集而來的目的細胞提供良好的黏附、增殖環境；② 支架材料具備更好的理化性質，能有效地結合細胞因子；③ 支架材料在不影響細胞因子活性的前提下，可以持續長久地釋放細胞因子，動員體內細胞富集于受損組織處進行組織修復。
目前用于原位組織工程修復的支架材料主要分為天然高分子材料和合成高分子材料兩大類。天然高分子材料主要包括海藻酸鈉、膠原、絲素蛋白、殼聚糖、纖維素等[28]。合成高分子材料主要包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚羥丁酯、聚原酸酯等[29]。目前研究者們為了克服單一來源材料支架的不足，往往利用多種不同來源材料構建出細胞因子/支架復合體系，用于原位組織工程的修復[30-31]。
在支架制作方面，利用傳統制作方法構建的原位組織工程支架材料在內部結構復雜性、個體性以及通聯性等方面仍存在一定不足。而目前越來越多的研究者利用 3D 打印技術構建原位組織工程支架材料用于組織缺損的修復當中[32-34]。與傳統方法相比，3D 打印技術可以精確控制支架材料內部微觀結構，因此在原位組織工程領域具備良好的應用前景。
2 原位組織工程技術在骨修復方面的應用
傳統的組織工程技術主要通過體外構建種子細胞/支架材料復合體系植入骨缺損部位進行修復。植入體內的外源性種子細胞因營養物質缺乏、免疫炎性反應、無法黏附定植于支架材料上，大大降低了組織工程骨修復材料的修復效果，同時種子細胞凋亡引起的周圍免疫炎性反應會抑制骨修復過程[35]。Li 等[36]通過熒光素酶和綠色熒光蛋白雙熒光染料標記小鼠 BMSCs 后，植入小鼠骨折模型體內，發現全身系統的 BMSCs 可以遷移至損傷部位，參與骨的修復再生。Xu 等[34]將標記后的人 BMSCs 通過鼠尾靜脈注入下頜骨缺損動物模型中，發現循環的 BMSCs 同樣促進骨缺損的修復與再生。基于此原理發展起來的原位組織工程技術主要通過改變支架材料特性，募集動員體內種子細胞進行修復，避免了長期體外細胞培養的過程，因此在骨缺損修復方面具有良好的應用前景。
2.1 細胞因子 SDF-1α 聯合不同支架材料促進骨缺損原位修復
SDF-1α 可以募集內源性干細胞與祖細胞進入損傷部位進行組織修復再生[37]。在原位組織工程骨修復領域，目前已有許多研究者利用 SDF-1α 結合支架材料，募集成骨前體細胞與 BMSCs 進行異位成骨與骨缺損修復實驗。
在異位成骨方面，Eman 等[38]利用構建好的生物陶瓷/明膠/SDF-1α 復合支架體系植入裸鼠皮下 6 周后取材，行免疫組織化學染色發現骨鈣素、Ⅰ型膠原、CD31 等成骨、成血管標志表達陽性。此外，Niu 等[39]利用 SDF-1α/硅化膠原復合體系植入小鼠模型皮下 6 周后同樣發現有異位成骨。在原位骨缺損修復方面，許多研究證實了 SDF-1α 聯合支架材料的原位骨缺損修復能力。有研究[40]利用低劑量 SDF-1α/BMP 聯合膠原支架材料植入小鼠顱骨缺損處 4 周后，相比于對照組有更多的骨基質形成。Shi 等[41]利用膠原結合的方法將 SDF-1α 整合到胎牛脫鈣骨中，體外構建出了一個功能性骨修復材料，在植入小鼠股骨干缺損 3 d 后，材料可以有效動員內源性 CD4+及 c-Kit+ 干細胞至缺損處，并且早期可以檢測到骨鈣素與骨保護素的大量表達。雖然目前已有許多研究證實 SDF-1α 聯合支架材料具備異位成骨以及骨缺損修復的能力，但其體內修復的生物學機制仍需進一步探索發現。
2.2 其他細胞因子聯合不同支架材料促進骨缺損修復
BMP 是一種可以誘導 MSCs 向成骨方向分化的細胞因子，同樣具有誘導周圍干細胞發生遷移、分化，促進新骨形成的作用。Jovanovic 等[42]構建了重組人 BMP-2/明膠復合海綿支架植入犬齒槽骨缺損處，展現了良好的骨缺損修復能力，他們認為 BMP 募集了周圍的 MSCs，進而促進了原位骨形成。Allegrini 等[43]構建了 BMP-2/羥基磷灰石多孔復合支架材料用于修復兔上頜骨缺損，結果發現混合支架材料組有新生骨組織產生，而單純多孔羥基磷灰石材料則無明顯骨組織生成。但目前單獨利用 BMP 聯合支架材料進行原位骨缺損修復的研究仍較少，BMP 是否可以促進原位骨修復能力仍需進一步研究證實。
此外，有研究者發現不應用細胞因子，而使用改性的單純支架募集干細胞進行骨缺損修復，同樣展現了良好的修復效果。Sun 等[44]體外構建了膠原支架材料并進行硅化后，可以通過調節免疫單核細胞的表達，進而募集 BMSCs 和內皮前體細胞，促進小鼠顱骨缺損的成骨和成血管作用。
3 原位組織工程技術在軟骨修復方面的應用
關節軟骨中不含有血管、神經、淋巴管等結構，其營養物質主要來源于周圍關節液的滲透作用。軟骨細胞作為終末期分化細胞，代謝率較低，一旦發生損傷，很難自我痊愈。目前對于關節軟骨缺損的治療主要依靠骨膜移植、自體軟骨移植等手段，這些方法存在來源有限、創傷大等不足。而原位組織工程技術為軟骨缺損的修復提供了新的方向。
原位組織工程軟骨修復主要通過植入可降解多孔支架材料，誘導自體干細胞聚集于缺損區域并分化為軟骨細胞，來實現軟骨缺損的修復。Cook 等[45]利用整合了 BMP-7 的支架材料募集周圍的 BMSCs，對軟骨缺損展現了良好的修復能力。Filová等[46]將干細胞募集因子添加到預先構建好的一種透明質酸/Ⅰ型膠原/纖維蛋白復合水凝膠，實現了對關節軟骨的原位修復。Chen 等[47]利用 SDF-1α 聯合膠原支架材料，通過細胞募集作用在動物模型中展現了良好的關節軟骨修復能力，并且一定程度上促進了關節軟骨的再生，形成了類似天然軟骨的類軟骨結構。
此外，越來越多研究通過利用負載干細胞募集因子的支架材料聯合微骨折技術，對軟骨缺損進行原位關節修復。微骨折技術是一種通過軟骨下骨微小骨折，促進骨髓腔內 MSCs 進入關節腔內進行原位修復的手術。張洪亮等[48]利用單純凝血酶活化的富血小板血漿聯合微骨折技術，對兔全層膝關節軟骨展現了良好的修復能力。Dai 等[49]通過構建一定孔隙結構的 PLGA 支架材料聯合微骨折技術，對兔膝關節軟骨展現了良好的軟骨再生能力。該研究主要利用了自身種子細胞進行修復，并未添加任何外源性種子細胞。
4 總結與展望
運用原位組織工程技術構建新型組織工程修復支架材料，不依賴外源性種子細胞，通過支架材料自身的理化性質募集動員修復細胞至缺損部位進行修復，是近年研究熱點。許多研究從體內、外實驗多方面證實了原位組織工程支架對骨缺損與軟骨缺損修復的可能性，為后期早日應用于臨床提供了理論依據。目前構建的原位組織工程支架材料對體內修復細胞的趨化作用研究尚且不足。相信隨著對原位組織工程支架材料的生物學機制研究進一步深入，原位組織工程技術在骨與軟骨組織工程領域具備更廣闊的應用前景。