引用本文： 李雪梅, 張雨詩, 鐘科, 蘆帥, 陳躍. 改良型富血小板纖維蛋白與 β-磷酸三鈣復合物誘導骨再生的研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(2): 177-184. doi: 10.7507/1002-1892.201807002 復制
臨床常見牙周病、齲病、外傷、腫瘤切除等原因引起的牙列缺損或缺失，由于通常伴不同程度牙槽骨骨量不足，臨床種植修復困難。引導骨組織再生術是牙槽骨骨增量技術的重要手段。隨著骨組織工程研究的發展，通過結合生長因子與支架材料來誘導骨再生為骨缺損修復提供了新途徑。富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是臨床骨缺損治療中常用的自體生長因子供體，所含的生長因子如 TGF-β1、VEGF 等，可持續釋放達 7 d[1]。2014 年，Ghanaati 等[2]提出了改良型 PRF（advanced-PRF，A-PRF），其釋放生長因子更多、持續時間更長[3-4]。β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）作為骨組織工程常用的支架材料，具有骨引導作用，常與各種具有骨誘導作用的生長因子復合使用。Siddiqui 等[5]將 PRF 與 β-TCP 復合成功用于臨床Ⅱ度根分叉病變的治療。Yilmaz 等[6]發現 β-TCP 與 PRF 復合修復豬脛骨缺損效果優于單純的 PRF、β-TCP 修復。目前，關于 A-PRF 與 β-TCP 復合物對骨缺損修復作用的研究報道較少。為此，本實驗通過構建不同比例的新西蘭兔 A-PRF 及 β-TCP 復合物，并修復兔股骨髁骨缺損，探討 A-PRF 及 β-TCP 復合物修復骨缺損效果并篩選最佳比例，為臨床應用提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～9 月齡雌性新西蘭兔 32 只，體質量 2.5～3.0 kg，由成都達碩實驗動物有限公司提供，使用許可證號 SYXK（川）2014-189。實驗通過西南醫科大學動物實驗倫理委員會批準。
β-TCP（OSferion；奧林巴斯泰爾茂生物材料株式會社，日本）；吉特瑞醫用膠原修復膜（福建省博特生物科技有限公司）；PRF 工具盒（Process, Nice 公司，法國）；離心機（TDZ4-WS，長沙湘儀集團有限公司）；牙片機（KAVO 公司，德國）；小動物活體斷層掃描儀（Micro-CT）、分析軟件 Feldkamp（SIEMENS 公司，德國）；生物力學測試系統［協強儀器制造（上海）有限公司］。
1.2 實驗分組及方法
1.2.1 分組方法
將 32 只新西蘭兔隨機分為 6 組，其中 A、B、C、D、E 組為不同比例（1∶1、2∶1、4∶1、1∶2、1∶4，V/V）APRF 與 β-TCP 復合物修復股骨髁骨缺損組，每組各 6 只；F 組（2 只）為空白對照組。
1.2.2 A-PRF 制備
參照本課題組前期實驗結果制備 A-PRF[7]。采集各組兔耳中動脈血，于 25℃、以離心半徑 12 cm、2 000 r/min 離心 24 min；室溫下靜置 1 min。離心管上層為無細胞血漿層，中間層為 A-PRF 凝膠，底部為紅細胞層。取出 A-PRF 凝膠，置于 PRF 工具盒內剪碎，備用。
1.2.3 動物模型制備及實驗方法
取各組動物首先制備股骨髁骨缺損模型。耳緣靜脈注射 3% 戊巴比妥溶液（1 mL/kg）麻醉后，自雙后肢膝關節外側距前緣 1.0～1.5 cm 處，平行前緣作一長約 5 cm 弧形切口；逐層分離暴露股骨外側髁解剖標志，用環形中空取骨鉆制備直徑 6 mm、深 8 mm 的圓柱形骨缺損[8-12]。于距離骨缺損中央 6 mm 處，左右對稱各旋入 1 枚直徑 2 mm 的鈦釘定位。A～E 組按照 1∶1、2∶1、4∶1、1∶2、1∶4（V/V）比例配置 A-PRF 與 β-TCP 復合物，復合物總量為 0.5 mL，混合均勻。將復合物充填骨缺損，醫用膠原修復膜覆蓋。見圖 1。F 組制備骨缺損后不填充材料，僅用醫用膠原修復膜覆蓋骨缺損表面。術后 3 d 內每天肌肉注射青霉素鈉 80 萬 U。術后 8、12 周，A～E 組各取 3 只、F 組各取 1 只動物，耳緣靜脈注射過量麻藥處死后，取材進行以下觀測。
圖1
兔股骨髁骨缺損修復模型制備步驟
a. 暴露股骨髁；b. 制備骨缺損；c. 鈦釘定位；d. 植入 A-PRF 與 β-TCP 復合物；e. 覆蓋醫用膠原修復膜
Figure1. The preparation of bone defect and repair model in rabbit femoral condylea. Exposing femur condyle; b. Preparing bone defect; c. Positioning of titanium nail; d. Implanting the A-PRF and β-TCP composite; e. Covering the defect with medical collagen repair membranes
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
各時間點，按照原手術切口入路，逐層分離雙后肢股骨髁骨區皮膚和軟組織，觀察骨缺損表面愈合情況。
1.3.2 X 線片觀察
大體觀察后，行雙后肢股骨髁骨區 X 線片檢查，觀察骨缺損愈合情況。
1.3.3 Micro-CT 觀測
X 線片觀察后，雙后肢股骨髁骨區行 Micro-CT 掃描，觀察新生骨形成情況。掃描條件：掃描高度 1.5 cm，層距 19 μm，跨越 780～800 層，曝光時間 1 800 ms，管電壓 80 kV，管電流 500 μA。將獲取的 A～E 組 Micro-CT 圖像采用 Feldkamp 分析軟件進行重建分析，從上至下在距離股骨髁外側面 2 mm 與 5 mm 處分別取橫斷面，獲得 3 段新生骨區，設定新生骨閾值 500～1 500，β-TCP 顆粒閾值 1 500 以上[13]，測量新生骨相關指標，包括骨體積/組織體積（bone volume/ total volume，BV/TV）、骨小梁數目（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁間隙（trabecular spacing，Tb.Sp）。3 段新生骨區各檢測指標取均值。
1.3.4 生物力學測試
Micro-CT 檢測后取 A～E 組新生骨組織，修整為高 8 mm、直徑 5 mm 的圓柱形。采用生物力學測試系統進行檢測，加載速率設定 1 mm/min，沿標本長軸方向加壓，期間用生理鹽水濕潤，直至骨標本破裂骨折后停止加載，計算材料壓縮強度和彈性模量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；組內不同時間點間比較采用配對 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后 8 周，A～E 組骨缺損區均可見新生骨，其中 B 組表面凹陷程度最輕，E 組骨表面凹陷較明顯且可見少量 β-TCP 殘留；F 組可見纖維肉芽組織充填且骨缺損邊界明顯。12 周時，A～E 組骨表面仍有輕微凹陷，但較 8 周時凹陷程度輕；骨缺損區新生骨邊緣移行不清，尤其 B 組最顯著；F 組骨缺損邊界內側見少量骨痂，未見明顯新骨生成。各組術后 12 周表面骨質形成均優于 8 周。見圖 2。
圖2
各組大體觀察
從上至下分別為 A、B、C、D、E、F 組a. 術后 8 周；b. 術后 12 周
Figure2. Gross observation of each groupFrom top to bottom for groups A, B, C, D, E, and F, respectively a. At 8 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
2.2 X 線片觀察
術后 8 周，F 組低密度骨缺損范圍最大且邊界清晰，其次為 C、A、D、E 組，B 組骨缺損范圍最小。12 周時，F 組缺損范圍最大但邊界呈霧化狀，其次為 C、D、E、A 組范圍較小，B 組最小且見較高密度區域移行與周圍骨融合；新生骨呈向心性生長；A～E 組低密度骨缺損范圍與 8 周時相比，由邊緣向中央逐漸減小，且骨密度增高。見圖 3。
圖3
各組 X 線片觀察
從上至下分別為 A、B、C、D、E、F 組a. 術后 8 周；b. 術后 12 周
Figure3. X-ray films of each groupFrom top to bottom for groups A, B, C, D, E, and F, respectively a. At 8 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
2.3 Micro-CT 觀測
術后 8 周，A～E 組均可見較清晰排列的骨小梁且骨小梁間髓腔較大；其中 B 組新生骨骨小梁最多，呈條索狀或板層狀，排列緊密；C 組新生骨小梁最少，呈條狀，連續性欠佳，骨小梁間間隙大。12 周時，A～E 組骨小梁均較 8 周時明顯增多，排列密集交錯，骨小梁間髓腔寬度明顯減小，B 組最小，A、C、D、E 組相近。見圖 4。
圖4
各組 Micro-CT 觀察
從上至下分別為 A、B、C、D、E、F 組a. 術后 8 周；b. 術后 12 周
Figure4. Micro-CT observation of each groupFrom top to bottom for groups A, B, C, D, E, and F, respectively a. At 8 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
術后 8 周：① BV/TV，B、D 組與 A、C、E 組比較，B、D 組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。② Tb.N，B、C、E 組與 A、D 組比較以及 B、C、E 組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。③ Tb.Th，組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。④ Tb.Sp，B 組與 D 組比較以及 C 組與 A、B、E 組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
各時間點 Micro-CT 檢測相關指標比較（n=6，
）
Table1.
Comparison of Micro-CT detection related indexes at each time point (n=6, 
)
術后 12 周：① BV/TV，B、D 組與 C、E 組比較以及 B 組與 A 組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。② Tb.N，除 A、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。③ Tb.Th，組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。④ Tb.Sp，B 組與 A、C、D、E 組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
組內比較，術后 12 周 C 組 BV/TV 及 Tb.Sp、B 組 Tb.N 及 Tb.Th，D 組 Tb.Sp 與 8 周比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余指標組內比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
2.4 生物力學測試
術后 8 周：① 壓縮強度：C 組與 A、B、D、E 組比較，B 組與 D、E 組比較，A、E 組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。② 彈性模量：C 組與 A、B、D、E 組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
術后 12 周：① 壓縮強度：C 組與 A、B、D、E 組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。② 彈性模量：C 組與 A、B、E 組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
組內比較：各組 12 周時壓縮強度和彈性模量均大于 8 周，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
各時間點生物力學測試相關指標比較（n=6，
）
Table2.
Comparison of biomechanical test related indexes at each time point (n=6, 
)
3 討論
3.1 骨缺損模型制備及修復膜應用
在骨缺損區，軟組織的修復速度較快，上皮細胞、成纖維細胞長入骨缺損區會對骨細胞產生競爭性抑制而不利于骨形成。而膜引導骨組織再生技術將屏障膜置于骨缺損區和軟組織之間，阻斷了上皮細胞和成纖維細胞的優先長入，允許具有成骨能力的細胞緩慢進入骨缺損區，達到定向修復骨缺損的目的。本實驗采用的屏障膜為吉特瑞醫用膠原修復膜，主要成分是從牛腱中提取的Ⅰ型膠原蛋白，宏觀結構為白色片狀薄膜，微觀結構為雙面多孔網狀片層，致密層保護骨組織再生所需空間，起屏障作用；疏松層有利于生長因子聚集、血管和骨細胞生長，起支架作用。
本研究中，12 周時 F 組骨缺損無法自行愈合，提示選擇的直徑 6 mm、深 8 mm 骨缺損模型滿足臨界性骨缺損要求[8]。X 線片檢查示，A～E 組骨缺損呈向心性生長，這與于威等[14]關于成骨的發現一致，分析原因是骨缺損中心血液運輸及再血管化均不及邊緣豐富，新生的膠原纖維網及各類細胞、骨小梁呈向心性減少。殷建等[15]也發現，在兔橈骨骨缺損區局部注射促血管生成素2能使組織工程人工骨早期血管化，促進成骨，進一步表明了血液運輸與成骨的關系。
3.2 Micro-CT 及生物力學觀測結果分析
本研究在新生骨微觀結構方面主要測量了 BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp4 個指標。 BV/TV 與骨形成總量成正相關，Tb.N 和 Tb.Th 與骨吸收量成負相關，Tb.Sp 與骨吸收量成正相關。Micro-CT 測量結果發現，術后 8、12 周時 B 組 BV/TV 及 Tb.N 最大、Tb.Sp 最小，C 組與之相反；提示 B 組新生骨所占比例較大、骨小梁數目較多、骨小梁排列更緊密，而 C 組新生骨所占比例較小、骨小梁數目較少，骨小梁間隙較寬。我們分析原因為 B 組 A-PRF 和 β-TCP 比例優于其他組，兩者充分發揮了各自骨誘導、骨引導作用。B 組復合物中 A-PRF 約占 67%，其三維立體網狀結構中含豐富血小板和生長因子。血小板濃聚能促進 MSCs 增殖，BMP-2 誘導其分化為軟骨和骨，生長因子促進細胞增殖分化和血管再生，尤其是 PDGF 和 VEGF[16-17]。劉鵬鶴等[18]也在臨床觀察中發現，富含血小板和生長因子的自體血纖維蛋白能促進前交叉韌帶重建術后腱-骨愈合。β-TCP 約占 33%，其顆粒直徑在 0.5～1.5 mm 之間，氣孔率 73%～82%，顆粒間存在不規則間隙[19-20]，它具有與天然松質骨相似的多孔狀結構及與正常骨組織相似的 Ca2+和 PO43-含量比值，有良好支架作用[21]，利于細胞攀附、新生血管長入[22-24]。雖然研究表明 A-PRF 從 14～21 d 逐漸開始降解，三維立體結構逐漸消失[25]，但仍然有大多數未降解的 β-TCP 在此過程中繼續發揮其骨引導作用，并降解釋放出 Ca2+和 PO43-為成骨細胞提供原材料，促進新骨形成[22]。 而 C 組成骨效果差可能是因為復合物中 A-PRF 約 80.0%，β-TCP 含量較少。雖然 A-PRF 富含生長因子，但降解周期較短，釋放生長因子時間也較短，且沒有足夠的 β-TCP 提供空間支架和成骨材料，成骨細胞沉積較少，骨小梁成熟度也差。
在生物力學試驗中，對標本的壓縮強度和彈性模量進行了測量，可以反映新生骨抵抗斷裂和抵抗變形的能力，以此評價新生骨力學性能。術后 8 周及 12 周，B 組壓縮強度和彈性模量最高，表明具有良好力學性能，與 Micro-CT 測量結果一致。
綜上述，A-PRF 與 β-TCP 復合物能促進骨缺損愈合，以 2∶1 比例復合后修復骨缺損效果更佳。為獲得更精確的復合比例，在后續的研究中我們將以 2∶1 為中心細化比例梯度，并且延長實驗周期，進一步對 A-PRF 與 β-TCP 相互作用機制，以及不同比例復合物成骨效果差異的原因進行深入研究。
臨床常見牙周病、齲病、外傷、腫瘤切除等原因引起的牙列缺損或缺失，由于通常伴不同程度牙槽骨骨量不足，臨床種植修復困難。引導骨組織再生術是牙槽骨骨增量技術的重要手段。隨著骨組織工程研究的發展，通過結合生長因子與支架材料來誘導骨再生為骨缺損修復提供了新途徑。富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是臨床骨缺損治療中常用的自體生長因子供體，所含的生長因子如 TGF-β1、VEGF 等，可持續釋放達 7 d[1]。2014 年，Ghanaati 等[2]提出了改良型 PRF（advanced-PRF，A-PRF），其釋放生長因子更多、持續時間更長[3-4]。β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）作為骨組織工程常用的支架材料，具有骨引導作用，常與各種具有骨誘導作用的生長因子復合使用。Siddiqui 等[5]將 PRF 與 β-TCP 復合成功用于臨床Ⅱ度根分叉病變的治療。Yilmaz 等[6]發現 β-TCP 與 PRF 復合修復豬脛骨缺損效果優于單純的 PRF、β-TCP 修復。目前，關于 A-PRF 與 β-TCP 復合物對骨缺損修復作用的研究報道較少。為此，本實驗通過構建不同比例的新西蘭兔 A-PRF 及 β-TCP 復合物，并修復兔股骨髁骨缺損，探討 A-PRF 及 β-TCP 復合物修復骨缺損效果并篩選最佳比例，為臨床應用提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～9 月齡雌性新西蘭兔 32 只，體質量 2.5～3.0 kg，由成都達碩實驗動物有限公司提供，使用許可證號 SYXK（川）2014-189。實驗通過西南醫科大學動物實驗倫理委員會批準。
β-TCP（OSferion；奧林巴斯泰爾茂生物材料株式會社，日本）；吉特瑞醫用膠原修復膜（福建省博特生物科技有限公司）；PRF 工具盒（Process, Nice 公司，法國）；離心機（TDZ4-WS，長沙湘儀集團有限公司）；牙片機（KAVO 公司，德國）；小動物活體斷層掃描儀（Micro-CT）、分析軟件 Feldkamp（SIEMENS 公司，德國）；生物力學測試系統［協強儀器制造（上海）有限公司］。
1.2 實驗分組及方法
1.2.1 分組方法
將 32 只新西蘭兔隨機分為 6 組，其中 A、B、C、D、E 組為不同比例（1∶1、2∶1、4∶1、1∶2、1∶4，V/V）APRF 與 β-TCP 復合物修復股骨髁骨缺損組，每組各 6 只；F 組（2 只）為空白對照組。
1.2.2 A-PRF 制備
參照本課題組前期實驗結果制備 A-PRF[7]。采集各組兔耳中動脈血，于 25℃、以離心半徑 12 cm、2 000 r/min 離心 24 min；室溫下靜置 1 min。離心管上層為無細胞血漿層，中間層為 A-PRF 凝膠，底部為紅細胞層。取出 A-PRF 凝膠，置于 PRF 工具盒內剪碎，備用。
1.2.3 動物模型制備及實驗方法
取各組動物首先制備股骨髁骨缺損模型。耳緣靜脈注射 3% 戊巴比妥溶液（1 mL/kg）麻醉后，自雙后肢膝關節外側距前緣 1.0～1.5 cm 處，平行前緣作一長約 5 cm 弧形切口；逐層分離暴露股骨外側髁解剖標志，用環形中空取骨鉆制備直徑 6 mm、深 8 mm 的圓柱形骨缺損[8-12]。于距離骨缺損中央 6 mm 處，左右對稱各旋入 1 枚直徑 2 mm 的鈦釘定位。A～E 組按照 1∶1、2∶1、4∶1、1∶2、1∶4（V/V）比例配置 A-PRF 與 β-TCP 復合物，復合物總量為 0.5 mL，混合均勻。將復合物充填骨缺損，醫用膠原修復膜覆蓋。見圖 1。F 組制備骨缺損后不填充材料，僅用醫用膠原修復膜覆蓋骨缺損表面。術后 3 d 內每天肌肉注射青霉素鈉 80 萬 U。術后 8、12 周，A～E 組各取 3 只、F 組各取 1 只動物，耳緣靜脈注射過量麻藥處死后，取材進行以下觀測。
圖1
兔股骨髁骨缺損修復模型制備步驟
a. 暴露股骨髁；b. 制備骨缺損；c. 鈦釘定位；d. 植入 A-PRF 與 β-TCP 復合物；e. 覆蓋醫用膠原修復膜
Figure1. The preparation of bone defect and repair model in rabbit femoral condylea. Exposing femur condyle; b. Preparing bone defect; c. Positioning of titanium nail; d. Implanting the A-PRF and β-TCP composite; e. Covering the defect with medical collagen repair membranes
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
各時間點，按照原手術切口入路，逐層分離雙后肢股骨髁骨區皮膚和軟組織，觀察骨缺損表面愈合情況。
1.3.2 X 線片觀察
大體觀察后，行雙后肢股骨髁骨區 X 線片檢查，觀察骨缺損愈合情況。
1.3.3 Micro-CT 觀測
X 線片觀察后，雙后肢股骨髁骨區行 Micro-CT 掃描，觀察新生骨形成情況。掃描條件：掃描高度 1.5 cm，層距 19 μm，跨越 780～800 層，曝光時間 1 800 ms，管電壓 80 kV，管電流 500 μA。將獲取的 A～E 組 Micro-CT 圖像采用 Feldkamp 分析軟件進行重建分析，從上至下在距離股骨髁外側面 2 mm 與 5 mm 處分別取橫斷面，獲得 3 段新生骨區，設定新生骨閾值 500～1 500，β-TCP 顆粒閾值 1 500 以上[13]，測量新生骨相關指標，包括骨體積/組織體積（bone volume/ total volume，BV/TV）、骨小梁數目（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁間隙（trabecular spacing，Tb.Sp）。3 段新生骨區各檢測指標取均值。
1.3.4 生物力學測試
Micro-CT 檢測后取 A～E 組新生骨組織，修整為高 8 mm、直徑 5 mm 的圓柱形。采用生物力學測試系統進行檢測，加載速率設定 1 mm/min，沿標本長軸方向加壓，期間用生理鹽水濕潤，直至骨標本破裂骨折后停止加載，計算材料壓縮強度和彈性模量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；組內不同時間點間比較采用配對 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后 8 周，A～E 組骨缺損區均可見新生骨，其中 B 組表面凹陷程度最輕，E 組骨表面凹陷較明顯且可見少量 β-TCP 殘留；F 組可見纖維肉芽組織充填且骨缺損邊界明顯。12 周時，A～E 組骨表面仍有輕微凹陷，但較 8 周時凹陷程度輕；骨缺損區新生骨邊緣移行不清，尤其 B 組最顯著；F 組骨缺損邊界內側見少量骨痂，未見明顯新骨生成。各組術后 12 周表面骨質形成均優于 8 周。見圖 2。
圖2
各組大體觀察
從上至下分別為 A、B、C、D、E、F 組a. 術后 8 周；b. 術后 12 周
Figure2. Gross observation of each groupFrom top to bottom for groups A, B, C, D, E, and F, respectively a. At 8 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
2.2 X 線片觀察
術后 8 周，F 組低密度骨缺損范圍最大且邊界清晰，其次為 C、A、D、E 組，B 組骨缺損范圍最小。12 周時，F 組缺損范圍最大但邊界呈霧化狀，其次為 C、D、E、A 組范圍較小，B 組最小且見較高密度區域移行與周圍骨融合；新生骨呈向心性生長；A～E 組低密度骨缺損范圍與 8 周時相比，由邊緣向中央逐漸減小，且骨密度增高。見圖 3。
圖3
各組 X 線片觀察
從上至下分別為 A、B、C、D、E、F 組a. 術后 8 周；b. 術后 12 周
Figure3. X-ray films of each groupFrom top to bottom for groups A, B, C, D, E, and F, respectively a. At 8 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
2.3 Micro-CT 觀測
術后 8 周，A～E 組均可見較清晰排列的骨小梁且骨小梁間髓腔較大；其中 B 組新生骨骨小梁最多，呈條索狀或板層狀，排列緊密；C 組新生骨小梁最少，呈條狀，連續性欠佳，骨小梁間間隙大。12 周時，A～E 組骨小梁均較 8 周時明顯增多，排列密集交錯，骨小梁間髓腔寬度明顯減小，B 組最小，A、C、D、E 組相近。見圖 4。
圖4
各組 Micro-CT 觀察
從上至下分別為 A、B、C、D、E、F 組a. 術后 8 周；b. 術后 12 周
Figure4. Micro-CT observation of each groupFrom top to bottom for groups A, B, C, D, E, and F, respectively a. At 8 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
術后 8 周：① BV/TV，B、D 組與 A、C、E 組比較，B、D 組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。② Tb.N，B、C、E 組與 A、D 組比較以及 B、C、E 組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。③ Tb.Th，組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。④ Tb.Sp，B 組與 D 組比較以及 C 組與 A、B、E 組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
各時間點 Micro-CT 檢測相關指標比較（n=6，）
Table1.
Comparison of Micro-CT detection related indexes at each time point (n=6, )
術后 12 周：① BV/TV，B、D 組與 C、E 組比較以及 B 組與 A 組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。② Tb.N，除 A、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。③ Tb.Th，組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。④ Tb.Sp，B 組與 A、C、D、E 組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
組內比較，術后 12 周 C 組 BV/TV 及 Tb.Sp、B 組 Tb.N 及 Tb.Th，D 組 Tb.Sp 與 8 周比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余指標組內比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
2.4 生物力學測試
術后 8 周：① 壓縮強度：C 組與 A、B、D、E 組比較，B 組與 D、E 組比較，A、E 組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。② 彈性模量：C 組與 A、B、D、E 組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
術后 12 周：① 壓縮強度：C 組與 A、B、D、E 組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。② 彈性模量：C 組與 A、B、E 組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
組內比較：各組 12 周時壓縮強度和彈性模量均大于 8 周，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
各時間點生物力學測試相關指標比較（n=6，）
Table2.
Comparison of biomechanical test related indexes at each time point (n=6, )
3 討論
3.1 骨缺損模型制備及修復膜應用
在骨缺損區，軟組織的修復速度較快，上皮細胞、成纖維細胞長入骨缺損區會對骨細胞產生競爭性抑制而不利于骨形成。而膜引導骨組織再生技術將屏障膜置于骨缺損區和軟組織之間，阻斷了上皮細胞和成纖維細胞的優先長入，允許具有成骨能力的細胞緩慢進入骨缺損區，達到定向修復骨缺損的目的。本實驗采用的屏障膜為吉特瑞醫用膠原修復膜，主要成分是從牛腱中提取的Ⅰ型膠原蛋白，宏觀結構為白色片狀薄膜，微觀結構為雙面多孔網狀片層，致密層保護骨組織再生所需空間，起屏障作用；疏松層有利于生長因子聚集、血管和骨細胞生長，起支架作用。
本研究中，12 周時 F 組骨缺損無法自行愈合，提示選擇的直徑 6 mm、深 8 mm 骨缺損模型滿足臨界性骨缺損要求[8]。X 線片檢查示，A～E 組骨缺損呈向心性生長，這與于威等[14]關于成骨的發現一致，分析原因是骨缺損中心血液運輸及再血管化均不及邊緣豐富，新生的膠原纖維網及各類細胞、骨小梁呈向心性減少。殷建等[15]也發現，在兔橈骨骨缺損區局部注射促血管生成素2能使組織工程人工骨早期血管化，促進成骨，進一步表明了血液運輸與成骨的關系。
3.2 Micro-CT 及生物力學觀測結果分析
本研究在新生骨微觀結構方面主要測量了 BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp4 個指標。 BV/TV 與骨形成總量成正相關，Tb.N 和 Tb.Th 與骨吸收量成負相關，Tb.Sp 與骨吸收量成正相關。Micro-CT 測量結果發現，術后 8、12 周時 B 組 BV/TV 及 Tb.N 最大、Tb.Sp 最小，C 組與之相反；提示 B 組新生骨所占比例較大、骨小梁數目較多、骨小梁排列更緊密，而 C 組新生骨所占比例較小、骨小梁數目較少，骨小梁間隙較寬。我們分析原因為 B 組 A-PRF 和 β-TCP 比例優于其他組，兩者充分發揮了各自骨誘導、骨引導作用。B 組復合物中 A-PRF 約占 67%，其三維立體網狀結構中含豐富血小板和生長因子。血小板濃聚能促進 MSCs 增殖，BMP-2 誘導其分化為軟骨和骨，生長因子促進細胞增殖分化和血管再生，尤其是 PDGF 和 VEGF[16-17]。劉鵬鶴等[18]也在臨床觀察中發現，富含血小板和生長因子的自體血纖維蛋白能促進前交叉韌帶重建術后腱-骨愈合。β-TCP 約占 33%，其顆粒直徑在 0.5～1.5 mm 之間，氣孔率 73%～82%，顆粒間存在不規則間隙[19-20]，它具有與天然松質骨相似的多孔狀結構及與正常骨組織相似的 Ca2+和 PO43-含量比值，有良好支架作用[21]，利于細胞攀附、新生血管長入[22-24]。雖然研究表明 A-PRF 從 14～21 d 逐漸開始降解，三維立體結構逐漸消失[25]，但仍然有大多數未降解的 β-TCP 在此過程中繼續發揮其骨引導作用，并降解釋放出 Ca2+和 PO43-為成骨細胞提供原材料，促進新骨形成[22]。 而 C 組成骨效果差可能是因為復合物中 A-PRF 約 80.0%，β-TCP 含量較少。雖然 A-PRF 富含生長因子，但降解周期較短，釋放生長因子時間也較短，且沒有足夠的 β-TCP 提供空間支架和成骨材料，成骨細胞沉積較少，骨小梁成熟度也差。
在生物力學試驗中，對標本的壓縮強度和彈性模量進行了測量，可以反映新生骨抵抗斷裂和抵抗變形的能力，以此評價新生骨力學性能。術后 8 周及 12 周，B 組壓縮強度和彈性模量最高，表明具有良好力學性能，與 Micro-CT 測量結果一致。
綜上述，A-PRF 與 β-TCP 復合物能促進骨缺損愈合，以 2∶1 比例復合后修復骨缺損效果更佳。為獲得更精確的復合比例，在后續的研究中我們將以 2∶1 為中心細化比例梯度，并且延長實驗周期，進一步對 A-PRF 與 β-TCP 相互作用機制，以及不同比例復合物成骨效果差異的原因進行深入研究。
