引用本文： 尚小可, 王輝輝, 李箭, 李棋. 前交叉韌帶重建同種異體移植物滅菌及保存方法的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(9): 1102-1107. doi: 10.7507/1002-1892.201903078 復制
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）斷裂臨床常見，多為運動傷和交通事故傷[1]。隨著關節鏡技術發展，關節鏡下重建已成為治療 ACL 損傷的標準術式。移植物是影響手術效果重要因素，目前臨床可選擇自體、同種異體移植物和人工韌帶[2]。其中，同種異體移植物優點突出，不僅具有與人工韌帶相似的優點[3]，如無供區并發癥、有多種規格可供選擇等，生物結構和功能方面與自體肌腱相似，而且無自體移植物相關的供區并發癥[4]。但醫生對同種異體移植物滅菌及保存過程不了解，使其臨床應用受到一定影響。美國一項調查研究顯示，曾經選擇同種異體移植物進行 ACL 重建的醫生中，僅 34% 左右熟悉滅菌及保存過程，21% 不清楚選用的移植物是否接受過輻照處理，高達 57% 的醫生不了解同種異體移植物的安全性和臨床效果[5]。鑒于此，我們對 ACL 重建術中使用的同種異體移植物滅菌、保存方法以及相關研究進展進行總結分析，以供參考。
1 同種異體移植物滅菌
1.1 滅菌必要性
滅菌重點針對 ACL 重建術后可能發生的感染。與感染相關的病原微生物包括細菌和病毒兩大類，細菌主要是在移植物取材、加工及保存過程中被污染，而病毒多直接來自于供體。因此，滅菌的目的是殺滅可能污染的病原微生物，同時避免病毒傳播。
1.1.1 細菌污染
同種異體移植物存在細菌污染的可能，一方面由于條件限制，多數情況下不能達到無菌取材；另一方面尸體存放時間過久，引起腐敗菌大量繁殖。文獻報道，同種異體移植物植入人體前常規細菌培養陽性率為 4.8%～13.2%，尸體供體組織平均污染率為 6.5%～53%[6]。Díaz-de-Rada 等[6]對 210 例同種異體移植物進行術前常規細菌培養，10 例培養結果陽性，其中 6 例為凝固酶陰性葡萄球菌、1 例a-鏈球菌、1 例大腸桿菌、1 例梭狀芽孢桿菌、1 例多細菌混合感染。然而，患者采用細菌培養陽性的移植物重建 ACL 后均未發生感染，相反 1 例采用陰性移植物重建后發生了金黃色葡萄球菌感染，提示術前移植物細菌培養陽性和術后患者發生感染間無直接相關性。但是由于 ACL 重建術后感染后果嚴重，有可能導致手術失敗甚至翻修，因此為慎重起見，有必要進行滅菌處理。
1.1.2 病毒傳播
同種異體移植物可能傳播的病毒包括 HIV 病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、西尼羅河病毒等[7]。目前報道的因植入同種異體移植物感染 HIV 病毒的患者有 3 例，首例報道于 1984 年，近 25 年來沒有新發病例[8]，這與近年嚴格的捐贈者篩查和檢測技術發展（如病毒核酸檢測）等有關。2003 年，美國疾病控制與預防中心（CDC）報道了 1 例因使用同種異體移植物行 ACL 重建發生丙型肝炎病毒感染病例，追蹤調查發現移植物來源于原始血清丙型肝炎病毒抗體檢測陰性但經核酸檢測呈陽性的患者，該病例提示僅采用標準血清酶學檢查存在病毒感染風險[9]。因此，美國食品與藥品管理局（FDA）和美國組織庫協會（AATB）分別于 2005 年和 2007 年要求使用更加敏感的篩檢方法篩查捐贈者。然而，即使嚴格篩選供體，文獻報道風險小于 0.015%，但同種異體移植物仍存在傳播疾病風險[10]，因此需要嚴格滅菌處理。
1.2 滅菌方法
美國 FDA 要求組織庫無菌保障水平（sterility assurance level，SAL）為 1×10–3，此水平通常無菌獲取移植物即可達到。而 AATB 要求組織庫如需認證，SAL 必須達到 1×10–6，該閾值意味著微生物在移植物上存活的風險小于 1/100 萬，除無菌獲取移植物外，還需要進行滅菌才能達到。目前多數組織庫建議移植物存貯 SAL 為 1×10–6，以最大限度降低術后感染風險[10]。為了達到該 SAL，可采用不同滅菌方法處理同種異體移植物，主要分為物理方法、化學方法和聯合方法。
1.2.1 物理方法
① γ 射線輻照：γ 射線是由放射性同位素 60Co 產生的電子束，通過電離輻射作用到被輻照物體上，產生電離和激發作用并釋放出軌道電子形成自由基，通過破壞微生物的 DNA 核酸分子、蛋白質以及細胞活性酶類起到滅菌作用[11]。γ 射線劑量單位有 kGy 和 Mrad（10 kGy=1 Mrad）。
γ 射線輻照對移植物的力學強度存在損害，超過 3 Mrad 輻照會破壞移植物膠原纖維，導致膠原纖維交聯密度減小，進而影響移植物結構性能和生物力學特性。然而，目前對于安全的輻照劑量仍沒有定論。2017 年，Lansdown 等[12]對不同劑量 γ 射線輻照后的移植物生物力學強度進行了 meta 分析，結果表明即使低劑量（≤20 kGy）輻照對移植物力學強度的影響也很復雜。當輻照劑量為 10～12 kGy 時，移植物剛度降低 20%；12～18 kGy 時，移植物生物力學強度無顯著改變；而增加至 20 kGy 時，移植物最大失敗載荷降低 20%。Yanke 等[13]也發現即使采用低劑量（1.0～1.2 Mrad）γ 射線輻照，移植物力學強度也會降低 20%。Fideler 等[14]報道采用 2.0 Mrad γ 射線照射新鮮冰凍同種異體骨-髕腱-骨后，其生物力學性能下降 15%。
如何平衡預防術后感染與減少輻照對移植物力學性能影響是學者們努力的方向。目前，用于抵消 γ 射線不良影響的措施包括低劑量 γ 射線結合化學處理方法、干冰內低溫下輻照[15-18]和添加輻照保護劑[19-20]等。但這些措施仍處于探索階段。
② 電子束（electronic beam，EB）：EB 滅菌法屬于冷加工滅菌技術范疇，是利用電子加速器輻照裝置產生高能 EB 進行輻照，使微生物 DNA 等發生不可逆變化，進而達到滅菌目的[21]。EB 滅菌法曾被認為是比 γ 射線輻照更有希望的方法，然而目前研究結果仍存在一些爭議。Hoburg 等[22]研究了不同劑量（15、25、34 kGy）EB 輻照 10 mm 寬骨-髕腱-骨移植物（移植物放入干冰中），與未經輻照移植物相比，15 kGy 和 25 kGy 輻照劑量下移植物最大失敗載荷和剛度無顯著降低；34 kGy 輻照下移植物最大失敗載荷下降約 20%。然而，Schmidt 等[21]采用 34 kGy EB 輻照綿羊趾淺屈肌腱，結果發現 EB 輻照會顯著改變移植物重塑過程，隨著時間推移移植物生物力學強度顯著降低。因此，EB 滅菌法的有效性及安全性還需要進一步驗證。
③ 巴氏消毒法、干熱及濕熱滅菌法：巴氏消毒法[23]、干熱及濕熱滅菌法是利用多數細菌不能耐受低溫、高溫、高壓等特殊環境及溫度來達到滅菌目的。巴氏消毒法不能殺滅所有微生物，一些耐熱或者耐冷的細菌仍然可以存活。此外，經巴氏消毒法處理后的物品其保存期短，最長為 2 周，因此不適合用于同種異體移植物的滅菌處理。
濕熱滅菌法常用于藥物生產過程中，利用高溫、高壓蒸汽作為介質使細菌蛋白質變性壞死而達到滅菌目的。干熱滅菌法要求溫度更高，主要用于凍干產品的滅菌處理，但是溫度過高容易導致膠原纖維脆性增加、彈性顯著降低。因此，干熱及濕熱滅菌法也不適合用于同種異體移植物的滅菌處理。
1.2.2 化學方法
① 環氧乙烷（ethylene oxide，ETO）：ETO 是一種廣譜高效的滅菌劑，常溫下呈氣態，可以與細菌、病毒等微生物的蛋白質、DNA 或 RNA 發生烷基化反應（非特異性），在常溫下殺滅包括芽孢、病毒、真菌等在內的各種微生物，在醫學及工業領域被廣泛應用。但是，ETO 易燃、易爆、有毒，對人體有一定毒性，并且穿透能力有限，這些因素限制了 ETO 的應用[24]。另外，ETO 代謝產物可殘留在物品或者材料上，例如氯乙醇乙烷以及乙二醇乙烷，這些殘留物會引發關節內滑膜炎癥，導致反復關節積液，損害移植物并造成手術失敗風險增加[25]。Drez 等[26]的一項研究顯示，與未處理的移植物相比，經 ETO 處理后的移植物最大應力下降 29%、剛度下降 43%。因此，AATB 不建議采用 ETO 對同種異體移植物進行滅菌處理。
② 藥物浸泡法：藥物浸泡法包括乙醇、過氧乙酸-乙醇、甲醇/氯仿等。乙醇浸泡法常用于醫療器械滅菌處理，較少用于同種異體移植物。同時乙醇浸泡滅菌能力有限，對病毒類微生物滅菌作用較弱。過氧乙酸-乙醇對于病毒等微生物具有較好的滅菌效果，但是其腐蝕性較強且具有強氧化性能，用于同種異體移植物等生物制品時風險極高。然而，Scheffler 等[27]發現過氧乙酸-乙醇處理同種異體跟腱、皮膚及軟骨時未對這些組織產生不利影響。因此，關于過氧乙酸-乙醇的處理效果還需要更多研究進行驗證。
1.2.3 聯合方法
物理方法與化學方法的綜合滅菌方法主要有 4 種。① BioCleanse?方法：BioCleanse?滅菌首先需要對移植物進行超聲洗浴處理，徹底清除在固定階段殘留的清洗劑、H2O2、乙醇等，然后反復進行真空-壓力循環促進基質滲透，破壞細菌細胞壁達到滅菌目的[28-29]。目前報道的采用 BioCleanse?方法對同種異體移植物進行滅菌處理效果差異較大，仍然存在爭議。Schimizzi 等[30]的生物力學測試結果顯示，BioCleanse?處理的同種異體移植物生物力學性能與 γ 射線輻照（20～26 kGy）處理的移植物以及新鮮冰凍肌腱相當。2017 年，Maletis 等[28]進行了一項包含 14 015 例患者的隊列研究，發現經 BioCleanse?滅菌處理的同種異體移植物重建后，翻修率比自體骨-髕腱-骨移植物重建高 4.67 倍；采用 BioCleanse?處理的同種異體移植物重建 ACL 后 2.5 年內，每 17 例患者就有 1 例面臨翻修風險。Tejwani 等[29]也報道采用 BioCleanse?處理的同種異體移植物重建 ACL 的失敗風險為 0～31%，并且將 BioCleanse?處理的同種異體移植物作為術后失敗獨立危險因素。
② Allowash、Allowash XG 和 AlloTrue 方法：Allowash 和 Allowash XG 兩種方法均包括了一系列沖洗、離心、低滲和超聲強化過程，區別是 Allowash 整個過程中不需要再輻照處理，而 Allowash XG 在滅菌最后階段需要低劑量（<2.0 Mrad）γ 射線輻照[28]。AlloTrue 有別于前兩種方法，除非移植物是在無菌條件下獲取的，否則大多數情況下需要低劑量（1～1.3 Mrad）γ 射線輻照。Tejwani 等[29]研究發現，相比于 BioCleanse?處理方法，使用 AlloWash 或 AlloTrue 未顯著增加患者術后翻修風險。但是由于目前研究比較少，還需要更多的臨床結果來驗證，以得出更確切結論。
③ MTF 和 Tutoplast：MTF 是美國肌肉骨骼移植基金會早年采用的一項滅菌技術，滅菌過程包括抗生素浸泡、攪拌、控制和純凈水沖洗，整個過程不使用 H2O2，40%～65% 移植物在冷凍狀態下接受預先輻照處理，輻照劑量通常選擇低劑量（1.2～1.8 Mrad）[31]。而 Tutoplast 滅菌法需要使用 H2O2，其次還包括超聲強化、丙酮、高滲溶液、NaOH 等，與 MTF 一樣最終需低劑量 γ 射線（1.78～2.01 Mrad）輻照處理。根據文獻報道采用 Tutoplast 處理的移植物重建 ACL 后，6 年內失敗率達 45%[32]，因此目前已經很少使用。
④ 超臨界 CO2 消毒（super critical CO2，SCCO2）：SCCO2 既往多應用于化學工業、分離工程和材料制備等領域[33]，近年來有學者將其用于同種異體移植物的滅菌處理[34]。移植物密封后置于充滿 CO2 的艙內進行升壓，直到 CO2 由氣態變為液態，利用 SCCO2 對物體的超強滲透能力作用于微生物，改變微生物生長環境，影響新陳代謝，最終起到殺菌作用。有研究比較了 SCCO2 消毒方法、γ 射線輻照（2.0～2.8 Mrad）和未處理的同種異體肌腱，結果發現 SCCO2 滅菌沒有顯著降低同種異體肌腱強度，在循環測試的生物力學試驗中顯示了良好的力學性能[35]。SCCO2 滅菌法的原理及效果目前尚缺乏更多研究數據，同時由于移植物需要在 CO2 艙內進行升壓，是否會影響移植物的膠原纖維特性還需要更多研究。
2 同種異體移植物保存
同種異體移植物保存方法主要有冷凍保存、玻璃化法保存和凍干保存 3 類，其中冷凍保存可進一步分為普通低溫保存、深低溫保存和超深低溫保存。
2.1 冷凍保存
普通低溫保存、深低溫保存和超深低溫保存的區別是保存溫度不同[36]。普通低溫保存通常保存于?20℃ 冰箱中；超深低溫保存保存于?196℃ 液氮中；深低溫保存通常采用緩慢梯度降溫后，將肌腱存儲于?80℃ 環境中[37]。
移植物冷凍保存過程中細胞內外容易形成大量冰晶，冰晶對移植物的損害作用主要有兩點，一是引起細胞機械性破壞，二是因胞內水分結冰電解質濃縮導致細胞中毒死亡[38-39]。為了減少冰晶引起的細胞損害，移植物凍融過程采取“緩慢降溫、快速復溫”原則[40]。冷凍保存的同種異體移植物復溫時細胞外冰晶先溶解，因此吸收了細胞周圍大量熱能，導致細胞內冰晶進一步形成，緩慢融凍加劇了這一惡性循環。然而，快速復溫由于短期溫度較高，除了滿足細胞外冰晶融化的需要外，細胞內的冰晶融化也得以滿足，因此對組織破壞小，相對起到保護作用。
2.2 玻璃化法保存
玻璃化法又稱為無冰晶技術或少冰晶技術，采用高濃度溶液單相快速降溫技術，使溶液直接進入玻璃化狀態，減少冰晶形成，避免移植物內部因冰晶形成而造成擠壓損傷和凍融效應，有效保存了組織及細胞的活性。有研究比較了冷凍保存和玻璃化法對肌腱細胞活性的影響，結果顯示冷凍保存下肌腱細胞的存活率只有 49.63%、而玻璃化法為 78.49%[41]。冷凍保存時肌腱細胞皺縮變形，甚至變性壞死明顯，膠原排列紊亂，細胞外基質不同程度損傷。而玻璃化法盡管對肌腱細胞也有損傷，但是損傷輕微，尤其對于膠原纖維及細胞外基質損傷較輕，有研究報道玻璃化法保存后 45%～80% 肌腱細胞能在低免疫原性狀態下存活[42]。
2.3 凍干保存
凍干保存肌腱凍干前先經過低溫冷凍 4 h，然后在低溫真空負壓下脫水升華消耗水分，使水分含量低于 5%，使用前生理鹽水中充分水化至少 30 min。凍干保存最大優勢是攜帶和保存方便，室溫下可保存 5 年左右[43]。
學者們對于凍干移植物重建 ACL 的效果進行了大量研究，但是總體結果不理想，尤其是凍干處理結合環氧乙烷消毒或者 γ 射線輻照時術后失敗率較高[44-45]。Sterling 等[46]隨訪了 36 例采用凍干處理骨-髕腱-骨重建 ACL 患者臨床效果，移植物在植入前同時接受了環氧乙烷消毒，術后 2 年隨訪發現 8 例患者發生了移植物溶解失效。Gut 等[47]發現即使是相同劑量的 γ 射線輻照，凍干同種異體移植物的生物力學強度下降幅度是新鮮冷凍移植物的 2 倍；35 kGy γ 射線輻照下，凍干同種異體移植物的最大失敗載荷相較新鮮自體移植物下降 40%。
3 總結
合理選擇同種異體移植物是 ACL 重建手術成功的關鍵。同種異體移植物在取材、加工及保存過程中可能存在細菌污染以及來源供體存在病毒的風險，因此有必要進行滅菌處理。目前最常用的滅菌方法是 γ 射線輻照，但是最佳輻照劑量仍不清楚。EB 輻照也是可供選擇滅菌方法之一，但輻照劑量過大對移植物改造塑形有明顯影響。物理與化學方法結合的聯合方法仍處于探索階段。對于同種異體移植物的保存，深低溫冷凍是目前最常用的一種方法。采用深低溫冷凍移植物時，應堅持“緩慢降溫，快速復溫”的原則，以減少冰晶對移植物的影響。凍干保存結合輻照處理對移植物生物學性能有明顯影響，因此不宜用于同種異體移植物的處理。臨床醫生選擇重建 ACL 的同種異體移植物時，應該綜合考慮上述因素。
作者貢獻：尚小可查閱文獻、搜集和整理文獻，并撰寫文章；王輝輝查閱并整理文獻；李箭審校文章；李棋整理文獻并審校文章。
利益沖突：所有作者聲明，在文章撰寫過程中不存在任何利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點。
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）斷裂臨床常見，多為運動傷和交通事故傷[1]。隨著關節鏡技術發展，關節鏡下重建已成為治療 ACL 損傷的標準術式。移植物是影響手術效果重要因素，目前臨床可選擇自體、同種異體移植物和人工韌帶[2]。其中，同種異體移植物優點突出，不僅具有與人工韌帶相似的優點[3]，如無供區并發癥、有多種規格可供選擇等，生物結構和功能方面與自體肌腱相似，而且無自體移植物相關的供區并發癥[4]。但醫生對同種異體移植物滅菌及保存過程不了解，使其臨床應用受到一定影響。美國一項調查研究顯示，曾經選擇同種異體移植物進行 ACL 重建的醫生中，僅 34% 左右熟悉滅菌及保存過程，21% 不清楚選用的移植物是否接受過輻照處理，高達 57% 的醫生不了解同種異體移植物的安全性和臨床效果[5]。鑒于此，我們對 ACL 重建術中使用的同種異體移植物滅菌、保存方法以及相關研究進展進行總結分析，以供參考。
1 同種異體移植物滅菌
1.1 滅菌必要性
滅菌重點針對 ACL 重建術后可能發生的感染。與感染相關的病原微生物包括細菌和病毒兩大類，細菌主要是在移植物取材、加工及保存過程中被污染，而病毒多直接來自于供體。因此，滅菌的目的是殺滅可能污染的病原微生物，同時避免病毒傳播。
1.1.1 細菌污染
同種異體移植物存在細菌污染的可能，一方面由于條件限制，多數情況下不能達到無菌取材；另一方面尸體存放時間過久，引起腐敗菌大量繁殖。文獻報道，同種異體移植物植入人體前常規細菌培養陽性率為 4.8%～13.2%，尸體供體組織平均污染率為 6.5%～53%[6]。Díaz-de-Rada 等[6]對 210 例同種異體移植物進行術前常規細菌培養，10 例培養結果陽性，其中 6 例為凝固酶陰性葡萄球菌、1 例a-鏈球菌、1 例大腸桿菌、1 例梭狀芽孢桿菌、1 例多細菌混合感染。然而，患者采用細菌培養陽性的移植物重建 ACL 后均未發生感染，相反 1 例采用陰性移植物重建后發生了金黃色葡萄球菌感染，提示術前移植物細菌培養陽性和術后患者發生感染間無直接相關性。但是由于 ACL 重建術后感染后果嚴重，有可能導致手術失敗甚至翻修，因此為慎重起見，有必要進行滅菌處理。
1.1.2 病毒傳播
同種異體移植物可能傳播的病毒包括 HIV 病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、西尼羅河病毒等[7]。目前報道的因植入同種異體移植物感染 HIV 病毒的患者有 3 例，首例報道于 1984 年，近 25 年來沒有新發病例[8]，這與近年嚴格的捐贈者篩查和檢測技術發展（如病毒核酸檢測）等有關。2003 年，美國疾病控制與預防中心（CDC）報道了 1 例因使用同種異體移植物行 ACL 重建發生丙型肝炎病毒感染病例，追蹤調查發現移植物來源于原始血清丙型肝炎病毒抗體檢測陰性但經核酸檢測呈陽性的患者，該病例提示僅采用標準血清酶學檢查存在病毒感染風險[9]。因此，美國食品與藥品管理局（FDA）和美國組織庫協會（AATB）分別于 2005 年和 2007 年要求使用更加敏感的篩檢方法篩查捐贈者。然而，即使嚴格篩選供體，文獻報道風險小于 0.015%，但同種異體移植物仍存在傳播疾病風險[10]，因此需要嚴格滅菌處理。
1.2 滅菌方法
美國 FDA 要求組織庫無菌保障水平（sterility assurance level，SAL）為 1×10–3，此水平通常無菌獲取移植物即可達到。而 AATB 要求組織庫如需認證，SAL 必須達到 1×10–6，該閾值意味著微生物在移植物上存活的風險小于 1/100 萬，除無菌獲取移植物外，還需要進行滅菌才能達到。目前多數組織庫建議移植物存貯 SAL 為 1×10–6，以最大限度降低術后感染風險[10]。為了達到該 SAL，可采用不同滅菌方法處理同種異體移植物，主要分為物理方法、化學方法和聯合方法。
1.2.1 物理方法
① γ 射線輻照：γ 射線是由放射性同位素 60Co 產生的電子束，通過電離輻射作用到被輻照物體上，產生電離和激發作用并釋放出軌道電子形成自由基，通過破壞微生物的 DNA 核酸分子、蛋白質以及細胞活性酶類起到滅菌作用[11]。γ 射線劑量單位有 kGy 和 Mrad（10 kGy=1 Mrad）。
γ 射線輻照對移植物的力學強度存在損害，超過 3 Mrad 輻照會破壞移植物膠原纖維，導致膠原纖維交聯密度減小，進而影響移植物結構性能和生物力學特性。然而，目前對于安全的輻照劑量仍沒有定論。2017 年，Lansdown 等[12]對不同劑量 γ 射線輻照后的移植物生物力學強度進行了 meta 分析，結果表明即使低劑量（≤20 kGy）輻照對移植物力學強度的影響也很復雜。當輻照劑量為 10～12 kGy 時，移植物剛度降低 20%；12～18 kGy 時，移植物生物力學強度無顯著改變；而增加至 20 kGy 時，移植物最大失敗載荷降低 20%。Yanke 等[13]也發現即使采用低劑量（1.0～1.2 Mrad）γ 射線輻照，移植物力學強度也會降低 20%。Fideler 等[14]報道采用 2.0 Mrad γ 射線照射新鮮冰凍同種異體骨-髕腱-骨后，其生物力學性能下降 15%。
如何平衡預防術后感染與減少輻照對移植物力學性能影響是學者們努力的方向。目前，用于抵消 γ 射線不良影響的措施包括低劑量 γ 射線結合化學處理方法、干冰內低溫下輻照[15-18]和添加輻照保護劑[19-20]等。但這些措施仍處于探索階段。
② 電子束（electronic beam，EB）：EB 滅菌法屬于冷加工滅菌技術范疇，是利用電子加速器輻照裝置產生高能 EB 進行輻照，使微生物 DNA 等發生不可逆變化，進而達到滅菌目的[21]。EB 滅菌法曾被認為是比 γ 射線輻照更有希望的方法，然而目前研究結果仍存在一些爭議。Hoburg 等[22]研究了不同劑量（15、25、34 kGy）EB 輻照 10 mm 寬骨-髕腱-骨移植物（移植物放入干冰中），與未經輻照移植物相比，15 kGy 和 25 kGy 輻照劑量下移植物最大失敗載荷和剛度無顯著降低；34 kGy 輻照下移植物最大失敗載荷下降約 20%。然而，Schmidt 等[21]采用 34 kGy EB 輻照綿羊趾淺屈肌腱，結果發現 EB 輻照會顯著改變移植物重塑過程，隨著時間推移移植物生物力學強度顯著降低。因此，EB 滅菌法的有效性及安全性還需要進一步驗證。
③ 巴氏消毒法、干熱及濕熱滅菌法：巴氏消毒法[23]、干熱及濕熱滅菌法是利用多數細菌不能耐受低溫、高溫、高壓等特殊環境及溫度來達到滅菌目的。巴氏消毒法不能殺滅所有微生物，一些耐熱或者耐冷的細菌仍然可以存活。此外，經巴氏消毒法處理后的物品其保存期短，最長為 2 周，因此不適合用于同種異體移植物的滅菌處理。
濕熱滅菌法常用于藥物生產過程中，利用高溫、高壓蒸汽作為介質使細菌蛋白質變性壞死而達到滅菌目的。干熱滅菌法要求溫度更高，主要用于凍干產品的滅菌處理，但是溫度過高容易導致膠原纖維脆性增加、彈性顯著降低。因此，干熱及濕熱滅菌法也不適合用于同種異體移植物的滅菌處理。
1.2.2 化學方法
① 環氧乙烷（ethylene oxide，ETO）：ETO 是一種廣譜高效的滅菌劑，常溫下呈氣態，可以與細菌、病毒等微生物的蛋白質、DNA 或 RNA 發生烷基化反應（非特異性），在常溫下殺滅包括芽孢、病毒、真菌等在內的各種微生物，在醫學及工業領域被廣泛應用。但是，ETO 易燃、易爆、有毒，對人體有一定毒性，并且穿透能力有限，這些因素限制了 ETO 的應用[24]。另外，ETO 代謝產物可殘留在物品或者材料上，例如氯乙醇乙烷以及乙二醇乙烷，這些殘留物會引發關節內滑膜炎癥，導致反復關節積液，損害移植物并造成手術失敗風險增加[25]。Drez 等[26]的一項研究顯示，與未處理的移植物相比，經 ETO 處理后的移植物最大應力下降 29%、剛度下降 43%。因此，AATB 不建議采用 ETO 對同種異體移植物進行滅菌處理。
② 藥物浸泡法：藥物浸泡法包括乙醇、過氧乙酸-乙醇、甲醇/氯仿等。乙醇浸泡法常用于醫療器械滅菌處理，較少用于同種異體移植物。同時乙醇浸泡滅菌能力有限，對病毒類微生物滅菌作用較弱。過氧乙酸-乙醇對于病毒等微生物具有較好的滅菌效果，但是其腐蝕性較強且具有強氧化性能，用于同種異體移植物等生物制品時風險極高。然而，Scheffler 等[27]發現過氧乙酸-乙醇處理同種異體跟腱、皮膚及軟骨時未對這些組織產生不利影響。因此，關于過氧乙酸-乙醇的處理效果還需要更多研究進行驗證。
1.2.3 聯合方法
物理方法與化學方法的綜合滅菌方法主要有 4 種。① BioCleanse?方法：BioCleanse?滅菌首先需要對移植物進行超聲洗浴處理，徹底清除在固定階段殘留的清洗劑、H2O2、乙醇等，然后反復進行真空-壓力循環促進基質滲透，破壞細菌細胞壁達到滅菌目的[28-29]。目前報道的采用 BioCleanse?方法對同種異體移植物進行滅菌處理效果差異較大，仍然存在爭議。Schimizzi 等[30]的生物力學測試結果顯示，BioCleanse?處理的同種異體移植物生物力學性能與 γ 射線輻照（20～26 kGy）處理的移植物以及新鮮冰凍肌腱相當。2017 年，Maletis 等[28]進行了一項包含 14 015 例患者的隊列研究，發現經 BioCleanse?滅菌處理的同種異體移植物重建后，翻修率比自體骨-髕腱-骨移植物重建高 4.67 倍；采用 BioCleanse?處理的同種異體移植物重建 ACL 后 2.5 年內，每 17 例患者就有 1 例面臨翻修風險。Tejwani 等[29]也報道采用 BioCleanse?處理的同種異體移植物重建 ACL 的失敗風險為 0～31%，并且將 BioCleanse?處理的同種異體移植物作為術后失敗獨立危險因素。
② Allowash、Allowash XG 和 AlloTrue 方法：Allowash 和 Allowash XG 兩種方法均包括了一系列沖洗、離心、低滲和超聲強化過程，區別是 Allowash 整個過程中不需要再輻照處理，而 Allowash XG 在滅菌最后階段需要低劑量（<2.0 Mrad）γ 射線輻照[28]。AlloTrue 有別于前兩種方法，除非移植物是在無菌條件下獲取的，否則大多數情況下需要低劑量（1～1.3 Mrad）γ 射線輻照。Tejwani 等[29]研究發現，相比于 BioCleanse?處理方法，使用 AlloWash 或 AlloTrue 未顯著增加患者術后翻修風險。但是由于目前研究比較少，還需要更多的臨床結果來驗證，以得出更確切結論。
③ MTF 和 Tutoplast：MTF 是美國肌肉骨骼移植基金會早年采用的一項滅菌技術，滅菌過程包括抗生素浸泡、攪拌、控制和純凈水沖洗，整個過程不使用 H2O2，40%～65% 移植物在冷凍狀態下接受預先輻照處理，輻照劑量通常選擇低劑量（1.2～1.8 Mrad）[31]。而 Tutoplast 滅菌法需要使用 H2O2，其次還包括超聲強化、丙酮、高滲溶液、NaOH 等，與 MTF 一樣最終需低劑量 γ 射線（1.78～2.01 Mrad）輻照處理。根據文獻報道采用 Tutoplast 處理的移植物重建 ACL 后，6 年內失敗率達 45%[32]，因此目前已經很少使用。
④ 超臨界 CO2 消毒（super critical CO2，SCCO2）：SCCO2 既往多應用于化學工業、分離工程和材料制備等領域[33]，近年來有學者將其用于同種異體移植物的滅菌處理[34]。移植物密封后置于充滿 CO2 的艙內進行升壓，直到 CO2 由氣態變為液態，利用 SCCO2 對物體的超強滲透能力作用于微生物，改變微生物生長環境，影響新陳代謝，最終起到殺菌作用。有研究比較了 SCCO2 消毒方法、γ 射線輻照（2.0～2.8 Mrad）和未處理的同種異體肌腱，結果發現 SCCO2 滅菌沒有顯著降低同種異體肌腱強度，在循環測試的生物力學試驗中顯示了良好的力學性能[35]。SCCO2 滅菌法的原理及效果目前尚缺乏更多研究數據，同時由于移植物需要在 CO2 艙內進行升壓，是否會影響移植物的膠原纖維特性還需要更多研究。
2 同種異體移植物保存
同種異體移植物保存方法主要有冷凍保存、玻璃化法保存和凍干保存 3 類，其中冷凍保存可進一步分為普通低溫保存、深低溫保存和超深低溫保存。
2.1 冷凍保存
普通低溫保存、深低溫保存和超深低溫保存的區別是保存溫度不同[36]。普通低溫保存通常保存于?20℃ 冰箱中；超深低溫保存保存于?196℃ 液氮中；深低溫保存通常采用緩慢梯度降溫后，將肌腱存儲于?80℃ 環境中[37]。
移植物冷凍保存過程中細胞內外容易形成大量冰晶，冰晶對移植物的損害作用主要有兩點，一是引起細胞機械性破壞，二是因胞內水分結冰電解質濃縮導致細胞中毒死亡[38-39]。為了減少冰晶引起的細胞損害，移植物凍融過程采取“緩慢降溫、快速復溫”原則[40]。冷凍保存的同種異體移植物復溫時細胞外冰晶先溶解，因此吸收了細胞周圍大量熱能，導致細胞內冰晶進一步形成，緩慢融凍加劇了這一惡性循環。然而，快速復溫由于短期溫度較高，除了滿足細胞外冰晶融化的需要外，細胞內的冰晶融化也得以滿足，因此對組織破壞小，相對起到保護作用。
2.2 玻璃化法保存
玻璃化法又稱為無冰晶技術或少冰晶技術，采用高濃度溶液單相快速降溫技術，使溶液直接進入玻璃化狀態，減少冰晶形成，避免移植物內部因冰晶形成而造成擠壓損傷和凍融效應，有效保存了組織及細胞的活性。有研究比較了冷凍保存和玻璃化法對肌腱細胞活性的影響，結果顯示冷凍保存下肌腱細胞的存活率只有 49.63%、而玻璃化法為 78.49%[41]。冷凍保存時肌腱細胞皺縮變形，甚至變性壞死明顯，膠原排列紊亂，細胞外基質不同程度損傷。而玻璃化法盡管對肌腱細胞也有損傷，但是損傷輕微，尤其對于膠原纖維及細胞外基質損傷較輕，有研究報道玻璃化法保存后 45%～80% 肌腱細胞能在低免疫原性狀態下存活[42]。
2.3 凍干保存
凍干保存肌腱凍干前先經過低溫冷凍 4 h，然后在低溫真空負壓下脫水升華消耗水分，使水分含量低于 5%，使用前生理鹽水中充分水化至少 30 min。凍干保存最大優勢是攜帶和保存方便，室溫下可保存 5 年左右[43]。
學者們對于凍干移植物重建 ACL 的效果進行了大量研究，但是總體結果不理想，尤其是凍干處理結合環氧乙烷消毒或者 γ 射線輻照時術后失敗率較高[44-45]。Sterling 等[46]隨訪了 36 例采用凍干處理骨-髕腱-骨重建 ACL 患者臨床效果，移植物在植入前同時接受了環氧乙烷消毒，術后 2 年隨訪發現 8 例患者發生了移植物溶解失效。Gut 等[47]發現即使是相同劑量的 γ 射線輻照，凍干同種異體移植物的生物力學強度下降幅度是新鮮冷凍移植物的 2 倍；35 kGy γ 射線輻照下，凍干同種異體移植物的最大失敗載荷相較新鮮自體移植物下降 40%。
3 總結
合理選擇同種異體移植物是 ACL 重建手術成功的關鍵。同種異體移植物在取材、加工及保存過程中可能存在細菌污染以及來源供體存在病毒的風險，因此有必要進行滅菌處理。目前最常用的滅菌方法是 γ 射線輻照，但是最佳輻照劑量仍不清楚。EB 輻照也是可供選擇滅菌方法之一，但輻照劑量過大對移植物改造塑形有明顯影響。物理與化學方法結合的聯合方法仍處于探索階段。對于同種異體移植物的保存，深低溫冷凍是目前最常用的一種方法。采用深低溫冷凍移植物時，應堅持“緩慢降溫，快速復溫”的原則，以減少冰晶對移植物的影響。凍干保存結合輻照處理對移植物生物學性能有明顯影響，因此不宜用于同種異體移植物的處理。臨床醫生選擇重建 ACL 的同種異體移植物時，應該綜合考慮上述因素。
作者貢獻：尚小可查閱文獻、搜集和整理文獻，并撰寫文章；王輝輝查閱并整理文獻；李箭審校文章；李棋整理文獻并審校文章。
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