引用本文： 李曉龍, 孔清泉. 微小 RNA 在 MSCs 成骨分化中的調控作用及在骨科疾病中作為治療靶點和診斷工具的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(10): 1332-1340. doi: 10.7507/1002-1892.201912092 復制
創傷、骨質疏松癥、骨關節炎（osteoarthritis，OA）和骨腫瘤等疾病會導致骨量減少、骨缺損、骨折不愈合以及股骨頭壞死等，帶來巨大的社會和經濟負擔，并且嚴重影響患者的生活質量。骨組織有很強的再生能力，通過成骨細胞和破骨細胞的協同作用形成新的骨組織，來維持人體正常骨代謝的動態平衡。成骨作用開始于 MSCs 分化為成熟的成骨細胞，因此骨質疏松癥和 OA 等疾病的防治可以考慮加強 MSCs 的成骨作用和促進新骨形成[1]。近年來，諸多研究發現一些關鍵的信號通路參與成骨分化的調控，如 TGF-β/BMP-Smads、Wnt/β-catenin、Notch、猬因子（Hedgehog，Hh）、FGF、絲裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等[2]。除上述信號通路外，激素、生長因子、趨化因子、細胞因子、DNA 甲基化、微小 RNA（microRNA，miRNA）和染色質結構改變等也參與調控成骨分化[3-5]。目前實驗證據表明，miRNAs 在 MSCs 成骨分化調控中發揮著關鍵作用，但是具體作用機制和細節尚未完全闡明。本綜述就 miRNAs 對成骨分化調控作用的研究現狀及在骨科疾病中作為治療靶點和診斷工具的應用研究進展進行總結。
1 miRNAs 的定義與功能
miRNAs 廣泛存在于真核生物中，是一種內源性非編碼長度為 20～22 個核苷酸的小 RNAs，具有高度保守性、時序性和組織特異性[6]。miRNAs 通過對 mRNAs 切割、降解，翻譯抑制或甲基化靶基因，轉錄后對約 60% 的編碼基因表達進行調控，因此在諸多疾病中發揮著潛在的重要作用[7]。miRNAs只占人類基因組中的 1%～5%，但 1 條 miRNA 通常可以調控數十甚至數百個基因[8]。最早發現的 miRNA 是 lin-4，Lee 等[9]在 1993 年研究線蟲時發現基因 lin-4 能夠抑制基因 lin-14，認為基因 lin-4 是通過表達一種調控蛋白來發揮作用。后來研究發現這個基因的產物是單鏈 RNA[10]。miRNAs 已成為近年研究熱點，截止 2018 年 10 月，miRBase 數據庫已收錄 271 個物種的 38 589 條 miRNAs。
miRNAs 的加工成熟過程與 mRNAs 類似，需要經歷核酸酶的剪切加工及堿基互補配對等一系列復雜過程，根據堿基互補配對原則，在結合 3’UTR 時如果堿基不完全匹配，則抑制靶基因蛋白翻譯；若完全匹配，靶基因 mRNAs 降解[11]。靶基因預測工具如 PicTar 等軟件和熒光素酶報告質粒系統，原理均是設計出 3’UTR 端堿基序列來實現互補配對[12]。此外，miRNAs 與靶基因 mRNAs 不是完全一一對應的，每條 miRNA 都含有多個 mRNAs 靶點，多條 miRNAs 也可以作用于同一條 mRNA。
miRNAs 在細胞生長、發育、分化、凋亡等生物過程中起著重要作用，同時也廣泛參與血細胞生成、胰島素分泌、神經系統發育和人類癌細胞生長等過程[13]。例如 miRNA-140，研究顯示其在 MSCs 成骨分化中表達增高，而抑制成骨分化時表達明顯降低，提示 miRNA-140 可能參與 MSCs 成骨分化的調控作用[14]。
2 miRNAs 在成骨分化中的調控作用
Kobayashi 等[15]首先證實敲除小鼠體內由Ⅱ型 α1 膠原基因（collagen type Ⅱ alpha 1，COL2A1）介導的 RNAse Ⅲ核酸內切酶 Dicer，會導致嚴重的骨生成障礙和小鼠死亡。Gaur 等[16]隨后進一步驗證了位于成骨細胞中的 Dicer 是通過沉默重組酶起作用，而這些重組酶是由小鼠Ⅰ型 α1 膠原基因或者人類骨羧谷氨酸蛋白/骨鈣蛋白基因啟動并表達的。成骨細胞中的 Dicer 敲除或沉默后，細胞內 miRNAs 生成會發生障礙，最后導致小鼠肢體發育障礙，說明 miRNAs 的表達在 MSCs 成骨分化中起著非常關鍵的作用。多數經過驗證的 miRNAs 是通過直接關聯組織特異性分化的中心調控基因起作用，因此從 miRNAs 角度尋找調控 MSCs 成骨分化的關鍵基因可行。目前大量實驗證據證實 miRNAs 不只作用于 1 個基因，而是同時作用于多個基因，它具有雙向性，即抑制一部分基因表達，同時促進另外一部分基因表達，兩者最終的結果是疊加的，而不是相互拮抗的[17-19]。這一機制可能是體內互轉化的關鍵因素，即抑制向一種細胞表型分化，促進向另一種細胞表型轉化。即 miRNAs 對 MSCs 的成骨作用是正反兩面的，一方面通過作用于促進成骨的靶基因表達而直接抑制成骨作用；另一方面是作用于抑制成骨作用的靶基因，間接對 MSCs 成骨作用進行正向調節[20]。
3 抑制成骨分化的 miRNAs
Wei 等[18]發現在人牙周韌帶干細胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）成骨分化過程中，miRNA-21 表達下降。作者通過構建 miRNA-21 表達載體 pGC-LV-pre-miRNA-21-GFP 刺激 miRNA-21 過表達，hPDLSCs 的成骨分化受抑制；相反，構建抗 miRNA-21 表達載體 pGC-LV-anti-miRNA-21-GFP 抑制 miRNA-21 表達，則會促進 hPDLSCs 的成骨分化。進一步研究發現，miRNA-21 是通過抑制對細胞增殖有調節作用的 Smad5 基因發揮作用的。BMP-9 被確認是 BMP 家族中誘導成骨分化的重要成員，但具體誘導機制一直不明確[21]。近年，Liu 等[22]發現 miRNA-155 能夠顯著下調 BMP-9 誘導的 MSCs 成骨分化，通過抑制 BMP 信號通路上的靶基因 Runt 相關轉錄因子 2（runt-related transcription factor 2，Runx2）和 BMP 受體 2 來發揮作用。隨后，Lin 等[23]發現 BMP-2 可誘導小鼠 MC3T3-E1 細胞成骨分化，miRNA-92a-1-5p 表達明顯下調，miRNA-92a-1-5p 對成骨分化起抑制作用，是通過負性調控 β-catenin 基因來實現。Saiganesh 等[24]發現轉錄因子 TGF-β1 能減弱 miRNA-203a-5p 在 MSCs 成骨分化過程中的表達，同時 miRNA-203a-5p 對基質金屬蛋白酶 13（matrix metalloproteinases 13，MMP-13）基因有抑制作用，MMP-13 過表達會促進成骨分化，這樣就建立了一種 TGF-β1 抑制 miRNA-203a-5p，使 MMP-13 的抑制得到釋放的前反饋調節機制。
miRNA-16-2-3p 是新近發現的一種 miRNA，研究證明其可作為標記物用于診斷肝癌、宮頸癌和慢性淋巴細胞白血病和評估預后[25]。最近，Duan 等[26]研究了 miRNA-16-2-3p 調節成骨分化的具體機制，作者發現 46 例骨質疏松癥患者骨組織樣本中的 miRNA-16-2-3p，其表達與骨形成相關基因 Runx2、成骨相關轉錄因子（osterix，Osx）和 ALP 的表達成負相關。當上調 miRNA-16-2-3p 時，人 BMSCs 成骨分化過程受阻，miRNA-16-2-3p 直接作用靶基因 Wnt5A 限制 Wnt 信號通路；如果下調 miRNA-16-2-3p，成骨分化明顯增加，進一步剔除 miRNA-16-2-3p 后會激活 Runx2 基因，作者推測這可能和 Wnt 信號通路的限制被解除有關。Duan 等認為 miRNA-16-2-3p 是通過阻礙 Wnt5A 介導的 Wnt 信號通路，來抑制人 BMSCs 成骨分化作用的。miRNA-16-2-3p 可望成為一種新型治療靶點，通過抑制 miRNA-16-2-3p，從而促進 MSCs 分化為成骨細胞，并最終重建骨組織。同樣，Wang 等[27]研究了 miRNA-193a 對人 BMSCs 成骨分化的影響，他們發現 miRNA-193a 通過直接作用于靶基因 HMGB1 的 3’UTR 端，反向激活與成骨分化相關聯的 MAPK 和 Wnt/β-catenin 信號通路，從而顯著抑制 MSCs 的成骨分化。
長鏈非編碼 RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）同 miRNAs 一樣，也是參與生長發育、細胞分化和分子轉錄過程的重要調控因子。位于其中的抗分化非編碼 RNA（anti-differentiation non-coding RNA，ANCR），是近年來發現的可負調控 MSCs 分化的 RNA[28]。lncRNAs 與 miRNAs 之間的關系可以概括為以下 4 種：lncRNAs 生成 miRNAs；lncRNAs 與 miRNAs 競爭 mRNAs 靶點；lncRNAs 作為 miRNAs 的海綿，長效抑制 miRNAs；miRNAs 結合 lncRNAs 后降低其穩定性[29]。Peng 等[30]在研究 lncRNA-ANCR 時發現，lncRNA-ANCR 能抑制 hPDLSCs 的成骨分化，過表達 lncRNA-ANCR 時 miRNA-758 的表達會下降；反之，如果抑制 lncRNA-ANCR，miRNA-758 的表達會增加。因此作者認為，lncRNA-ANCR 與 miRNAs 之間的關系是 lncRNA-ANCR 是抑制 miRNAs 的海綿。作者通過進一步靶點預測和驗證，發現 miRNA-758 能直接結合 Notch2 的 3’UTR 端第 3222～3228 組堿基，而對 Notch2 起抑制作用。Notch2 是 Wnt/β-catenin 信號通路的關鍵分子，miRNA-758 通過直接抑制 Notch2 而阻礙 Wnt/β-catenin 信號通路。即 lncRNA-ANCR 是通過 lncRNA-ANCR/miRNA-758/Notch2 軸調控 hPDLSCs 成骨分化的。
目前發現 Hh 信號通路和 OA 的發生密切相關。Woods 等[31]研究了 miRNAs 在 OA 中的作用機制，研究對象分別選用人 MSCs 和小鼠 C3H10T1/2 細胞系，結果發現人和小鼠 miRNA-324-5p 均能通過 Hh 信號通路對 MSCs 成骨分化負調控；但重要的是，兩者的作用靶基因并不相同，人類 miRNA-324-5p 的靶基因是 Smo 和 Gli1，小鼠 miRNA-324-5p 的靶基因是 Gpc1。作者強調在人類疾病的研究中，選擇人類細胞作為研究對象非常重要，尤其是涉及 miRNAs 與 Hh 信號通路的研究。一種 miRNAs 可以同時作用多個靶基因，比如 miRNA-141。Fariyike 等[32]在研究 miRNA-141 對老化骨骼肌肉系統中的 MSCs 如何起作用時，找到了多個 miRNA-141 的靶基因，包括 SVCT2、SDF1、ZMPSTE24、CDC25 A、Dlx5、BMI1、TGFb1、ICAM-1、PTEN 和 PAPP-A。由于 miRNAs 能結合多個靶基因進行表達，他們猜測在一些關鍵信號通路上可能還存在尚未發現的靶基因，同樣對 miRNA-141 調控成骨分化產生影響。
4 促進成骨分化的 miRNAs
有研究認為通過阻止血清中 Dickkopf-1（DKK1）的表達可以延緩系統性骨丟失的發生，并且 DKK1 的水平與絕經后骨質疏松癥以及類風濕性關節炎有密切關系[33]。Tang 等[34]構建了卵巢切除小鼠模型來模擬絕經后骨質疏松癥情況，他們發現存在于小鼠血清中的循環 miRNA-433-3p，可以減少 Wnt 信號通路的拮抗物 DKK1 的表達，從而促進成骨細胞形成。這提示循環 miRNAs 與調節 Wnt 信號通路的因子 DKK1 之間存在一種新的反饋調節機制。Fan 等[35]發現，miRNA-450b 是人脂肪來源干細胞（human adipose tissue-derived stromal cells，hADSCs）成骨分化正性調節因子，其靶基因是 BMP-3。miRNA-450b 不僅在體外實驗中可以促進 hADSCs 成骨分化，在非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠模型中也能增強異位骨的形成。同樣，Cai 等[36]也發現 miRNA-224 有促進 MSCs 成骨分化的作用，進一步研究找到其靶基因 Rac1，miRNA-224 抑制 Rac1 表達，反向激活 JAK/STAT3 和 Wnt/β-catenin 信號通路，從而增強 MSCs 成骨分化。
Wang 等[37]研究了 miRNA-33-5p 對成骨分化的調節作用，作者使用一種靶向投遞系統將 miRNA-33-5p 送入小鼠后肢卸載（HU）模型中，以檢驗抗骨質減少的效果。結果表明 miRNA-33-5p 在體外實驗中能明顯促進小鼠 MC3T3-E1 細胞成骨分化，在投入 HU 模型后能部分恢復機械卸載所導致的骨質減少。因此，作者認為靶向投遞 miRNA-33-5p 的模擬物，可以成為一種治療病理性骨質減少的新策略。Kuang 等[38]在評價循環泛素特異肽酶 45（circulating ubiquitin specific peptidase 45，circUSP45）在糖皮質激素誘導的股骨頭壞死（glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head，GIONFH）中的功能時，發現了 1 條 circUSP45/miRNA-127-5p/PTEN 調控軸。PTEN 是 Akt 信號通路重要的抑制因子，miRNA-127-5p 通過抑制 PTEN 表達而間接增加 Akt 的表達，即 miRNA-127-5p 能間接促進人 BMSCs 成骨分化。Kuang 等構建了 GIONFH 小鼠模型來評價 circUSP45 的作用，證實 circUSP45 是 miRNA-127-5p 的海綿，會抑制 miRNA-127-5p 的表達。總之，circUSP45 通過抑制 miRNA-127-5p 表達，增加 PTEN 的表達，阻礙 Akt 信號通路，最終抑制 BMSCs 的成骨分化。
Hu 等[39]研究了 miRNA-26b 在人 BMSCs 分化中的作用，他們發現 miRNA-26b 通過抑制糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）表達激活 Wnt/β-catenin 信號通路。GSK3β 是 Wnt/β-catenin 信號通路關鍵調控因子，當 miRNA-26b 過表達時，GSK3β 表達下調，導致 β-catenin 通路激活，最后促進了人 BMSCs 的成骨分化。由于地塞米松能促進 GSK3β 的表達，抑制 Wnt 信號通路，所以作者認為 miRNA-26b 可以用來緩解地塞米松所帶來的成骨分化抑制作用。Han 等[40]用 miRNAs 序列分析技術檢測胸椎黃韌帶骨化癥與 miRNAs 的關系時發現，miRNA-342-3p 是 MSCs 成骨分化的正性調節因子，它的靶基因是活化轉錄因子 3（activating transcription factor 3，ATF3）。miRNA-342-3p 能夠抑制 ATF3 表達，降低 ATF3 所導致的成骨分化抑制作用。此外，作者還發現在未分化細胞的 Enah/Vasp 樣蛋白（recombinant Enah/Vasp like protein，EVL）區域存在高頻率的甲基化。當 EVL CpG 島去甲基化時能夠誘導 miRNA-342-3p 的過表達。因此 CpG 島的甲基化水平及 EVL/miRNA-342-3p 可以用來預測胸椎黃韌帶骨化癥的風險。
綜上，在 MSCs 成骨分化過程中存在著許多起調節作用的 miRNAs 和信號通路，這些 miRNAs 和信號通路構成了一個復雜的分子網絡，闡明這個網絡中各分子之間的關系對骨科疾病的診治有重要意義。
5 miRNAs 與骨科疾病
隨著 miRNAs 調控成骨分化的研究不斷深入，探索 miRNAs 對骨科疾病的診斷與治療價值正在成為一個新的熱點。當前 miRNAs 對一些疾病的治療已進入臨床研究階段，如 miRNA-34 治療肺癌[41]、miRNA-122 治療丙型肝炎[42]、miRNA-103/107 治療 2 型糖尿病[43]等。Ottosen 等[44]研制出一種被稱作 Miravirsen 的 miRNA-122 靶向藥物，在已開展的臨床 2 期試驗中證明對丙型肝炎有很好的治療效果。miRNAs 和骨科疾病關系的研究目前仍處于實驗探索階段。因為循環 miRNAs 存在于血流和體液中，具有高度穩定性，在嚴酷條件下如煮沸、冷凍/解凍、酸性或堿性 pH 環境下均不會被破壞[45]，而且它們在個體中的表達也比較恒定。所以循環 miRNAs 可成為研究骨科疾病不同病理狀態下理想而靈敏的生物標記物。
6 miRNAs 與骨質疏松癥
目前已積累了少量 miRNAs 與骨質疏松癥關聯性的證據。骨質疏松癥是一種多因素疾病，和骨微觀結構惡化導致高骨折風險、骨強度減弱導致骨密度（bone mineral density，BMD）降低有關，是骨形成和骨吸收失衡的結果，多見于高齡女性[46]。miRNAs 在骨質疏松癥中作用的研究仍十分局限，多數研究樣本量偏小，結論可信度不高。由于能獲取的研究資料來自于不同樣本（如取自不同的細胞系），和不同的研究條件（如骨質疏松癥患者是否有低 BMD 或者骨折、是否伴有類風濕性關節炎），以及在篩選和檢驗 miRNAs 過程中使用了不同的技術手段等，都造成各個研究結果之間難以進行比較[47-49]。雖然有上述困難，miRNAs 及其靶基因依然是骨質疏松癥治療的潛在靶點。
最早進行 miRNAs 與骨質疏松癥關系研究時選取的對象是破骨細胞的前體——循環單核細胞。Wang 等[50]尋找外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中是否有合適的 miRNAs 可以作為絕經后骨質疏松癥的生物標記物。他們選取了 20 例 BMD 異常的絕經后女性作為研究對象并分成兩組，一組 BMD 偏高（Z 評分>0.84），另一組 BMD 偏低（Z 評分<?0.84）。經過 miRNA 序列分析和實時熒光定量 PCR 檢測，作者發現 miRNA-133a 在低 BMD 組中表達明顯上調，并經靶基因預測后找到了 miRNA-133a 的 3 個靶基因，分別是 CXCL11、CXCR3 和 SLC39A1；Pearson 相關性分析示，所有靶基因均和 miRNA-133a 成負相關。因此作者認為 miRNA-133a 是絕經后骨質疏松癥 PBMCs 理想的生物標記物。Seeliger 等[51]進行了人血清和骨組織樣本中 miRNAs 和骨質疏松性骨折的相關性分析。作者首先選擇 20 例髖部骨折女性作為研究對象，其中包括 10 例骨質疏松癥患者，在血清中篩選出了 83 種 miRNAs。接著，作者進一步增加樣本數，選擇 60 例患者的血清（其中骨質疏松癥患者 30 例）和另外 40 例患者的骨樣本（包括骨質疏松癥患者 20 例）進一步驗證 miRNAs。再次篩選后在血清和骨樣本中找到了 10 種可用于骨質疏松癥診斷和治療的 miRNAs，分為 3 類，分別是血清和骨樣本中均存在的 5 種 miRNAs（miRNA-21、miRNA-23a、miRNA-24、miRNA-100、miRNA-125b），只存在于血清中的 4 種 miRNAs（miRNA-93、miRNA-122a、miRNA-124a 和 miRNA-148a），以及只存在于骨樣本中的 miRNA-25。此外，作者認為人血清 miRNAs 作為實驗樣本有明顯優勢，避免了動物樣本造成的種屬差異，抽血檢驗能消除傳統使用 X 線測量 BMD 診斷骨質疏松癥引起的放射暴露，同時采血診斷價格便宜、取材方便并便于臨床管理。Weilner 等[52]同樣研究了 miRNAs 在骨質疏松性骨折中的診斷作用，他們關注的是新近發生的骨質疏松性股骨頸骨折。作者對 7 例患者血清樣本中 175 種 miRNAs 進行篩查，發現其中 6 種 miRNAs 的表達與新近骨折明顯相關，分別是 miRNA-133b、miRNA-22-3p、miRNA-10a-5p、miRNA-10b-5p、let-7g-5p 和 miRNA-328-3p；在隨后的體外 MSCs 成骨分化實驗中，作者進一步驗證了其中 3 種 miRNAs（miRNA-22-3p、let-7g-5p 和 miRNA-328-3p）的相關性。
miRNAs 與骨質疏松癥的相關性研究，目前多集中于絕經后女性的繼發性骨質疏松癥，較少關注原發性骨質疏松癥和女性絕經前骨質疏松癥。Kocijan 等[53]設計了一組不同類型骨質疏松癥的臨床對照研究，試驗組挑選 36 例原發性骨質疏松癥伴低創傷性骨折患者，包括 16 例<50 歲的男性、10 例絕經前女性和 10 例絕經后女性；對照組包括 39 例無低創傷性骨折且年齡匹配的健康捐獻者，其中 16 例男性、12 例絕經前女性和 11 例絕經后女性。各組血清和血漿樣本經實時熒光定量 PCR 等篩選出 8 種循環 miRNAs，分別是 miRNA-152-3p、miRNA-30e-5p、miRNA-140-5p、miRNA-324-3p、miRNA-19b-3p、miRNA-335-5p、miRNA-19a-3p 和 miRNA-550a-3，其中 miRNA-324-3p、miRNA-19a-3p 和 miRNA-19b-3p 首次被證明和成骨分化相關。該研究另外一個重要意義在于首次論證了相關 miRNAs 能用于原發性骨質疏松癥和女性絕經前骨質疏松癥的診斷和骨折風險預測。最近，Mandourah 等[54]也關注了 miRNAs 與骨質疏松癥的關系，他們將 139 例研究對象分成 5 組，分別是：A 組，12 例健康捐獻者（男 1 例，女 11 例）；B 組，61 例不伴骨折的骨膜病患者（男 9 例，女 52 例）；C 組，15 例伴骨折的骨膜病患者（男 2 例，女 13 例）；D 組，33 例不伴骨折的骨質疏松癥患者（男 6 例，女 27 例）；E 組，18 例骨質疏松性骨折患者（男 2 例，女 16 例）。他們收集到 139 例血清樣本和 134 例血漿樣本，并進行 miRNAs 分析，發現 miRNA-122-5p 和 miRNA-4516 的表達在不同樣本間差異最明顯；隨后進一步證明了這兩種 miRNAs 與易碎性骨折以及骨質疏松癥患者的低 BMD 有明顯關聯。診斷試驗與 ROC 曲線分析結果表明，miRNA-122 單獨用于診斷的作用有限，miRNA-4516 可以單獨用于診斷，但同時檢測兩種 miRNAs 診斷最有價值（P=0.004）。因此作者推薦同時檢測 miRNA-122-5p 和 miRNA-4516 作為診斷骨質疏松癥的依據。
7 miRNAs 與其他骨科疾病
miRNAs 在其他骨科疾病中作用的研究更加有限。研究結果顯示 miRNAs 的失調與 OA、類風濕性關節炎和骨壞死等疾病的病理機制有關。Yamasaki 等[55]對 miRNA-146a 在 OA 患者中的表達情況進行了研究，研究對象包括 15 例 OA 術后患者（全髖關節成形術后 9 例、全膝關節成形術后 6 例），作者通過 RT-PCR 和原位雜交技術分析了患者關節軟骨樣本和經 IL-1 誘導后的軟骨樣本中 miRNA-146a 表達，并依據 Mankin 評分將軟骨樣本分成Ⅰ度（0～5 分）、Ⅱ度（6～10 分）和Ⅲ度（11～14 分），分別代表輕度 OA、中度 OA 和重度 OA。RT-PCR 結果顯示Ⅰ度中 miRNA-146a 和 COL2A1 的表達明顯增加，但Ⅱ度和Ⅲ度中 miRNA-146a 和 COL2A1 的表達則降低，只有 MMP-13 在Ⅱ度中表達增加。原位雜交結果表明 miRNA-146a 在軟骨組織各層均有表達，特別在軟骨表層表達最強。此外，經體外 IL-1 誘導后 miRNA-146a 表達會明顯增加。上述結果可部分解釋 OA 的病理機制，即 miRNA-146a 經 IL-1 誘導下在Ⅰ度 OA 軟骨中表達明顯。Kurowska-Stolarska 等[56]發現 miRNA-155 在類風濕性關節炎患者的滑膜及滑液單核巨噬細胞中表達明顯增加。miRNA-155 在滑液 CD14+ 細胞中表達增加與 SHIP-1 的表達減少相關。SHIP-1 是一種炎癥抑制因子，同時是 miRNA-155 的靶基因，miRNA-155 的過表達導致了 SHIP-1 的下調，同時加速了促炎性細胞因子的生成。作者構建 miRNA-155 缺陷小鼠模型進一步證明了 miRNA-155 對抗原特異性 T 細胞和抗原特異性抗體的分化起促進作用。上述研究說明，miRNA-155/SHIP-1 在類風濕性關節炎患者關節的過度炎癥反應中起著重要作用，miRNA-155 有望作為靶基因用于類風濕性關節炎的治療。
椎間盤退變與髓核惡化有關，研究顯示 lncRNAs 在椎間盤退變的發生機制中扮演著關鍵角色。Xi 等[57]研究調控椎間盤退變患者髓核細胞中 miRNAs 表達的 lncRNAs 時，發現了 1 條 HCG18/miRNA-146a-5p/TRAF6/kappa-B 調控軸。lncRNA- HCG18 作為 miRNA-146a-5 的海綿，在髓核細胞中通過直接結合 miRNA-146a-5 的方式抑制 miRNA-146a-5p 表達。HCG18 在椎間盤退變、椎間盤膨出或椎間盤突出患者中表達明顯上調，其表達水平與椎間盤退變等級成正相關。在體外研究中，miRNA-146a-5p 促進 HCG18 表達，抑制髓核細胞生長，誘導細胞凋亡。TRAF6 是 miRNA-146a-5p 的靶基因，由 HCG18 調控。作者認為 HCG18 是椎間盤退變的一種新型早期診斷標記物，同時具有潛在的治療價值。García-Giménez 等[58]設計了一組青少年先天性脊柱側彎的臨床對照研究，選取的研究對象包括 30 例先天性脊柱側彎患者和 13 例年齡一致的健康捐獻者。作者利用下一代 RNA 測序技術在患者血液樣本中篩選出 4 種異常的 miRNAs：miRNA-122a-5p、miRNA-27a-5p、miRNA-223-5p 和 miRNA-1306-3p。他們認為這些 miRNAs 通過操縱信號通路的表觀遺傳特征來調節骨代謝平衡，進而控制先天性脊柱側彎患者的遺傳背景。即失調的 4 種 miRNAs 可部分解釋先天性脊柱側彎發病機制，有望成為先天性脊柱側彎早期診斷和評價治療效果的工具，減少手術介入治療帶來的高風險。
Kao 等[59]通過分析 miRNAs 來預測股骨頭壞死的病理機制。作者利用生物信息學預測工具對 46 例股骨頭壞死患者和 85 例健康捐獻者的外周血 miRNAs 進行比較分析，識別出 51 種差異表達的 miRNAs，其中 34 種表達上調、17 種表達下調；接著作者選出其中 6 種 miRNAs（miRNA-18a、miRNA-19a、miRNA-138-1、miRNA-24-2、miRNA-1290、miRNA-3609）進行微滴數字 PCR 分析，發現表達上調的 miRNA-18a 和 miRNA-19a 與誘導缺血后的血管生成有關，表達下調的 miRNA-138-1 可抑制 MSCs 的成骨分化。作者猜測上述 miRNAs 的靶基因可能是 p53 和 SERBP1，它們與缺氧和低纖維蛋白溶解有關。Kao 等的研究解釋了部分股骨頭壞死的發病機制，即缺氧抑制了 MSCs 成骨作用，而失調的血管生成可能是通過多種 miRNAs 相互作用而造成的。Ou 等[60]為證明與骨硬化相關的 miRNAs 及其靶基因，對 6 例骨硬化患者及 9 例健康捐獻者的外周血 PBMCs 進行深度測序，生物信息學預測及實時熒光定量 PCR 等分析發現了 miRNA-320a 和靶基因 Arf1，它們的表達異常與 CLCN7 基因突變型骨硬化的發病有關。Paget 骨病是一種局灶性骨重建疾病，和破骨細胞活動增強有關[61]。Bianciardi 等[62]對 20 例 Paget 骨病患者和 20 例健康捐獻者外周血 PBMCs 中 miRNAs 的表達情況進行統計，找到了 22 種表達異常的 miRNAs，經進一步分析發現其中 8 種 miRNAs（miRNA-26a、miRNA-30c、miRNA-31、miRNA-124a、miRNA-146a、miRNA-148a、miRNA-182、miRNA-223）和骨代謝平衡有關。因為早期研究[51, 63-64]顯示，miRNA-146a、miRNA-148a 和 miRNA-223 與破骨活動相關，所以作者認為這 3 種 miRNAs 的異常可解釋 Paget 骨病發病機制。
雖然上述疾病病理機制的完全闡明還需要搜集更多的證據，但 miRNAs 參與多種骨代謝紊亂是明確的，或許 miRNAs 用于診斷的作用有限（如血清中的循環 miRNAs 是否具有特異性），但針對 miRNAs 的研究至少可以部分解釋疾病的病理機制。此外，目前的研究正面臨著一系列挑戰。如在進行臨床試驗研究之前，需要展更多的前期研究解決 miRNAs 人工類似物或 miRNAs 抗體在體內高效傳遞。單個 miRNA 可以調節多個目標基因，部分 miRNAs 給疾病治療帶來好處時，潛在的安全問題同樣值得關注，如 miRNA-29a 的表達會增加乳腺癌的侵襲力，因此不太可能被用于疾病治療[65]。
最后，miRNAs 針對骨腫瘤如骨肉瘤、骨巨細胞瘤、平滑肌瘤、脂肪肉瘤及骨轉移瘤等的診斷和治療已經很好地開展，這些方面的研究在其他文獻中已有深入總結[66-71]，限于篇幅此處不再敘述。
8 總結與展望
miRNAs 在 MSCs 成骨分化過程中扮演著重要角色[72]，miRNAs 的研究對于理解骨骼體內動態平衡調節提供了新的視角[73]，也為尋找骨病的治療靶點提供了理論依據。同時在研究過程中我們也需要注意一些問題，比如 miRNAs 的吸收對正常細胞是否無害；單條 miRNA 可作用于數百個靶基因，必須考慮附帶效應，未來可探索特定 miRNAs 在特定地點和特定階段用于骨病的診斷與治療。此外，不同的環境和條件如生活方式、體育活動、飲食與晝夜節律等，對 miRNAs 表達是否有影響也值得探討。
作者貢獻：李曉龍負責綜述構思及設計、觀點形成、資料收集及文章撰寫；孔清泉負責綜述構思及設計。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。
創傷、骨質疏松癥、骨關節炎（osteoarthritis，OA）和骨腫瘤等疾病會導致骨量減少、骨缺損、骨折不愈合以及股骨頭壞死等，帶來巨大的社會和經濟負擔，并且嚴重影響患者的生活質量。骨組織有很強的再生能力，通過成骨細胞和破骨細胞的協同作用形成新的骨組織，來維持人體正常骨代謝的動態平衡。成骨作用開始于 MSCs 分化為成熟的成骨細胞，因此骨質疏松癥和 OA 等疾病的防治可以考慮加強 MSCs 的成骨作用和促進新骨形成[1]。近年來，諸多研究發現一些關鍵的信號通路參與成骨分化的調控，如 TGF-β/BMP-Smads、Wnt/β-catenin、Notch、猬因子（Hedgehog，Hh）、FGF、絲裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等[2]。除上述信號通路外，激素、生長因子、趨化因子、細胞因子、DNA 甲基化、微小 RNA（microRNA，miRNA）和染色質結構改變等也參與調控成骨分化[3-5]。目前實驗證據表明，miRNAs 在 MSCs 成骨分化調控中發揮著關鍵作用，但是具體作用機制和細節尚未完全闡明。本綜述就 miRNAs 對成骨分化調控作用的研究現狀及在骨科疾病中作為治療靶點和診斷工具的應用研究進展進行總結。
1 miRNAs 的定義與功能
miRNAs 廣泛存在于真核生物中，是一種內源性非編碼長度為 20～22 個核苷酸的小 RNAs，具有高度保守性、時序性和組織特異性[6]。miRNAs 通過對 mRNAs 切割、降解，翻譯抑制或甲基化靶基因，轉錄后對約 60% 的編碼基因表達進行調控，因此在諸多疾病中發揮著潛在的重要作用[7]。miRNAs只占人類基因組中的 1%～5%，但 1 條 miRNA 通常可以調控數十甚至數百個基因[8]。最早發現的 miRNA 是 lin-4，Lee 等[9]在 1993 年研究線蟲時發現基因 lin-4 能夠抑制基因 lin-14，認為基因 lin-4 是通過表達一種調控蛋白來發揮作用。后來研究發現這個基因的產物是單鏈 RNA[10]。miRNAs 已成為近年研究熱點，截止 2018 年 10 月，miRBase 數據庫已收錄 271 個物種的 38 589 條 miRNAs。
miRNAs 的加工成熟過程與 mRNAs 類似，需要經歷核酸酶的剪切加工及堿基互補配對等一系列復雜過程，根據堿基互補配對原則，在結合 3’UTR 時如果堿基不完全匹配，則抑制靶基因蛋白翻譯；若完全匹配，靶基因 mRNAs 降解[11]。靶基因預測工具如 PicTar 等軟件和熒光素酶報告質粒系統，原理均是設計出 3’UTR 端堿基序列來實現互補配對[12]。此外，miRNAs 與靶基因 mRNAs 不是完全一一對應的，每條 miRNA 都含有多個 mRNAs 靶點，多條 miRNAs 也可以作用于同一條 mRNA。
miRNAs 在細胞生長、發育、分化、凋亡等生物過程中起著重要作用，同時也廣泛參與血細胞生成、胰島素分泌、神經系統發育和人類癌細胞生長等過程[13]。例如 miRNA-140，研究顯示其在 MSCs 成骨分化中表達增高，而抑制成骨分化時表達明顯降低，提示 miRNA-140 可能參與 MSCs 成骨分化的調控作用[14]。
2 miRNAs 在成骨分化中的調控作用
Kobayashi 等[15]首先證實敲除小鼠體內由Ⅱ型 α1 膠原基因（collagen type Ⅱ alpha 1，COL2A1）介導的 RNAse Ⅲ核酸內切酶 Dicer，會導致嚴重的骨生成障礙和小鼠死亡。Gaur 等[16]隨后進一步驗證了位于成骨細胞中的 Dicer 是通過沉默重組酶起作用，而這些重組酶是由小鼠Ⅰ型 α1 膠原基因或者人類骨羧谷氨酸蛋白/骨鈣蛋白基因啟動并表達的。成骨細胞中的 Dicer 敲除或沉默后，細胞內 miRNAs 生成會發生障礙，最后導致小鼠肢體發育障礙，說明 miRNAs 的表達在 MSCs 成骨分化中起著非常關鍵的作用。多數經過驗證的 miRNAs 是通過直接關聯組織特異性分化的中心調控基因起作用，因此從 miRNAs 角度尋找調控 MSCs 成骨分化的關鍵基因可行。目前大量實驗證據證實 miRNAs 不只作用于 1 個基因，而是同時作用于多個基因，它具有雙向性，即抑制一部分基因表達，同時促進另外一部分基因表達，兩者最終的結果是疊加的，而不是相互拮抗的[17-19]。這一機制可能是體內互轉化的關鍵因素，即抑制向一種細胞表型分化，促進向另一種細胞表型轉化。即 miRNAs 對 MSCs 的成骨作用是正反兩面的，一方面通過作用于促進成骨的靶基因表達而直接抑制成骨作用；另一方面是作用于抑制成骨作用的靶基因，間接對 MSCs 成骨作用進行正向調節[20]。
3 抑制成骨分化的 miRNAs
Wei 等[18]發現在人牙周韌帶干細胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）成骨分化過程中，miRNA-21 表達下降。作者通過構建 miRNA-21 表達載體 pGC-LV-pre-miRNA-21-GFP 刺激 miRNA-21 過表達，hPDLSCs 的成骨分化受抑制；相反，構建抗 miRNA-21 表達載體 pGC-LV-anti-miRNA-21-GFP 抑制 miRNA-21 表達，則會促進 hPDLSCs 的成骨分化。進一步研究發現，miRNA-21 是通過抑制對細胞增殖有調節作用的 Smad5 基因發揮作用的。BMP-9 被確認是 BMP 家族中誘導成骨分化的重要成員，但具體誘導機制一直不明確[21]。近年，Liu 等[22]發現 miRNA-155 能夠顯著下調 BMP-9 誘導的 MSCs 成骨分化，通過抑制 BMP 信號通路上的靶基因 Runt 相關轉錄因子 2（runt-related transcription factor 2，Runx2）和 BMP 受體 2 來發揮作用。隨后，Lin 等[23]發現 BMP-2 可誘導小鼠 MC3T3-E1 細胞成骨分化，miRNA-92a-1-5p 表達明顯下調，miRNA-92a-1-5p 對成骨分化起抑制作用，是通過負性調控 β-catenin 基因來實現。Saiganesh 等[24]發現轉錄因子 TGF-β1 能減弱 miRNA-203a-5p 在 MSCs 成骨分化過程中的表達，同時 miRNA-203a-5p 對基質金屬蛋白酶 13（matrix metalloproteinases 13，MMP-13）基因有抑制作用，MMP-13 過表達會促進成骨分化，這樣就建立了一種 TGF-β1 抑制 miRNA-203a-5p，使 MMP-13 的抑制得到釋放的前反饋調節機制。
miRNA-16-2-3p 是新近發現的一種 miRNA，研究證明其可作為標記物用于診斷肝癌、宮頸癌和慢性淋巴細胞白血病和評估預后[25]。最近，Duan 等[26]研究了 miRNA-16-2-3p 調節成骨分化的具體機制，作者發現 46 例骨質疏松癥患者骨組織樣本中的 miRNA-16-2-3p，其表達與骨形成相關基因 Runx2、成骨相關轉錄因子（osterix，Osx）和 ALP 的表達成負相關。當上調 miRNA-16-2-3p 時，人 BMSCs 成骨分化過程受阻，miRNA-16-2-3p 直接作用靶基因 Wnt5A 限制 Wnt 信號通路；如果下調 miRNA-16-2-3p，成骨分化明顯增加，進一步剔除 miRNA-16-2-3p 后會激活 Runx2 基因，作者推測這可能和 Wnt 信號通路的限制被解除有關。Duan 等認為 miRNA-16-2-3p 是通過阻礙 Wnt5A 介導的 Wnt 信號通路，來抑制人 BMSCs 成骨分化作用的。miRNA-16-2-3p 可望成為一種新型治療靶點，通過抑制 miRNA-16-2-3p，從而促進 MSCs 分化為成骨細胞，并最終重建骨組織。同樣，Wang 等[27]研究了 miRNA-193a 對人 BMSCs 成骨分化的影響，他們發現 miRNA-193a 通過直接作用于靶基因 HMGB1 的 3’UTR 端，反向激活與成骨分化相關聯的 MAPK 和 Wnt/β-catenin 信號通路，從而顯著抑制 MSCs 的成骨分化。
長鏈非編碼 RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）同 miRNAs 一樣，也是參與生長發育、細胞分化和分子轉錄過程的重要調控因子。位于其中的抗分化非編碼 RNA（anti-differentiation non-coding RNA，ANCR），是近年來發現的可負調控 MSCs 分化的 RNA[28]。lncRNAs 與 miRNAs 之間的關系可以概括為以下 4 種：lncRNAs 生成 miRNAs；lncRNAs 與 miRNAs 競爭 mRNAs 靶點；lncRNAs 作為 miRNAs 的海綿，長效抑制 miRNAs；miRNAs 結合 lncRNAs 后降低其穩定性[29]。Peng 等[30]在研究 lncRNA-ANCR 時發現，lncRNA-ANCR 能抑制 hPDLSCs 的成骨分化，過表達 lncRNA-ANCR 時 miRNA-758 的表達會下降；反之，如果抑制 lncRNA-ANCR，miRNA-758 的表達會增加。因此作者認為，lncRNA-ANCR 與 miRNAs 之間的關系是 lncRNA-ANCR 是抑制 miRNAs 的海綿。作者通過進一步靶點預測和驗證，發現 miRNA-758 能直接結合 Notch2 的 3’UTR 端第 3222～3228 組堿基，而對 Notch2 起抑制作用。Notch2 是 Wnt/β-catenin 信號通路的關鍵分子，miRNA-758 通過直接抑制 Notch2 而阻礙 Wnt/β-catenin 信號通路。即 lncRNA-ANCR 是通過 lncRNA-ANCR/miRNA-758/Notch2 軸調控 hPDLSCs 成骨分化的。
目前發現 Hh 信號通路和 OA 的發生密切相關。Woods 等[31]研究了 miRNAs 在 OA 中的作用機制，研究對象分別選用人 MSCs 和小鼠 C3H10T1/2 細胞系，結果發現人和小鼠 miRNA-324-5p 均能通過 Hh 信號通路對 MSCs 成骨分化負調控；但重要的是，兩者的作用靶基因并不相同，人類 miRNA-324-5p 的靶基因是 Smo 和 Gli1，小鼠 miRNA-324-5p 的靶基因是 Gpc1。作者強調在人類疾病的研究中，選擇人類細胞作為研究對象非常重要，尤其是涉及 miRNAs 與 Hh 信號通路的研究。一種 miRNAs 可以同時作用多個靶基因，比如 miRNA-141。Fariyike 等[32]在研究 miRNA-141 對老化骨骼肌肉系統中的 MSCs 如何起作用時，找到了多個 miRNA-141 的靶基因，包括 SVCT2、SDF1、ZMPSTE24、CDC25 A、Dlx5、BMI1、TGFb1、ICAM-1、PTEN 和 PAPP-A。由于 miRNAs 能結合多個靶基因進行表達，他們猜測在一些關鍵信號通路上可能還存在尚未發現的靶基因，同樣對 miRNA-141 調控成骨分化產生影響。
4 促進成骨分化的 miRNAs
有研究認為通過阻止血清中 Dickkopf-1（DKK1）的表達可以延緩系統性骨丟失的發生，并且 DKK1 的水平與絕經后骨質疏松癥以及類風濕性關節炎有密切關系[33]。Tang 等[34]構建了卵巢切除小鼠模型來模擬絕經后骨質疏松癥情況，他們發現存在于小鼠血清中的循環 miRNA-433-3p，可以減少 Wnt 信號通路的拮抗物 DKK1 的表達，從而促進成骨細胞形成。這提示循環 miRNAs 與調節 Wnt 信號通路的因子 DKK1 之間存在一種新的反饋調節機制。Fan 等[35]發現，miRNA-450b 是人脂肪來源干細胞（human adipose tissue-derived stromal cells，hADSCs）成骨分化正性調節因子，其靶基因是 BMP-3。miRNA-450b 不僅在體外實驗中可以促進 hADSCs 成骨分化，在非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠模型中也能增強異位骨的形成。同樣，Cai 等[36]也發現 miRNA-224 有促進 MSCs 成骨分化的作用，進一步研究找到其靶基因 Rac1，miRNA-224 抑制 Rac1 表達，反向激活 JAK/STAT3 和 Wnt/β-catenin 信號通路，從而增強 MSCs 成骨分化。
Wang 等[37]研究了 miRNA-33-5p 對成骨分化的調節作用，作者使用一種靶向投遞系統將 miRNA-33-5p 送入小鼠后肢卸載（HU）模型中，以檢驗抗骨質減少的效果。結果表明 miRNA-33-5p 在體外實驗中能明顯促進小鼠 MC3T3-E1 細胞成骨分化，在投入 HU 模型后能部分恢復機械卸載所導致的骨質減少。因此，作者認為靶向投遞 miRNA-33-5p 的模擬物，可以成為一種治療病理性骨質減少的新策略。Kuang 等[38]在評價循環泛素特異肽酶 45（circulating ubiquitin specific peptidase 45，circUSP45）在糖皮質激素誘導的股骨頭壞死（glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head，GIONFH）中的功能時，發現了 1 條 circUSP45/miRNA-127-5p/PTEN 調控軸。PTEN 是 Akt 信號通路重要的抑制因子，miRNA-127-5p 通過抑制 PTEN 表達而間接增加 Akt 的表達，即 miRNA-127-5p 能間接促進人 BMSCs 成骨分化。Kuang 等構建了 GIONFH 小鼠模型來評價 circUSP45 的作用，證實 circUSP45 是 miRNA-127-5p 的海綿，會抑制 miRNA-127-5p 的表達。總之，circUSP45 通過抑制 miRNA-127-5p 表達，增加 PTEN 的表達，阻礙 Akt 信號通路，最終抑制 BMSCs 的成骨分化。
Hu 等[39]研究了 miRNA-26b 在人 BMSCs 分化中的作用，他們發現 miRNA-26b 通過抑制糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）表達激活 Wnt/β-catenin 信號通路。GSK3β 是 Wnt/β-catenin 信號通路關鍵調控因子，當 miRNA-26b 過表達時，GSK3β 表達下調，導致 β-catenin 通路激活，最后促進了人 BMSCs 的成骨分化。由于地塞米松能促進 GSK3β 的表達，抑制 Wnt 信號通路，所以作者認為 miRNA-26b 可以用來緩解地塞米松所帶來的成骨分化抑制作用。Han 等[40]用 miRNAs 序列分析技術檢測胸椎黃韌帶骨化癥與 miRNAs 的關系時發現，miRNA-342-3p 是 MSCs 成骨分化的正性調節因子，它的靶基因是活化轉錄因子 3（activating transcription factor 3，ATF3）。miRNA-342-3p 能夠抑制 ATF3 表達，降低 ATF3 所導致的成骨分化抑制作用。此外，作者還發現在未分化細胞的 Enah/Vasp 樣蛋白（recombinant Enah/Vasp like protein，EVL）區域存在高頻率的甲基化。當 EVL CpG 島去甲基化時能夠誘導 miRNA-342-3p 的過表達。因此 CpG 島的甲基化水平及 EVL/miRNA-342-3p 可以用來預測胸椎黃韌帶骨化癥的風險。
綜上，在 MSCs 成骨分化過程中存在著許多起調節作用的 miRNAs 和信號通路，這些 miRNAs 和信號通路構成了一個復雜的分子網絡，闡明這個網絡中各分子之間的關系對骨科疾病的診治有重要意義。
5 miRNAs 與骨科疾病
隨著 miRNAs 調控成骨分化的研究不斷深入，探索 miRNAs 對骨科疾病的診斷與治療價值正在成為一個新的熱點。當前 miRNAs 對一些疾病的治療已進入臨床研究階段，如 miRNA-34 治療肺癌[41]、miRNA-122 治療丙型肝炎[42]、miRNA-103/107 治療 2 型糖尿病[43]等。Ottosen 等[44]研制出一種被稱作 Miravirsen 的 miRNA-122 靶向藥物，在已開展的臨床 2 期試驗中證明對丙型肝炎有很好的治療效果。miRNAs 和骨科疾病關系的研究目前仍處于實驗探索階段。因為循環 miRNAs 存在于血流和體液中，具有高度穩定性，在嚴酷條件下如煮沸、冷凍/解凍、酸性或堿性 pH 環境下均不會被破壞[45]，而且它們在個體中的表達也比較恒定。所以循環 miRNAs 可成為研究骨科疾病不同病理狀態下理想而靈敏的生物標記物。
6 miRNAs 與骨質疏松癥
目前已積累了少量 miRNAs 與骨質疏松癥關聯性的證據。骨質疏松癥是一種多因素疾病，和骨微觀結構惡化導致高骨折風險、骨強度減弱導致骨密度（bone mineral density，BMD）降低有關，是骨形成和骨吸收失衡的結果，多見于高齡女性[46]。miRNAs 在骨質疏松癥中作用的研究仍十分局限，多數研究樣本量偏小，結論可信度不高。由于能獲取的研究資料來自于不同樣本（如取自不同的細胞系），和不同的研究條件（如骨質疏松癥患者是否有低 BMD 或者骨折、是否伴有類風濕性關節炎），以及在篩選和檢驗 miRNAs 過程中使用了不同的技術手段等，都造成各個研究結果之間難以進行比較[47-49]。雖然有上述困難，miRNAs 及其靶基因依然是骨質疏松癥治療的潛在靶點。
最早進行 miRNAs 與骨質疏松癥關系研究時選取的對象是破骨細胞的前體——循環單核細胞。Wang 等[50]尋找外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中是否有合適的 miRNAs 可以作為絕經后骨質疏松癥的生物標記物。他們選取了 20 例 BMD 異常的絕經后女性作為研究對象并分成兩組，一組 BMD 偏高（Z 評分>0.84），另一組 BMD 偏低（Z 評分<?0.84）。經過 miRNA 序列分析和實時熒光定量 PCR 檢測，作者發現 miRNA-133a 在低 BMD 組中表達明顯上調，并經靶基因預測后找到了 miRNA-133a 的 3 個靶基因，分別是 CXCL11、CXCR3 和 SLC39A1；Pearson 相關性分析示，所有靶基因均和 miRNA-133a 成負相關。因此作者認為 miRNA-133a 是絕經后骨質疏松癥 PBMCs 理想的生物標記物。Seeliger 等[51]進行了人血清和骨組織樣本中 miRNAs 和骨質疏松性骨折的相關性分析。作者首先選擇 20 例髖部骨折女性作為研究對象，其中包括 10 例骨質疏松癥患者，在血清中篩選出了 83 種 miRNAs。接著，作者進一步增加樣本數，選擇 60 例患者的血清（其中骨質疏松癥患者 30 例）和另外 40 例患者的骨樣本（包括骨質疏松癥患者 20 例）進一步驗證 miRNAs。再次篩選后在血清和骨樣本中找到了 10 種可用于骨質疏松癥診斷和治療的 miRNAs，分為 3 類，分別是血清和骨樣本中均存在的 5 種 miRNAs（miRNA-21、miRNA-23a、miRNA-24、miRNA-100、miRNA-125b），只存在于血清中的 4 種 miRNAs（miRNA-93、miRNA-122a、miRNA-124a 和 miRNA-148a），以及只存在于骨樣本中的 miRNA-25。此外，作者認為人血清 miRNAs 作為實驗樣本有明顯優勢，避免了動物樣本造成的種屬差異，抽血檢驗能消除傳統使用 X 線測量 BMD 診斷骨質疏松癥引起的放射暴露，同時采血診斷價格便宜、取材方便并便于臨床管理。Weilner 等[52]同樣研究了 miRNAs 在骨質疏松性骨折中的診斷作用，他們關注的是新近發生的骨質疏松性股骨頸骨折。作者對 7 例患者血清樣本中 175 種 miRNAs 進行篩查，發現其中 6 種 miRNAs 的表達與新近骨折明顯相關，分別是 miRNA-133b、miRNA-22-3p、miRNA-10a-5p、miRNA-10b-5p、let-7g-5p 和 miRNA-328-3p；在隨后的體外 MSCs 成骨分化實驗中，作者進一步驗證了其中 3 種 miRNAs（miRNA-22-3p、let-7g-5p 和 miRNA-328-3p）的相關性。
miRNAs 與骨質疏松癥的相關性研究，目前多集中于絕經后女性的繼發性骨質疏松癥，較少關注原發性骨質疏松癥和女性絕經前骨質疏松癥。Kocijan 等[53]設計了一組不同類型骨質疏松癥的臨床對照研究，試驗組挑選 36 例原發性骨質疏松癥伴低創傷性骨折患者，包括 16 例<50 歲的男性、10 例絕經前女性和 10 例絕經后女性；對照組包括 39 例無低創傷性骨折且年齡匹配的健康捐獻者，其中 16 例男性、12 例絕經前女性和 11 例絕經后女性。各組血清和血漿樣本經實時熒光定量 PCR 等篩選出 8 種循環 miRNAs，分別是 miRNA-152-3p、miRNA-30e-5p、miRNA-140-5p、miRNA-324-3p、miRNA-19b-3p、miRNA-335-5p、miRNA-19a-3p 和 miRNA-550a-3，其中 miRNA-324-3p、miRNA-19a-3p 和 miRNA-19b-3p 首次被證明和成骨分化相關。該研究另外一個重要意義在于首次論證了相關 miRNAs 能用于原發性骨質疏松癥和女性絕經前骨質疏松癥的診斷和骨折風險預測。最近，Mandourah 等[54]也關注了 miRNAs 與骨質疏松癥的關系，他們將 139 例研究對象分成 5 組，分別是：A 組，12 例健康捐獻者（男 1 例，女 11 例）；B 組，61 例不伴骨折的骨膜病患者（男 9 例，女 52 例）；C 組，15 例伴骨折的骨膜病患者（男 2 例，女 13 例）；D 組，33 例不伴骨折的骨質疏松癥患者（男 6 例，女 27 例）；E 組，18 例骨質疏松性骨折患者（男 2 例，女 16 例）。他們收集到 139 例血清樣本和 134 例血漿樣本，并進行 miRNAs 分析，發現 miRNA-122-5p 和 miRNA-4516 的表達在不同樣本間差異最明顯；隨后進一步證明了這兩種 miRNAs 與易碎性骨折以及骨質疏松癥患者的低 BMD 有明顯關聯。診斷試驗與 ROC 曲線分析結果表明，miRNA-122 單獨用于診斷的作用有限，miRNA-4516 可以單獨用于診斷，但同時檢測兩種 miRNAs 診斷最有價值（P=0.004）。因此作者推薦同時檢測 miRNA-122-5p 和 miRNA-4516 作為診斷骨質疏松癥的依據。
7 miRNAs 與其他骨科疾病
miRNAs 在其他骨科疾病中作用的研究更加有限。研究結果顯示 miRNAs 的失調與 OA、類風濕性關節炎和骨壞死等疾病的病理機制有關。Yamasaki 等[55]對 miRNA-146a 在 OA 患者中的表達情況進行了研究，研究對象包括 15 例 OA 術后患者（全髖關節成形術后 9 例、全膝關節成形術后 6 例），作者通過 RT-PCR 和原位雜交技術分析了患者關節軟骨樣本和經 IL-1 誘導后的軟骨樣本中 miRNA-146a 表達，并依據 Mankin 評分將軟骨樣本分成Ⅰ度（0～5 分）、Ⅱ度（6～10 分）和Ⅲ度（11～14 分），分別代表輕度 OA、中度 OA 和重度 OA。RT-PCR 結果顯示Ⅰ度中 miRNA-146a 和 COL2A1 的表達明顯增加，但Ⅱ度和Ⅲ度中 miRNA-146a 和 COL2A1 的表達則降低，只有 MMP-13 在Ⅱ度中表達增加。原位雜交結果表明 miRNA-146a 在軟骨組織各層均有表達，特別在軟骨表層表達最強。此外，經體外 IL-1 誘導后 miRNA-146a 表達會明顯增加。上述結果可部分解釋 OA 的病理機制，即 miRNA-146a 經 IL-1 誘導下在Ⅰ度 OA 軟骨中表達明顯。Kurowska-Stolarska 等[56]發現 miRNA-155 在類風濕性關節炎患者的滑膜及滑液單核巨噬細胞中表達明顯增加。miRNA-155 在滑液 CD14+ 細胞中表達增加與 SHIP-1 的表達減少相關。SHIP-1 是一種炎癥抑制因子，同時是 miRNA-155 的靶基因，miRNA-155 的過表達導致了 SHIP-1 的下調，同時加速了促炎性細胞因子的生成。作者構建 miRNA-155 缺陷小鼠模型進一步證明了 miRNA-155 對抗原特異性 T 細胞和抗原特異性抗體的分化起促進作用。上述研究說明，miRNA-155/SHIP-1 在類風濕性關節炎患者關節的過度炎癥反應中起著重要作用，miRNA-155 有望作為靶基因用于類風濕性關節炎的治療。
椎間盤退變與髓核惡化有關，研究顯示 lncRNAs 在椎間盤退變的發生機制中扮演著關鍵角色。Xi 等[57]研究調控椎間盤退變患者髓核細胞中 miRNAs 表達的 lncRNAs 時，發現了 1 條 HCG18/miRNA-146a-5p/TRAF6/kappa-B 調控軸。lncRNA- HCG18 作為 miRNA-146a-5 的海綿，在髓核細胞中通過直接結合 miRNA-146a-5 的方式抑制 miRNA-146a-5p 表達。HCG18 在椎間盤退變、椎間盤膨出或椎間盤突出患者中表達明顯上調，其表達水平與椎間盤退變等級成正相關。在體外研究中，miRNA-146a-5p 促進 HCG18 表達，抑制髓核細胞生長，誘導細胞凋亡。TRAF6 是 miRNA-146a-5p 的靶基因，由 HCG18 調控。作者認為 HCG18 是椎間盤退變的一種新型早期診斷標記物，同時具有潛在的治療價值。García-Giménez 等[58]設計了一組青少年先天性脊柱側彎的臨床對照研究，選取的研究對象包括 30 例先天性脊柱側彎患者和 13 例年齡一致的健康捐獻者。作者利用下一代 RNA 測序技術在患者血液樣本中篩選出 4 種異常的 miRNAs：miRNA-122a-5p、miRNA-27a-5p、miRNA-223-5p 和 miRNA-1306-3p。他們認為這些 miRNAs 通過操縱信號通路的表觀遺傳特征來調節骨代謝平衡，進而控制先天性脊柱側彎患者的遺傳背景。即失調的 4 種 miRNAs 可部分解釋先天性脊柱側彎發病機制，有望成為先天性脊柱側彎早期診斷和評價治療效果的工具，減少手術介入治療帶來的高風險。
Kao 等[59]通過分析 miRNAs 來預測股骨頭壞死的病理機制。作者利用生物信息學預測工具對 46 例股骨頭壞死患者和 85 例健康捐獻者的外周血 miRNAs 進行比較分析，識別出 51 種差異表達的 miRNAs，其中 34 種表達上調、17 種表達下調；接著作者選出其中 6 種 miRNAs（miRNA-18a、miRNA-19a、miRNA-138-1、miRNA-24-2、miRNA-1290、miRNA-3609）進行微滴數字 PCR 分析，發現表達上調的 miRNA-18a 和 miRNA-19a 與誘導缺血后的血管生成有關，表達下調的 miRNA-138-1 可抑制 MSCs 的成骨分化。作者猜測上述 miRNAs 的靶基因可能是 p53 和 SERBP1，它們與缺氧和低纖維蛋白溶解有關。Kao 等的研究解釋了部分股骨頭壞死的發病機制，即缺氧抑制了 MSCs 成骨作用，而失調的血管生成可能是通過多種 miRNAs 相互作用而造成的。Ou 等[60]為證明與骨硬化相關的 miRNAs 及其靶基因，對 6 例骨硬化患者及 9 例健康捐獻者的外周血 PBMCs 進行深度測序，生物信息學預測及實時熒光定量 PCR 等分析發現了 miRNA-320a 和靶基因 Arf1，它們的表達異常與 CLCN7 基因突變型骨硬化的發病有關。Paget 骨病是一種局灶性骨重建疾病，和破骨細胞活動增強有關[61]。Bianciardi 等[62]對 20 例 Paget 骨病患者和 20 例健康捐獻者外周血 PBMCs 中 miRNAs 的表達情況進行統計，找到了 22 種表達異常的 miRNAs，經進一步分析發現其中 8 種 miRNAs（miRNA-26a、miRNA-30c、miRNA-31、miRNA-124a、miRNA-146a、miRNA-148a、miRNA-182、miRNA-223）和骨代謝平衡有關。因為早期研究[51, 63-64]顯示，miRNA-146a、miRNA-148a 和 miRNA-223 與破骨活動相關，所以作者認為這 3 種 miRNAs 的異常可解釋 Paget 骨病發病機制。
雖然上述疾病病理機制的完全闡明還需要搜集更多的證據，但 miRNAs 參與多種骨代謝紊亂是明確的，或許 miRNAs 用于診斷的作用有限（如血清中的循環 miRNAs 是否具有特異性），但針對 miRNAs 的研究至少可以部分解釋疾病的病理機制。此外，目前的研究正面臨著一系列挑戰。如在進行臨床試驗研究之前，需要展更多的前期研究解決 miRNAs 人工類似物或 miRNAs 抗體在體內高效傳遞。單個 miRNA 可以調節多個目標基因，部分 miRNAs 給疾病治療帶來好處時，潛在的安全問題同樣值得關注，如 miRNA-29a 的表達會增加乳腺癌的侵襲力，因此不太可能被用于疾病治療[65]。
最后，miRNAs 針對骨腫瘤如骨肉瘤、骨巨細胞瘤、平滑肌瘤、脂肪肉瘤及骨轉移瘤等的診斷和治療已經很好地開展，這些方面的研究在其他文獻中已有深入總結[66-71]，限于篇幅此處不再敘述。
8 總結與展望
miRNAs 在 MSCs 成骨分化過程中扮演著重要角色[72]，miRNAs 的研究對于理解骨骼體內動態平衡調節提供了新的視角[73]，也為尋找骨病的治療靶點提供了理論依據。同時在研究過程中我們也需要注意一些問題，比如 miRNAs 的吸收對正常細胞是否無害；單條 miRNA 可作用于數百個靶基因，必須考慮附帶效應，未來可探索特定 miRNAs 在特定地點和特定階段用于骨病的診斷與治療。此外，不同的環境和條件如生活方式、體育活動、飲食與晝夜節律等，對 miRNAs 表達是否有影響也值得探討。
作者貢獻：李曉龍負責綜述構思及設計、觀點形成、資料收集及文章撰寫；孔清泉負責綜述構思及設計。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。