引用本文： 劉翔宇, 王照東, 徐陳, 官建中, 魏幫國, 劉亞軍. 載外源性 TGF-β1 甲基丙烯酰化明膠復合支架促進顱骨缺損修復實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(7): 904-912. doi: 10.7507/1002-1892.202102008 復制
骨缺損在骨科疾病中較常見，常因先天因素、外傷、感染或手術原因造成原位骨質丟失[1]。骨缺損治療分為自體骨移植和同種異體骨移植，但均存在局限性[2]。
隨著組織工程研究進展，大量聚合物被用作介導骨組織再生的支架材料[3]。甲基丙烯酰化明膠（gelatin methacryloyl，GelMA）可通過光引發劑在紫外光照射下凝固成膠，是一種生物源性材料，具有優異的生物相容性和可降解性。GelMA 水凝膠因配制簡單、凝固時間短、硬度高、溶脹率低等優點，近年來被廣泛用于骨組織工程支架材料研究[4-5]。研究發現，將加載成骨分化潛能的細胞-支架復合物植入至骨缺損部位，具有成骨修復作用[6]。然而，組織工程細胞-支架復合物也存在植入祖細胞數量不夠明確、細胞存活率相對較低和免疫排斥風險較高等不足[7]。因此，建立能促進自身體內細胞向成骨細胞分化的藥物因子支架可能是另一種很有前景的策略。
TGF-β1 作為 TGF-β 家族成員，廣泛存在于人類血小板和哺乳動物骨中，具有調節細胞生長的功能。近年來，TGF-β1 促進 BMSCs 成骨分化的研究眾多[8]，但關于 TGF-β1 加載修飾 GelMA 水凝膠支架修復骨缺損的研究尚罕見報道。本研究擬通過將不同濃度 TGF-β1 加載入 GelMA 水凝膠制備骨組織工程支架，通過體外實驗驗證并篩選最適濃度的 TGF-β1/GelMA 水凝膠支架，然后將其植入 SD 大鼠顱骨缺損部位，檢測其對顱骨缺損再生的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2 周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠 4 只，體質量（80±10）g；8 周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠 36 只，體質量（250±10）g；購于濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司。
F12 基礎培養基、FBS（GIBCO 公司，美國）；TGF-β1（北京義翹神州生物技術有限公司）；GelMA 水凝膠（蘇州永沁泉智能設備有限公司）；成脂、成軟骨和成骨誘導分化培養基（Cyagen 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；北京蘭杰柯科技有限公司）；抗骨鈣素（osteocalcin，OCN）抗體、抗 ALP 抗體、抗 GAPDH 抗體（Abcam 公司，英國）。T 酶標儀（Thermo 公司，美國）；熒光倒置顯微鏡（Zeiss 公司，美國）；掃描電鏡（上海西努光學科技有限公司）；萬能材料試驗機（揚州德瑞儀器設備有限公司）。
1.2 水凝膠支架生物相容性觀測
1.2.1 實驗分組及方法
Lin 等[9]研究發現 10%GelMA 對 BMSCs 成骨分化效果最佳，因此本實驗選用 10%GelMA 水凝膠作為研究對象。取 10 mL PBS 加入至光引發劑中，65℃ 避光水浴 30 min，期間震蕩數次。取 1 g GelMA 水凝膠加入上述含光引發劑的溶液內，再次 65℃ 避光水浴 30 min，期間震蕩數次；隨后經 0.22 μm 過濾器過濾，所得溶液即為 10%GelMA 溶液。取 900 μL 10%GelMA 溶液，向其中加入 100 μL PBS 超聲 30 s 即為 GelMA 組（A 組）溶液。分別取 100 μL 濃度為 150、300、600、900、1 200 ng/mL 的外源性 TGF-β1 加入至 900 μL 10%GelMA 溶液內，超聲 30 s 使其混勻（分別設為 B、C、D、E、F 組）。取各組水凝膠溶液紫外光照射（83 mW/cm2、405 nm）交聯 30 s，即為實驗所需支架。
1.2.2 水凝膠支架表征
① 掃描電鏡觀察：分別取 2 mL A、F 組水凝膠溶液加入到 EP 管內，紫外光照射交聯形成支架后，–80°C 冷凍過夜，經冷凍干燥后用刀片切開水凝膠支架，掃描電鏡觀察其截斷面。② 楊氏模量檢測：首先用刀片將 1 mL 注射器頭部切去制成模具，然后分別取 100 μL A、F 組水凝膠溶液注入模具內，紫外光照射交聯后緩慢推出，用刀片切成直徑 6 mm、高 5 mm 的圓柱體支架，將支架置于萬能材料試驗機下進行壓縮測定楊氏模量，機器下壓速度設定為 2 mm/min、下壓距離為 1.2 mm。
1.2.3 大鼠 BMSCs 分離、培養及鑒定
取 4 只 2 周齡 SD 大鼠頸椎脫臼處死后用 75%乙醇浸泡 5 min，分離股骨和脛骨，用完全培養基沖洗骨髓腔；將沖洗后的混合液經 200 目無菌過濾網過濾后，轉移到細胞培養瓶中，于 37℃、5%CO2 細胞培養箱中培養，72 h 后換液并適時傳代。取第 3 代細胞行形態學觀察及三系（成骨、成脂、成軟骨）分化鑒定[10]，提示所培養細胞為 BMSCs。取第 3 代 BMSCs 進行以下實驗。
1.2.4 CCK-8 法檢測不同水凝膠支架對 BMSCs 細胞活性的影響
按 100 μL/孔向 96 孔板內加入各組水凝膠，紫外光照射交聯后，PBS 洗去多余交聯劑。于上述 96 孔板中每孔加入 100 μL 濃度為 2×104個/mL 的 BMSCs，每組設 3 個復孔，置于 37℃、5%CO2 細胞培養箱培養。1、4、7 d 每組各取 1 板，每孔加入 CCK-8 試劑 10 μL，37℃、5%CO2 細胞培養箱中避光孵育 3 h 后，用移液槍將每孔上清液按照之前孔板的位置和順序轉移到 1 塊新的 96 孔板中，于 T 酶標儀中檢測新板中樣品在 450 nm 波長處的吸光度（A）值。
1.2.5 不同水凝膠支架對 BMSCs 成骨分化的影響
ALP 和茜素紅染色：按照 1 mL/孔向 6 孔板內加入各組水凝膠，經紫外光照射交聯后，PBS 洗去多余交聯劑。于上述 6 孔板中每孔加入 1 mL 濃度為 2×105個/mL 的 BMSCs，48 h 后換成 2 mL 成骨誘導分化培養基，此后每 3 天換液。分別于成骨誘導分化 7、14 d 時常規行 ALP 染色[11]以及茜素紅染色并鏡下觀察。根據染色結果，采用 Image J 軟件對染色陽性面積百分比進行定量分析。
OCN 免疫熒光染色：同茜素紅染色方法成骨誘導分化 14 d 后取板，PBS 和多聚甲醛處理后，加入 OCN 一抗過夜；洗去一抗后二抗避光孵育 2 h，PBS 清洗后加入 DAPI 染液，15 min 后清洗，熒光倒置顯微鏡觀察染色效果。
Western blot 檢測：取第 3 代 BMSCs 用完全培養基在各組支架表面培養，待細胞融合度達 80%～90% 時換用成骨誘導分化培養基培養 14 d 后收集細胞，提取定量蛋白后，于 10% 分離膠中電泳 80 V、30 min，100 V、1 h；轉移到聚偏二氟乙烯膜上，室溫下封閉 2 h，與抗 ALP 抗體（1∶500）、抗 OCN 抗體（1∶300）、抗 GAPDH 抗體（1∶5 000）分別于 4℃ 過夜；與二抗室溫孵育 2 h。曝光分析目的蛋白相對表達量，以各目的蛋白與 GAPDH 蛋白的灰度值比值作為最后結果。
綜合上述檢測結果，篩選最適濃度的 TGF-β1/GelMA 水凝膠支架進行后續動物體內實驗。
1.3 SD 大鼠顱骨缺損修復實驗
1.3.1 SD 大鼠顱骨缺損模型建立及分組
取 36 只 8 周齡 SD 大鼠隨機分為 3 組，分別為對照組、GelMA 組和 GelMA+TGF-β1 組，每組 12 只。采用腹腔注射苯巴比妥（50 mg/kg）麻醉大鼠后，行顱骨正中切口，用牙科鉆制備直徑 5 mm 的顱骨全層缺損。GelMA 組和 GelMA+TGF-β1 組分別于缺損處加入 20 μL GelMA 水凝膠以及 600 ng/mL TGF-β1與 GelMA 水凝膠混合物，紫外光照射 10 s 交聯，待支架穩定后縫合切口。術后大鼠每天皮下注射 3 萬 U 青霉素，連續 3 d。
1.3.2 micro-CT 觀測
術后 4、8 周每組各取 3 只大鼠，同上法麻醉后進行經心灌注處死，取出大鼠顱骨，4% 多聚甲醛固定 24 h 后 PBS 反復沖洗。對顱骨樣本行 micro-CT 掃描，數據用 VGstudio 軟件分析，測量骨體積（bone value，BV），并計算 BV 相對組織體積（total value，TV）的比值（BV/TV）。其中，TV 為大鼠 5 mm 顱骨缺損區組織總體積（包括軟組織和骨）。
1.3.3 組織學觀察
將 micro-CT 掃描后的樣本進行脫鈣、切片（片厚 10 μm），常規行 HE 染色和 OCN 免疫組織化學染色觀察。
1.4 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 水凝膠支架生物相容性觀測
2.1.1 水凝膠支架表征
掃描電鏡觀察示，A、F 組支架孔隙和孔徑大小無明顯區別（圖 1）；A、F 組支架楊氏模量分別為（54.19±2.78）MPa 和（54.84±1.03）MPa，差異無統計學意義（t=0.377，P=0.725），表明負載 TGF-β1 后不影響 GelMA 水凝膠的性狀和功能。
圖1
水凝膠支架掃描電鏡觀察（×200）
a. A 組；b. F 組
Figure1. Scanning electron microscope observation of hydrogel scaffold (×200)a. Group A; b. Group F
2.1.2 CCK-8 法檢測不同水凝膠支架對 BMSCs 細胞活性的影響
隨培養時間延長，各組細胞活性均逐漸增加。隨 TGF-β1 濃度升高，細胞活性逐漸增加，其中 D 組達最高，隨后逐漸減弱；除培養 7 d D、E 組間細胞活性 A 值比較差異無統計學意義（P>0.05）外，培養 4、7 d D 組細胞活性 A 值均顯著高于其余各組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
圖2
CCK-8 法檢測各組培養各時間點細胞活性
Figure2.
CCK-8 assay to detect cell activity at each time point
2.1.3 不同水凝膠支架對 BMSCs 成骨分化的影響
ALP 和茜素紅染色：隨 TGF-β1 濃度升高，促 BMSCs 成骨分化作用逐漸增強，D 組達最高，隨后逐漸減弱。其中 D 組 ALP 染色和茜素紅染色陽性面積百分比均顯著高于其余各組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 3～5。OCN 免疫熒光染色：隨 TGF-β1 濃度升高，OCN 陽性表達逐漸增強，D 組達最高，隨后逐漸減弱。見圖 6。Western blot 檢測：隨 TGF-β1 濃度升高，細胞中 ALP、OCN 蛋白相對表達量均逐漸增加，D 組達最高，隨后逐漸降低；D 組顯著高于其余各組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 7。綜合上述檢測結果，選擇濃度為 600 ng/mL 的 TGF-β1/GelMA 水凝膠支架進行動物體內實驗。
圖3
成骨誘導 7 d ALP 染色觀察（×40）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure3. ALP staining observation after 7 days of osteogenic induction (×40)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
圖4
成骨誘導 14 d 茜素紅染色觀察（×40）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure4. Alizarin red staining observation after 14 days of osteogenic induction (×40)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
圖5
各組 ALP 染色和茜素紅染色定量分析
*P<0.05 a. ALP 染色陽性面積百分比；b. 茜素紅染色陽性面積百分比
Figure5. Quantitative analysis of ALP and alizarin red stainings in each group*P<0.05 a. Positive area percentage of ALP staining; b. Positive area percentage of alizarin red staining
圖6
成骨誘導 14 d OCN 免疫熒光染色觀察（×100）
從左至右依次為 OCN 染色、DAPI 染色、二者重疊 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure6. OCN immunofluorescence staining after 14 days of osteogenic induction (×100)From left to right for OCN staining, DAPI staining, and merge, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
圖7
Western blot 檢測各組細胞中 ALP、OCN 蛋白表達
a. 電泳圖 1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組 5：E 組 6：F 組；b. 各組 ALP 蛋白相對表達量 *P<0.05；c. 各組 OCN 蛋白相對表達量 *P<0.05
Figure7. ALP and OCN protein expressions in cells of each group detected by Western blota. Electrophoretogram 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E 6: Group F; b. Relative expression of ALP protein in each group *P<0.05; c. Relative expression of OCN protein in each group *P<0.05
2.2 SD 大鼠顱骨缺損修復實驗
2.2.1 micro-CT 觀測
術后 4 周，對照組僅有少量新生骨組織，其余兩組新生骨組織形成多于對照組，其中 GelMA+TGF-β1 組新生骨組織最多，修復效果最好；術后 8 周，這種趨勢更為明顯，GelMA+TGF-β1 組新生骨組織已將缺損部位大部分覆蓋。定量分析示，術后 4、8 周 GelMA+TGF-β1 組 BV/TV 均顯著高于 GelMA 組和對照組，GelMA 組顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；各組術后 8 周 BV/TV 顯著多于術后 4 周，比較差異亦有統計學意義（P<0.05）。見圖 8、表 1。
圖8
術后各組 micro-CT 觀測
從左至右依次為對照組、GelMA 組和 GelMA+TGF-β1 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周
Figure8. Postoperative micro-CT observation of each groupFrom left to right for control group, GelMA group, and GelMA+TGF-β1 group, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
表1
術后各時間點各組 BV/TV 比較（n=3，
）
Table1.
Comparison of BV/TV in each group at each time point after operation (n=3, 
)
2.2.2 組織學觀察
HE 染色示，術后 4、8 周，GelMA+TGF-β1 組缺損邊緣出現新生骨質，面積大于其余兩組。見圖 9。免疫組織化學染色示，術后 4、8 周，GelMA+TGF-β1 組 OCN 陽性細胞表達顯著多于對照組和 GelMA 組。見圖 10。
圖9
術后各組 HE 染色觀察（×100）
從左至右依次為對照組、GelMA 組和 GelMA+TGF-β1 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周
Figure9. HE staining observation in each group after operation (×100)From left to right for control group, GelMA group, and GelMA+TGF-β1 group, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
圖10
術后各組 OCN 免疫組織化學染色觀察（×100）
從左至右依次為對照組、GelMA 組和 GelMA+TGF-β1 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周
Figure10. OCN immunohistochemical staining observation in each group after operation (×100)From left to right for control group, GelMA group, and GelMA+TGF-β1 group, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
3 討論
骨缺損修復是一個由骨細胞、成骨細胞和破骨細胞共同協作參與的復雜且精細生理過程，臨床上常使用自體骨移植和同種異體骨移植治療骨缺損，但存在取材有限和排斥反應等缺點[12-13]。研究發現[14-15]，利用組織工程技術將含有成骨細胞的支架植入至骨缺損部位，取得了良好修復效果。GelMA 水凝膠含有納米硅酸鹽，可以在不加載任何生長因子的情況下促進成骨，但單純 GelMA 水凝膠不能保持生長因子濃度穩定和保證有效骨愈合[16]。研究發現 TGF-β1 在 BMSCs 分化早期具有促進成骨分化和修復骨缺損作用，但是當 TGF-β1 濃度較高時，反而對成骨產生抑制作用[17-19]。本研究通過將生長因子 TGF-β1 與 GelMA 水凝膠混合制備出新型組織工程支架，以探究其在骨缺損修復過程中的作用。
由于 TGF-β1 對成骨作用的影響與劑量有關，因此我們檢測了不同濃度（0、150、300、600、900 和 1 200 ng/mL）TGF-β1/GelMA 水凝膠支架對細胞功能的影響。CCK-8 增殖實驗結果顯示，負載 TGF-β1 的 GelMA 水凝膠支架具有促進細胞增殖的能力，并與劑量和時間相關，當 TGF-β1 濃度為 600 ng/mL 時增殖效果最好；但是濃度較高時呈現抑制現象，這可能與 Smad 蛋白的磷酸化有關[20]。ALP 和茜素紅的表達量均與成骨效果成正相關[21-22]。本研究 ALP 染色和茜素紅染色結果顯示，BMSCs 在不同濃度外源性 TGF-β1 作用下，二者陽性面積百分比有所差異，當 TGF-β1 濃度為 600 ng/mL 時最高。該結果與 OCN 免疫熒光染色和 Western blot 檢測結果一致。因此得出結論，當外源性 TGF-β1 濃度為 600 ng/mL 時支架的成骨作用最好。
隨后我們制備了 TGF-β1 濃度為 600 ng/mL 的 TGF-β1/GelMA 復合水凝膠支架用于 SD 大鼠顱骨缺損模型，以檢測骨缺損修復效果。通過對術后 4、8 周取材樣本組織進行分析，我們發現各組新生骨組織量增長趨勢保持一致，復合支架組的成骨性能高于單純支架組且遠高于對照組，這種差異可能與水凝膠的骨傳導性有關，HE 染色和 OCN 免疫組織化學染色結果也再次驗證了這一結果。
綜上述，TGF-β1/GelMA 復合水凝膠支架具有優異的生物相容性和骨傳導性，在骨缺損治療中具有良好骨誘導性，可作為生物活性材料應用于骨組織再生。
作者貢獻：劉亞軍負責研究設計、數據收集整理、論文撰寫；劉翔宇、徐陳、王照東負責數據收集、統計分析；官建中、魏幫國對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經蚌埠醫學院醫學倫理委員會批準［倫動科批字（2020）第 232 號］。實驗動物生產許可證號：SCXK（魯）20190003；實驗動物使用許可證號：SYXK（皖）2017-001。
骨缺損在骨科疾病中較常見，常因先天因素、外傷、感染或手術原因造成原位骨質丟失[1]。骨缺損治療分為自體骨移植和同種異體骨移植，但均存在局限性[2]。
隨著組織工程研究進展，大量聚合物被用作介導骨組織再生的支架材料[3]。甲基丙烯酰化明膠（gelatin methacryloyl，GelMA）可通過光引發劑在紫外光照射下凝固成膠，是一種生物源性材料，具有優異的生物相容性和可降解性。GelMA 水凝膠因配制簡單、凝固時間短、硬度高、溶脹率低等優點，近年來被廣泛用于骨組織工程支架材料研究[4-5]。研究發現，將加載成骨分化潛能的細胞-支架復合物植入至骨缺損部位，具有成骨修復作用[6]。然而，組織工程細胞-支架復合物也存在植入祖細胞數量不夠明確、細胞存活率相對較低和免疫排斥風險較高等不足[7]。因此，建立能促進自身體內細胞向成骨細胞分化的藥物因子支架可能是另一種很有前景的策略。
TGF-β1 作為 TGF-β 家族成員，廣泛存在于人類血小板和哺乳動物骨中，具有調節細胞生長的功能。近年來，TGF-β1 促進 BMSCs 成骨分化的研究眾多[8]，但關于 TGF-β1 加載修飾 GelMA 水凝膠支架修復骨缺損的研究尚罕見報道。本研究擬通過將不同濃度 TGF-β1 加載入 GelMA 水凝膠制備骨組織工程支架，通過體外實驗驗證并篩選最適濃度的 TGF-β1/GelMA 水凝膠支架，然后將其植入 SD 大鼠顱骨缺損部位，檢測其對顱骨缺損再生的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2 周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠 4 只，體質量（80±10）g；8 周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠 36 只，體質量（250±10）g；購于濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司。
F12 基礎培養基、FBS（GIBCO 公司，美國）；TGF-β1（北京義翹神州生物技術有限公司）；GelMA 水凝膠（蘇州永沁泉智能設備有限公司）；成脂、成軟骨和成骨誘導分化培養基（Cyagen 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；北京蘭杰柯科技有限公司）；抗骨鈣素（osteocalcin，OCN）抗體、抗 ALP 抗體、抗 GAPDH 抗體（Abcam 公司，英國）。T 酶標儀（Thermo 公司，美國）；熒光倒置顯微鏡（Zeiss 公司，美國）；掃描電鏡（上海西努光學科技有限公司）；萬能材料試驗機（揚州德瑞儀器設備有限公司）。
1.2 水凝膠支架生物相容性觀測
1.2.1 實驗分組及方法
Lin 等[9]研究發現 10%GelMA 對 BMSCs 成骨分化效果最佳，因此本實驗選用 10%GelMA 水凝膠作為研究對象。取 10 mL PBS 加入至光引發劑中，65℃ 避光水浴 30 min，期間震蕩數次。取 1 g GelMA 水凝膠加入上述含光引發劑的溶液內，再次 65℃ 避光水浴 30 min，期間震蕩數次；隨后經 0.22 μm 過濾器過濾，所得溶液即為 10%GelMA 溶液。取 900 μL 10%GelMA 溶液，向其中加入 100 μL PBS 超聲 30 s 即為 GelMA 組（A 組）溶液。分別取 100 μL 濃度為 150、300、600、900、1 200 ng/mL 的外源性 TGF-β1 加入至 900 μL 10%GelMA 溶液內，超聲 30 s 使其混勻（分別設為 B、C、D、E、F 組）。取各組水凝膠溶液紫外光照射（83 mW/cm2、405 nm）交聯 30 s，即為實驗所需支架。
1.2.2 水凝膠支架表征
① 掃描電鏡觀察：分別取 2 mL A、F 組水凝膠溶液加入到 EP 管內，紫外光照射交聯形成支架后，–80°C 冷凍過夜，經冷凍干燥后用刀片切開水凝膠支架，掃描電鏡觀察其截斷面。② 楊氏模量檢測：首先用刀片將 1 mL 注射器頭部切去制成模具，然后分別取 100 μL A、F 組水凝膠溶液注入模具內，紫外光照射交聯后緩慢推出，用刀片切成直徑 6 mm、高 5 mm 的圓柱體支架，將支架置于萬能材料試驗機下進行壓縮測定楊氏模量，機器下壓速度設定為 2 mm/min、下壓距離為 1.2 mm。
1.2.3 大鼠 BMSCs 分離、培養及鑒定
取 4 只 2 周齡 SD 大鼠頸椎脫臼處死后用 75%乙醇浸泡 5 min，分離股骨和脛骨，用完全培養基沖洗骨髓腔；將沖洗后的混合液經 200 目無菌過濾網過濾后，轉移到細胞培養瓶中，于 37℃、5%CO2 細胞培養箱中培養，72 h 后換液并適時傳代。取第 3 代細胞行形態學觀察及三系（成骨、成脂、成軟骨）分化鑒定[10]，提示所培養細胞為 BMSCs。取第 3 代 BMSCs 進行以下實驗。
1.2.4 CCK-8 法檢測不同水凝膠支架對 BMSCs 細胞活性的影響
按 100 μL/孔向 96 孔板內加入各組水凝膠，紫外光照射交聯后，PBS 洗去多余交聯劑。于上述 96 孔板中每孔加入 100 μL 濃度為 2×104個/mL 的 BMSCs，每組設 3 個復孔，置于 37℃、5%CO2 細胞培養箱培養。1、4、7 d 每組各取 1 板，每孔加入 CCK-8 試劑 10 μL，37℃、5%CO2 細胞培養箱中避光孵育 3 h 后，用移液槍將每孔上清液按照之前孔板的位置和順序轉移到 1 塊新的 96 孔板中，于 T 酶標儀中檢測新板中樣品在 450 nm 波長處的吸光度（A）值。
1.2.5 不同水凝膠支架對 BMSCs 成骨分化的影響
ALP 和茜素紅染色：按照 1 mL/孔向 6 孔板內加入各組水凝膠，經紫外光照射交聯后，PBS 洗去多余交聯劑。于上述 6 孔板中每孔加入 1 mL 濃度為 2×105個/mL 的 BMSCs，48 h 后換成 2 mL 成骨誘導分化培養基，此后每 3 天換液。分別于成骨誘導分化 7、14 d 時常規行 ALP 染色[11]以及茜素紅染色并鏡下觀察。根據染色結果，采用 Image J 軟件對染色陽性面積百分比進行定量分析。
OCN 免疫熒光染色：同茜素紅染色方法成骨誘導分化 14 d 后取板，PBS 和多聚甲醛處理后，加入 OCN 一抗過夜；洗去一抗后二抗避光孵育 2 h，PBS 清洗后加入 DAPI 染液，15 min 后清洗，熒光倒置顯微鏡觀察染色效果。
Western blot 檢測：取第 3 代 BMSCs 用完全培養基在各組支架表面培養，待細胞融合度達 80%～90% 時換用成骨誘導分化培養基培養 14 d 后收集細胞，提取定量蛋白后，于 10% 分離膠中電泳 80 V、30 min，100 V、1 h；轉移到聚偏二氟乙烯膜上，室溫下封閉 2 h，與抗 ALP 抗體（1∶500）、抗 OCN 抗體（1∶300）、抗 GAPDH 抗體（1∶5 000）分別于 4℃ 過夜；與二抗室溫孵育 2 h。曝光分析目的蛋白相對表達量，以各目的蛋白與 GAPDH 蛋白的灰度值比值作為最后結果。
綜合上述檢測結果，篩選最適濃度的 TGF-β1/GelMA 水凝膠支架進行后續動物體內實驗。
1.3 SD 大鼠顱骨缺損修復實驗
1.3.1 SD 大鼠顱骨缺損模型建立及分組
取 36 只 8 周齡 SD 大鼠隨機分為 3 組，分別為對照組、GelMA 組和 GelMA+TGF-β1 組，每組 12 只。采用腹腔注射苯巴比妥（50 mg/kg）麻醉大鼠后，行顱骨正中切口，用牙科鉆制備直徑 5 mm 的顱骨全層缺損。GelMA 組和 GelMA+TGF-β1 組分別于缺損處加入 20 μL GelMA 水凝膠以及 600 ng/mL TGF-β1與 GelMA 水凝膠混合物，紫外光照射 10 s 交聯，待支架穩定后縫合切口。術后大鼠每天皮下注射 3 萬 U 青霉素，連續 3 d。
1.3.2 micro-CT 觀測
術后 4、8 周每組各取 3 只大鼠，同上法麻醉后進行經心灌注處死，取出大鼠顱骨，4% 多聚甲醛固定 24 h 后 PBS 反復沖洗。對顱骨樣本行 micro-CT 掃描，數據用 VGstudio 軟件分析，測量骨體積（bone value，BV），并計算 BV 相對組織體積（total value，TV）的比值（BV/TV）。其中，TV 為大鼠 5 mm 顱骨缺損區組織總體積（包括軟組織和骨）。
1.3.3 組織學觀察
將 micro-CT 掃描后的樣本進行脫鈣、切片（片厚 10 μm），常規行 HE 染色和 OCN 免疫組織化學染色觀察。
1.4 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 水凝膠支架生物相容性觀測
2.1.1 水凝膠支架表征
掃描電鏡觀察示，A、F 組支架孔隙和孔徑大小無明顯區別（圖 1）；A、F 組支架楊氏模量分別為（54.19±2.78）MPa 和（54.84±1.03）MPa，差異無統計學意義（t=0.377，P=0.725），表明負載 TGF-β1 后不影響 GelMA 水凝膠的性狀和功能。
圖1
水凝膠支架掃描電鏡觀察（×200）
a. A 組；b. F 組
Figure1. Scanning electron microscope observation of hydrogel scaffold (×200)a. Group A; b. Group F
2.1.2 CCK-8 法檢測不同水凝膠支架對 BMSCs 細胞活性的影響
隨培養時間延長，各組細胞活性均逐漸增加。隨 TGF-β1 濃度升高，細胞活性逐漸增加，其中 D 組達最高，隨后逐漸減弱；除培養 7 d D、E 組間細胞活性 A 值比較差異無統計學意義（P>0.05）外，培養 4、7 d D 組細胞活性 A 值均顯著高于其余各組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
圖2
CCK-8 法檢測各組培養各時間點細胞活性
Figure2.
CCK-8 assay to detect cell activity at each time point
2.1.3 不同水凝膠支架對 BMSCs 成骨分化的影響
ALP 和茜素紅染色：隨 TGF-β1 濃度升高，促 BMSCs 成骨分化作用逐漸增強，D 組達最高，隨后逐漸減弱。其中 D 組 ALP 染色和茜素紅染色陽性面積百分比均顯著高于其余各組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 3～5。OCN 免疫熒光染色：隨 TGF-β1 濃度升高，OCN 陽性表達逐漸增強，D 組達最高，隨后逐漸減弱。見圖 6。Western blot 檢測：隨 TGF-β1 濃度升高，細胞中 ALP、OCN 蛋白相對表達量均逐漸增加，D 組達最高，隨后逐漸降低；D 組顯著高于其余各組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 7。綜合上述檢測結果，選擇濃度為 600 ng/mL 的 TGF-β1/GelMA 水凝膠支架進行動物體內實驗。
圖3
成骨誘導 7 d ALP 染色觀察（×40）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure3. ALP staining observation after 7 days of osteogenic induction (×40)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
圖4
成骨誘導 14 d 茜素紅染色觀察（×40）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure4. Alizarin red staining observation after 14 days of osteogenic induction (×40)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
圖5
各組 ALP 染色和茜素紅染色定量分析
*P<0.05 a. ALP 染色陽性面積百分比；b. 茜素紅染色陽性面積百分比
Figure5. Quantitative analysis of ALP and alizarin red stainings in each group*P<0.05 a. Positive area percentage of ALP staining; b. Positive area percentage of alizarin red staining
圖6
成骨誘導 14 d OCN 免疫熒光染色觀察（×100）
從左至右依次為 OCN 染色、DAPI 染色、二者重疊 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure6. OCN immunofluorescence staining after 14 days of osteogenic induction (×100)From left to right for OCN staining, DAPI staining, and merge, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
圖7
Western blot 檢測各組細胞中 ALP、OCN 蛋白表達
a. 電泳圖 1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組 5：E 組 6：F 組；b. 各組 ALP 蛋白相對表達量 *P<0.05；c. 各組 OCN 蛋白相對表達量 *P<0.05
Figure7. ALP and OCN protein expressions in cells of each group detected by Western blota. Electrophoretogram 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E 6: Group F; b. Relative expression of ALP protein in each group *P<0.05; c. Relative expression of OCN protein in each group *P<0.05
2.2 SD 大鼠顱骨缺損修復實驗
2.2.1 micro-CT 觀測
術后 4 周，對照組僅有少量新生骨組織，其余兩組新生骨組織形成多于對照組，其中 GelMA+TGF-β1 組新生骨組織最多，修復效果最好；術后 8 周，這種趨勢更為明顯，GelMA+TGF-β1 組新生骨組織已將缺損部位大部分覆蓋。定量分析示，術后 4、8 周 GelMA+TGF-β1 組 BV/TV 均顯著高于 GelMA 組和對照組，GelMA 組顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；各組術后 8 周 BV/TV 顯著多于術后 4 周，比較差異亦有統計學意義（P<0.05）。見圖 8、表 1。
圖8
術后各組 micro-CT 觀測
從左至右依次為對照組、GelMA 組和 GelMA+TGF-β1 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周
Figure8. Postoperative micro-CT observation of each groupFrom left to right for control group, GelMA group, and GelMA+TGF-β1 group, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
表1
術后各時間點各組 BV/TV 比較（n=3，）
Table1.
Comparison of BV/TV in each group at each time point after operation (n=3, )
2.2.2 組織學觀察
HE 染色示，術后 4、8 周，GelMA+TGF-β1 組缺損邊緣出現新生骨質，面積大于其余兩組。見圖 9。免疫組織化學染色示，術后 4、8 周，GelMA+TGF-β1 組 OCN 陽性細胞表達顯著多于對照組和 GelMA 組。見圖 10。
圖9
術后各組 HE 染色觀察（×100）
從左至右依次為對照組、GelMA 組和 GelMA+TGF-β1 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周
Figure9. HE staining observation in each group after operation (×100)From left to right for control group, GelMA group, and GelMA+TGF-β1 group, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
圖10
術后各組 OCN 免疫組織化學染色觀察（×100）
從左至右依次為對照組、GelMA 組和 GelMA+TGF-β1 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周
Figure10. OCN immunohistochemical staining observation in each group after operation (×100)From left to right for control group, GelMA group, and GelMA+TGF-β1 group, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
3 討論
骨缺損修復是一個由骨細胞、成骨細胞和破骨細胞共同協作參與的復雜且精細生理過程，臨床上常使用自體骨移植和同種異體骨移植治療骨缺損，但存在取材有限和排斥反應等缺點[12-13]。研究發現[14-15]，利用組織工程技術將含有成骨細胞的支架植入至骨缺損部位，取得了良好修復效果。GelMA 水凝膠含有納米硅酸鹽，可以在不加載任何生長因子的情況下促進成骨，但單純 GelMA 水凝膠不能保持生長因子濃度穩定和保證有效骨愈合[16]。研究發現 TGF-β1 在 BMSCs 分化早期具有促進成骨分化和修復骨缺損作用，但是當 TGF-β1 濃度較高時，反而對成骨產生抑制作用[17-19]。本研究通過將生長因子 TGF-β1 與 GelMA 水凝膠混合制備出新型組織工程支架，以探究其在骨缺損修復過程中的作用。
由于 TGF-β1 對成骨作用的影響與劑量有關，因此我們檢測了不同濃度（0、150、300、600、900 和 1 200 ng/mL）TGF-β1/GelMA 水凝膠支架對細胞功能的影響。CCK-8 增殖實驗結果顯示，負載 TGF-β1 的 GelMA 水凝膠支架具有促進細胞增殖的能力，并與劑量和時間相關，當 TGF-β1 濃度為 600 ng/mL 時增殖效果最好；但是濃度較高時呈現抑制現象，這可能與 Smad 蛋白的磷酸化有關[20]。ALP 和茜素紅的表達量均與成骨效果成正相關[21-22]。本研究 ALP 染色和茜素紅染色結果顯示，BMSCs 在不同濃度外源性 TGF-β1 作用下，二者陽性面積百分比有所差異，當 TGF-β1 濃度為 600 ng/mL 時最高。該結果與 OCN 免疫熒光染色和 Western blot 檢測結果一致。因此得出結論，當外源性 TGF-β1 濃度為 600 ng/mL 時支架的成骨作用最好。
隨后我們制備了 TGF-β1 濃度為 600 ng/mL 的 TGF-β1/GelMA 復合水凝膠支架用于 SD 大鼠顱骨缺損模型，以檢測骨缺損修復效果。通過對術后 4、8 周取材樣本組織進行分析，我們發現各組新生骨組織量增長趨勢保持一致，復合支架組的成骨性能高于單純支架組且遠高于對照組，這種差異可能與水凝膠的骨傳導性有關，HE 染色和 OCN 免疫組織化學染色結果也再次驗證了這一結果。
綜上述，TGF-β1/GelMA 復合水凝膠支架具有優異的生物相容性和骨傳導性，在骨缺損治療中具有良好骨誘導性，可作為生物活性材料應用于骨組織再生。
作者貢獻：劉亞軍負責研究設計、數據收集整理、論文撰寫；劉翔宇、徐陳、王照東負責數據收集、統計分析；官建中、魏幫國對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經蚌埠醫學院醫學倫理委員會批準［倫動科批字（2020）第 232 號］。實驗動物生產許可證號：SCXK（魯）20190003；實驗動物使用許可證號：SYXK（皖）2017-001。
