引用本文： 王靜, 唐亮, 劉洪利, 邱嚴力. 負載內皮祖細胞外泌體的改性鈦對脂肪來源干細胞成骨及成血管分化作用的研究. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(8): 1032-1040. doi: 10.7507/1002-1892.202203132 復制
金屬鈦是目前應用比較廣泛的骨科替代材料[1]，但該材料具有生物惰性，難以與骨組織直接結合，而骨結合不良是臨床植入物松動、脫落以及周圍組織發炎的主要原因[2]。因此，對金屬鈦進行改性，提高其生物活性和骨結合能力具有重要意義[3]。本課題組前期成功制備了超聲酸蝕/陽極氧化聯合改性鈦（titanium modified by ultrasonic acid etching/anodic oxidation，UAT），體外實驗證實改性后的材料生物活性和親水性明顯提高，能促進細胞增殖、黏附和成骨分化，但成血管能力并不理想[4]。而材料植入體內后，如果周圍血管長入速度過慢或達不到內層，會導致血液循環障礙，使成骨效果不穩定，因此需要對UAT進一步優化。
外泌體（exosome，exo）是細胞分泌的一種囊泡結構，含有多種蛋白質、信使RNA、微小RNA及細胞因子，是細胞旁分泌的關鍵組分，可參與細胞間的通信及調控[5-6]。近期研究發現，內皮祖細胞exo（endothelial progenitor cells-exo，EPCs-exo）可促進細胞增殖、遷移及血管生成，有效提高血管密度，進而加快骨再生進程[7-8]。本研究旨在將UAT負載EPCs-exo進行進一步改性，研究改性后材料對脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）成骨和成血管分化能力的影響。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與主要試劑、儀器
6～8周齡雄性SD大鼠10只，體質量約250 g，購于河北省實驗動物中心。
DMEM、FBS、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、Ⅰ型膠原酶（GIBCO公司，美國）；內皮細胞培養基（endothelial cell medium，ECM；Science公司，美國）；M199（Therm公司，美國）；Percoll淋巴細胞分離液（General Electric公司，美國）；exo提取試劑盒（大連美侖生物技術有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒、ALP試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；武漢博士德生物工程有限公司）；單克隆抗體 CD29、CD90、CD34、CD133（Abcam公司，美國）；活/死細胞染色試劑盒（南京凱基生物技術股份有限公司）；茜素紅染色試劑盒、鬼筆環肽（北京索萊寶科技有限公司）；RNA提取試劑盒、RT-PCR 試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。
掃描電鏡（ZEISS公司，德國）；激光共聚焦顯微鏡（Andor公司，英國）；流式細胞儀（Milipore公司，美國）；酶標儀（Molecular Devices公司，美國）；實時熒光定量PCR儀、CO2培養箱（Thermo 公司，美國）。
1.2 ADSCs培養及鑒定
采用頸椎脫臼法處死10只大鼠，分離腹股溝及附睪周圍脂肪組織，加入達脂肪組織體積2倍的0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃消化60 min，200目篩網過濾； 以1200×g離心10 min；棄上清，DMEM重懸細胞后，置于37℃、5%CO2培養箱培養并傳代。取第3代ADSCs，胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，調整細胞密度為5×108個/mL。取200 μL細胞懸液加入5 μL CD29、2 μL CD90熒光抗體，避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞表面抗原表達。
1.3 EPCs-exo提取及鑒定
取1.2處死大鼠的脛骨和股骨，D-Hank 液反復沖洗骨髓腔并收集骨髓，以1500×g離心5 min，M199重懸細胞，加入等體積Percoll淋巴細胞分離液，以1500×g離心15 min；吸取中間白膜層單核細胞，調整細胞密度為1×109個/L，接種于含ECM的培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱培養并傳代。取第3代EPCs，采用流式細胞儀檢測CD34、CD133表達。
取第3～5代EPCs提取exo，PBS清洗細胞后更換無血清培養基培養48 h。收集細胞上清液，4℃以3000×g離心20 min；去除細胞和碎片，將上清液轉移至超速離心管中，加入1/2體積的exo提取試劑，混勻，4℃孵育過夜。取出離心管，于4℃以10 000×g離心60 min；棄上清，無菌PBS重懸，獲得EPCs-exo。取EPCs-exo行Western blot檢測CD9、CD81表達。
1.4 UAT制備及觀察
1.4.1 UAT制備
取本課題組前期采用3D打印技術制備的鈦片[4]，室溫下置于蝕刻溶液（2%氫氟酸及1.8%鹽酸混合液）5 min。將酸蝕后的鈦片作為陽極、鉑片作為陰極，兩極以間距40 mm置于含0.25%氫氟酸、2%去離子水的乙二醇溶液進行陽極氧化，磁力攪拌器勻速攪拌；氧化條件：氧化電壓為15 V恒定直流電壓，氧化時間1 h[4]；獲得UAT。
1.4.2 觀測指標
① UAT表征：掃描電鏡下觀察經超聲酸蝕和陽極氧化方法改性前后的樣品表面形貌。
② UAT體外吸附和釋放EPCs-exo能力檢測：采用PBS溶液制備不同濃度（100、200 ng/mL）EPCs-exo溶液，然后放置UAT，于2、4、8、12、24、48 h采用BCA法檢測溶液中EPCs-exo含量，評價UAT吸附EPCs-exo能力。
將上述步驟中放置48 h吸附EPCs-exo的UAT置于24孔板中，加入200 μL PBS溶液，于0、2、4、6、8 d收集培養液并更換200 μL新鮮PBS溶液，采用BCA法檢測各時間點培養液中EPCs-exo含量，計算累積釋放率（%），評價UAT釋放EPCs-exo能力。
1.5 UAT-ADSCs-exo構建及觀測
1.5.1 UAT-ADSCs-exo構建
將UAT置于24孔板中，分別加入1 mL含不同濃度EPCs-exo（0、100、200 ng/mL）的DMEM培養液，于37℃、5%CO2條件下孵育48 h，使EPCs-exo吸附于UAT表面后，將其轉至新24孔板內，每孔1個。取ADSCs調整細胞密度為2×104個/mL，按照每孔1 mL將細胞懸液滴至UAT表面，開始復合培養UAT-ADSCs-exo，并在相應時間點進行后續觀測。
1.5.2 生物相容性檢測
① 細胞形態觀察：復合培養7 d，各組取部分樣品PBS清洗、多聚甲醛固定15 min、含0.5%Triton X-100的PBS溶液室溫下透膜處理10 min，FITC標記鬼筆環肽液室溫染色20 min，Hoechst 33258 復染15 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞形態。
② 活/死細胞染色檢測：復合培養7 d，各組取部分樣品PBS清洗后，按照活/死細胞染色試劑盒說明書配制工作液并加入孔板中，室溫孵育30 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察活/死細胞情況，綠色熒光為活細胞、紅色熒光為死細胞。每個樣品取5個視野，用 Image J軟件計數活細胞。
③ 細胞增殖檢測：復合培養1、3、5、7 d，各組加入10%CCK-8 溶液孵育2 h，使用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度（A）值。
1.5.3 ADSCs成骨和成血管能力觀測
① ALP染色及茜素紅染色：復合培養7 d，各組4%多聚甲醛固定2 min，加入ALP染色試劑室溫避光孵育15 min，觀察細胞染色情況；另復合培養7、14 d時按ALP試劑盒說明書操作，檢測細胞ALP活性。復合培養21 d行茜素紅染色，用10% 氯化十六烷基吡啶溶解后，酶標儀測定562 nm 波長處A值，觀察其礦化能力。各組均取3孔進行上述觀測。
②成骨及成血管相關基因檢測：復合培養14 d，用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，測定濃度，按逆轉錄試劑盒與RT-PCR試劑盒進行逆轉錄與多聚酶聯反應，分析成骨相關基因骨鈣素（osteocalcin，OCN）、RUNT相關基因2（RUNT-related transcription factor 2，Runx2）、ALP、Ⅰ型膠原蛋白（collagen type 1，COL-1）和成血管相關基因VEGF的表達。反應體系為20 μL。使用β-actin作為參考基因，采用2–ΔΔCt 法計算各目的基因的相對表達量。基因引物序列見表1。
表1
各基因引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequences of genes (5′→3′)
③ 成骨及成血管相關蛋白檢測：復合培養14 d，PBS和多聚甲醛處理細胞后，加入 OCN（1∶100）、VEGF（1∶100）一抗孵育過夜；PBS洗去一抗，加入相應二抗避光染色1 h，DAPI染色15 min，激光共聚焦顯微鏡觀察，Actin染色呈紅色，OCN、VEGF染色呈綠色，細胞核染色呈藍色，Image J軟件對熒光強度進行定量分析。
1.6 統計學方法
采用SPSS23.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞與exo鑒定
流式細胞儀檢測培養的兩種細胞分別高表達ADSCs標記物CD29、CD90以及EPCs標記物CD34、CD133，符合ADSCs、EPCs表面抗原特征，且純度較高（圖1a、b）。Western blot檢測示EPCs-exo表面蛋白CD9、CD81呈強陽性表達（圖1c），表明分離獲得的白色沉淀物為exo。
圖1
細胞與exo鑒定
a. 流式細胞術鑒定ADSCs；b. 流式細胞術鑒定EPCs；c. Western blot檢測EPCs-exo
Figure1. Identification of cells and exoa. Identification of ADSCs by flow cytometry; b. Identification of EPCs by flow cytometry; c. Identification of EPCs-exo by Western blot
2.2 UAT觀測
2.2.1 UAT表征
掃描電鏡觀察，改性前樣品表面不平坦，未見納米級孔隙。改性后樣品表面可見平緩峰-谷形溝壑形貌，在壟溝底部有散在分布的突起狀結構，呈珊瑚狀；突起狀結構是由10個左右直徑為70～80 nm的納米顆粒聚集而成，突起狀結構之間有較多相互連接的納米級孔隙。見圖2。
圖2
掃描電鏡觀察UAT
從左至右分別為放大40、100、20 k、100 k倍 a. 改性前；b. 改性后
Figure2. Scanning electron microscopy observation of UATThe magnification from left to right for 40, 100, 20 k, and 100 k, respectively a. Before modification; b. After modification
2.2.2 UAT體外吸附和釋放EPCs-exo能力
UAT在48 h內能吸附約77% EPCs-exo，而吸附在UAT表面的EPCs-exo在8 d內呈現連續穩定釋放。兩濃度組間吸附量及累及釋放率比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3。
圖3
UAT體外吸附和釋放EPCs-exo能力檢測
Figure3.
The ability of UAT to absorb and release EPCs-exo in vitro
2.3 UAT-ADSCs-exo觀測
2.3.1 生物相容性檢測
① 細胞形態觀察：復合培養7 d后，激光共聚焦顯微鏡下見各組ADSCs在UAT表面生長良好。其中，0 ng/mL組和100 ng/mL組細胞呈細長形狀，絲狀偽足相對較少；200 ng/mL組細胞呈多邊形，完全鋪展，與材料表面呈接觸生長，且與鄰近細胞建立了豐富絲狀偽足接觸。見圖4。
圖4
復合培養7 d激光共聚焦顯微鏡觀察細胞形態（×100）
a. 0 ng/mL組；b. 100 ng/mL組；c. 200 ng/mL組
Figure4. Observation of cell morphology by laser confocal microscope at 7 days after co-culture (×100)a. 0 ng/mL group; b. 100 ng/mL group; c. 200 ng/mL group
② 活/死細胞染色觀察：復合培養7 d后，激光共聚焦顯微鏡下見各組ADSCs均在UAT表面生長良好，未見明顯紅染死細胞。0 ng/mL組、100 ng/mL組、200 ng/mL組活細胞數量分別為（85.33±2.51）、（138.65±2.52）、（178.02±2.64）個。組間差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5。
圖5
復合培養7 d激光共聚焦顯微鏡觀察細胞成活情況（×40）
a. 0 ng/mL組； b. 100 ng/mL組；c. 200 ng/mL組
Figure5. Observation of cell viability by laser confocal microscope at 7 days after co-culture (×40)a. 0 ng/mL group; b. 100 ng/mL group; c. 200 ng/mL group
③ 細胞增殖檢測：隨培養時間延長，各組ADSCs活性逐漸增加。培養前3 d各組細胞A值差異無統計學意義（P>0.05）；5 d后200 ng/mL組顯著高于其余組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖6。
圖6
各組細胞生長曲線
Figure6.
Cell growth curve of each group
2.3.2 ADSCs成骨和成血管能力檢測
① ALP染色及茜素紅染色： 隨EPCs-exo濃度升高，ADSCs成骨能力逐漸增強，200 ng/mL組ALP染色和茜素紅染色程度較其他兩組明顯增強（圖7）。
圖7
各組復合培養7 d ALP染色和21 d茜素紅染色觀察（×40）
從左至右依次為0 ng/mL組、100 ng/mL組、200 ng/mL組 a. ALP染色；b. 茜素紅染色
Figure7. ALP staining at 7 days after co-culture and alizarin red staining at 21 days after co-culture (×40)From left to right for 0 ng/mL group, 100 ng/mL group, and 200 ng/mL group, respectively a. ALP staining; b. Alizarin red staining
定量分析結果顯示，各時間點200 ng/mL組ADSCs的ALP活性和礦化能力均高于其余兩組，100 ng/mL組高于0 ng/mL組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。
表2
各組細胞ALP活性及礦化能力比較（n=3，
）
Table2.
Comparison of ALP activity and mineralization ability between groups (n=3, 
)
② 成骨及成血管相關基因檢測：復合培養14 d后，與0 ng/mL組相比，100 ng/mL組和200 ng/mL組OCN、Runx2、COL-1、ALP 和VEGF基因表達均增強，其中以200 ng/mL組最明顯，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖8。
圖8
復合培養14 d RT-PCR檢測成骨及成血管相關基因表達
Figure8.
The expression of osteogenesis- and angiogenesis-related genes by RT-PCR at 14 days after co-culture
③ 成骨及成血管相關蛋白檢測：復合培養14 d，隨濃度增加，ADSCs中OCN和VEGF蛋白表達呈遞增趨勢，200 ng/mL組表達水平高于其他組，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖9及表3。
表3
各組細胞免疫熒光強度比較（n=3，
）
Table3.
Comparison of immunofluorescence intensity between groups (n=3, 
)
圖9
復合培養14 d各組免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為Actin染色、OCN/VEGF染色、細胞核染色、三者合并圖像 從上至下依次為 0 ng/mL 組、100 ng/mL 組、200 ng/mL 組 a. OCN；b. VEGF
Figure9. Immunofluorescence staining at 14 days after co-culture (Fluorescence microscope×100)From left to right for Actin staining, OCN/VEGF staining, nucleus staining, and merge image, respectively From top to bottom for 0 ng/mL group, 100 ng/mL group, 200 ng/mL group, respectively a. OCN; b. VEGF
3 討論
exo是由細胞分泌的納米級細胞外囊泡，包含蛋白質、RNA等多種生物活性物質，具有介導細胞間通訊、促進抗原提呈等功能[9]，是骨組織工程領域中新興的治療手段，具有良好的骨修復作用[10]。Geng等[11]將miR-21納米膠囊負載至經酸處理的鈦表面，發現鈦促細胞成骨和成血管能力顯著增強。Zhai等[12]提取經成骨誘導10、15 d MSCs的exo，發現其能促進MSCs成骨分化，將其加載至3D打印純鈦支架后植入大鼠骨缺損處，發現有哈弗管結構的新骨和血管形成。以上研究表明exo具有同時促進細胞成骨及成血管的作用。本研究對負載exo的UAT生物相容性進行了觀測。結果顯示，復合培養后與0 ng/mL組相比，200 ng/mL組UAT表面上生長的ADSCs鋪展最充分；活/死細胞染色和CCK-8檢測結果示隨著exo濃度的增高，UAT表面ADSCs的活性提高；表明exo呈濃度依賴性提高細胞活性，促進細胞黏附和增殖。
ALP是成骨細胞分泌的一種酶，其表達活性常被作為成骨分化的一個重要指標[13]。新骨形成需要成骨細胞分泌細胞外基質，之后繼續礦化，產生鈣結節[14]。Runx2是成骨分化過程中的重要轉錄因子。OCN在骨形成過程中調節晶體生長[15]。為了驗證UAT-ADSCs-exo的成骨效果，本研究進行了ALP活性和細胞礦化能力檢測，結果表明exo能促進ADSCs在UAT表面的成骨分化。RT-PCR結果顯示隨著exo濃度增加，成骨相關基因OCN、 Runx2、ALP、COL-1表達量顯著提高，具有明顯劑量依賴性。我們認為UAT的納米多孔結構能促進ADSCs成骨分化，而加入exo后成骨效應顯著提高，這可能與exo能良好誘導血管生成有關。
血管化是骨再生的關鍵，血管形成后可以輸送營養物質、生長因子、礦物質和氧氣，促進新陳代謝，利于組織修復[16]。exo可以通過其內含的蛋白質、mRNA、微小RNA對血管新生微環境進行調節，從而促進血管生成，使骨再生效應增強。Jia等[7]研究提示EPCs-exo能顯著加速血管形成和成骨效應。然而exo是否能大量負載于UAT表面并保持恒定濃度，對血管生成至關重要。Zhai等[12]的研究表明exo可以很好地吸附在鈦合金支架上，并逐漸釋放到周圍環境中。我們用BCA試劑盒評估了UAT對exo的加載和釋放情況，結果顯示約77% exo在48 h內被吸附，且釋放比例均勻一致，分析這可能與陽極氧化后在鈦表面生成的納米級孔隙有關，該結構具有獨特性能，可以增加材料表面積，提高材料親水性，利于蛋白質的吸附和釋放。
VEGF在趨化細胞、促進有絲分裂和血管生成中發揮作用，并能促進ADSCs的成骨分化，其表達水平可反映血管化程度。本研究中，VEGF基因和蛋白表達都隨著exo濃度升高逐漸增強。exo可將有促血管生成作用的mRNA轉運至細胞中，通過激活信號通路，誘導細胞進入血管生成程序，從而促進毛細血管樣結構生成。有研究將間充質細胞來源exo注射至骨折大鼠體內，發現exo可通過誘導缺氧誘導因子1α促進VEGF的表達，使骨再生能力增強[17]。越來越多研究表明，成骨細胞和EPCs通過信號分子相互聯系，相互促進。成骨細胞可釋放VEGF，促進EPCs血管化；新生血管一方面為骨組織形成輸送氧氣和營養成分，另一方面還可以通過釋放成骨相關因子，如BMP-2或BMP-4促進成骨細胞分化成熟[18]。
本研究成功制備了UAT-ADSCs-exo，體外研究表明其具有較好的生物安全性、較強的成骨及成血管誘導能力，但體內成骨和成血管效果及相關分子機制有待進一步探索。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經滄州醫學高等專科學校動物實驗倫理委員會批準（CY-SYDW-2019-01）；實驗動物使用許可證號：SYXK（冀）2019-006
作者貢獻聲明 王靜：實驗實施、實驗結果統計分析及文章撰寫；邱嚴力：實驗設計；唐亮、劉洪利：結果收集整理
金屬鈦是目前應用比較廣泛的骨科替代材料[1]，但該材料具有生物惰性，難以與骨組織直接結合，而骨結合不良是臨床植入物松動、脫落以及周圍組織發炎的主要原因[2]。因此，對金屬鈦進行改性，提高其生物活性和骨結合能力具有重要意義[3]。本課題組前期成功制備了超聲酸蝕/陽極氧化聯合改性鈦（titanium modified by ultrasonic acid etching/anodic oxidation，UAT），體外實驗證實改性后的材料生物活性和親水性明顯提高，能促進細胞增殖、黏附和成骨分化，但成血管能力并不理想[4]。而材料植入體內后，如果周圍血管長入速度過慢或達不到內層，會導致血液循環障礙，使成骨效果不穩定，因此需要對UAT進一步優化。
外泌體（exosome，exo）是細胞分泌的一種囊泡結構，含有多種蛋白質、信使RNA、微小RNA及細胞因子，是細胞旁分泌的關鍵組分，可參與細胞間的通信及調控[5-6]。近期研究發現，內皮祖細胞exo（endothelial progenitor cells-exo，EPCs-exo）可促進細胞增殖、遷移及血管生成，有效提高血管密度，進而加快骨再生進程[7-8]。本研究旨在將UAT負載EPCs-exo進行進一步改性，研究改性后材料對脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）成骨和成血管分化能力的影響。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與主要試劑、儀器
6～8周齡雄性SD大鼠10只，體質量約250 g，購于河北省實驗動物中心。
DMEM、FBS、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、Ⅰ型膠原酶（GIBCO公司，美國）；內皮細胞培養基（endothelial cell medium，ECM；Science公司，美國）；M199（Therm公司，美國）；Percoll淋巴細胞分離液（General Electric公司，美國）；exo提取試劑盒（大連美侖生物技術有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒、ALP試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；武漢博士德生物工程有限公司）；單克隆抗體 CD29、CD90、CD34、CD133（Abcam公司，美國）；活/死細胞染色試劑盒（南京凱基生物技術股份有限公司）；茜素紅染色試劑盒、鬼筆環肽（北京索萊寶科技有限公司）；RNA提取試劑盒、RT-PCR 試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。
掃描電鏡（ZEISS公司，德國）；激光共聚焦顯微鏡（Andor公司，英國）；流式細胞儀（Milipore公司，美國）；酶標儀（Molecular Devices公司，美國）；實時熒光定量PCR儀、CO2培養箱（Thermo 公司，美國）。
1.2 ADSCs培養及鑒定
采用頸椎脫臼法處死10只大鼠，分離腹股溝及附睪周圍脂肪組織，加入達脂肪組織體積2倍的0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃消化60 min，200目篩網過濾； 以1200×g離心10 min；棄上清，DMEM重懸細胞后，置于37℃、5%CO2培養箱培養并傳代。取第3代ADSCs，胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，調整細胞密度為5×108個/mL。取200 μL細胞懸液加入5 μL CD29、2 μL CD90熒光抗體，避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞表面抗原表達。
1.3 EPCs-exo提取及鑒定
取1.2處死大鼠的脛骨和股骨，D-Hank 液反復沖洗骨髓腔并收集骨髓，以1500×g離心5 min，M199重懸細胞，加入等體積Percoll淋巴細胞分離液，以1500×g離心15 min；吸取中間白膜層單核細胞，調整細胞密度為1×109個/L，接種于含ECM的培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱培養并傳代。取第3代EPCs，采用流式細胞儀檢測CD34、CD133表達。
取第3～5代EPCs提取exo，PBS清洗細胞后更換無血清培養基培養48 h。收集細胞上清液，4℃以3000×g離心20 min；去除細胞和碎片，將上清液轉移至超速離心管中，加入1/2體積的exo提取試劑，混勻，4℃孵育過夜。取出離心管，于4℃以10 000×g離心60 min；棄上清，無菌PBS重懸，獲得EPCs-exo。取EPCs-exo行Western blot檢測CD9、CD81表達。
1.4 UAT制備及觀察
1.4.1 UAT制備
取本課題組前期采用3D打印技術制備的鈦片[4]，室溫下置于蝕刻溶液（2%氫氟酸及1.8%鹽酸混合液）5 min。將酸蝕后的鈦片作為陽極、鉑片作為陰極，兩極以間距40 mm置于含0.25%氫氟酸、2%去離子水的乙二醇溶液進行陽極氧化，磁力攪拌器勻速攪拌；氧化條件：氧化電壓為15 V恒定直流電壓，氧化時間1 h[4]；獲得UAT。
1.4.2 觀測指標
① UAT表征：掃描電鏡下觀察經超聲酸蝕和陽極氧化方法改性前后的樣品表面形貌。
② UAT體外吸附和釋放EPCs-exo能力檢測：采用PBS溶液制備不同濃度（100、200 ng/mL）EPCs-exo溶液，然后放置UAT，于2、4、8、12、24、48 h采用BCA法檢測溶液中EPCs-exo含量，評價UAT吸附EPCs-exo能力。
將上述步驟中放置48 h吸附EPCs-exo的UAT置于24孔板中，加入200 μL PBS溶液，于0、2、4、6、8 d收集培養液并更換200 μL新鮮PBS溶液，采用BCA法檢測各時間點培養液中EPCs-exo含量，計算累積釋放率（%），評價UAT釋放EPCs-exo能力。
1.5 UAT-ADSCs-exo構建及觀測
1.5.1 UAT-ADSCs-exo構建
將UAT置于24孔板中，分別加入1 mL含不同濃度EPCs-exo（0、100、200 ng/mL）的DMEM培養液，于37℃、5%CO2條件下孵育48 h，使EPCs-exo吸附于UAT表面后，將其轉至新24孔板內，每孔1個。取ADSCs調整細胞密度為2×104個/mL，按照每孔1 mL將細胞懸液滴至UAT表面，開始復合培養UAT-ADSCs-exo，并在相應時間點進行后續觀測。
1.5.2 生物相容性檢測
① 細胞形態觀察：復合培養7 d，各組取部分樣品PBS清洗、多聚甲醛固定15 min、含0.5%Triton X-100的PBS溶液室溫下透膜處理10 min，FITC標記鬼筆環肽液室溫染色20 min，Hoechst 33258 復染15 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞形態。
② 活/死細胞染色檢測：復合培養7 d，各組取部分樣品PBS清洗后，按照活/死細胞染色試劑盒說明書配制工作液并加入孔板中，室溫孵育30 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察活/死細胞情況，綠色熒光為活細胞、紅色熒光為死細胞。每個樣品取5個視野，用 Image J軟件計數活細胞。
③ 細胞增殖檢測：復合培養1、3、5、7 d，各組加入10%CCK-8 溶液孵育2 h，使用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度（A）值。
1.5.3 ADSCs成骨和成血管能力觀測
① ALP染色及茜素紅染色：復合培養7 d，各組4%多聚甲醛固定2 min，加入ALP染色試劑室溫避光孵育15 min，觀察細胞染色情況；另復合培養7、14 d時按ALP試劑盒說明書操作，檢測細胞ALP活性。復合培養21 d行茜素紅染色，用10% 氯化十六烷基吡啶溶解后，酶標儀測定562 nm 波長處A值，觀察其礦化能力。各組均取3孔進行上述觀測。
②成骨及成血管相關基因檢測：復合培養14 d，用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，測定濃度，按逆轉錄試劑盒與RT-PCR試劑盒進行逆轉錄與多聚酶聯反應，分析成骨相關基因骨鈣素（osteocalcin，OCN）、RUNT相關基因2（RUNT-related transcription factor 2，Runx2）、ALP、Ⅰ型膠原蛋白（collagen type 1，COL-1）和成血管相關基因VEGF的表達。反應體系為20 μL。使用β-actin作為參考基因，采用2–ΔΔCt 法計算各目的基因的相對表達量。基因引物序列見表1。
表1
各基因引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequences of genes (5′→3′)
③ 成骨及成血管相關蛋白檢測：復合培養14 d，PBS和多聚甲醛處理細胞后，加入 OCN（1∶100）、VEGF（1∶100）一抗孵育過夜；PBS洗去一抗，加入相應二抗避光染色1 h，DAPI染色15 min，激光共聚焦顯微鏡觀察，Actin染色呈紅色，OCN、VEGF染色呈綠色，細胞核染色呈藍色，Image J軟件對熒光強度進行定量分析。
1.6 統計學方法
采用SPSS23.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞與exo鑒定
流式細胞儀檢測培養的兩種細胞分別高表達ADSCs標記物CD29、CD90以及EPCs標記物CD34、CD133，符合ADSCs、EPCs表面抗原特征，且純度較高（圖1a、b）。Western blot檢測示EPCs-exo表面蛋白CD9、CD81呈強陽性表達（圖1c），表明分離獲得的白色沉淀物為exo。
圖1
細胞與exo鑒定
a. 流式細胞術鑒定ADSCs；b. 流式細胞術鑒定EPCs；c. Western blot檢測EPCs-exo
Figure1. Identification of cells and exoa. Identification of ADSCs by flow cytometry; b. Identification of EPCs by flow cytometry; c. Identification of EPCs-exo by Western blot
2.2 UAT觀測
2.2.1 UAT表征
掃描電鏡觀察，改性前樣品表面不平坦，未見納米級孔隙。改性后樣品表面可見平緩峰-谷形溝壑形貌，在壟溝底部有散在分布的突起狀結構，呈珊瑚狀；突起狀結構是由10個左右直徑為70～80 nm的納米顆粒聚集而成，突起狀結構之間有較多相互連接的納米級孔隙。見圖2。
圖2
掃描電鏡觀察UAT
從左至右分別為放大40、100、20 k、100 k倍 a. 改性前；b. 改性后
Figure2. Scanning electron microscopy observation of UATThe magnification from left to right for 40, 100, 20 k, and 100 k, respectively a. Before modification; b. After modification
2.2.2 UAT體外吸附和釋放EPCs-exo能力
UAT在48 h內能吸附約77% EPCs-exo，而吸附在UAT表面的EPCs-exo在8 d內呈現連續穩定釋放。兩濃度組間吸附量及累及釋放率比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3。
圖3
UAT體外吸附和釋放EPCs-exo能力檢測
Figure3.
The ability of UAT to absorb and release EPCs-exo in vitro
2.3 UAT-ADSCs-exo觀測
2.3.1 生物相容性檢測
① 細胞形態觀察：復合培養7 d后，激光共聚焦顯微鏡下見各組ADSCs在UAT表面生長良好。其中，0 ng/mL組和100 ng/mL組細胞呈細長形狀，絲狀偽足相對較少；200 ng/mL組細胞呈多邊形，完全鋪展，與材料表面呈接觸生長，且與鄰近細胞建立了豐富絲狀偽足接觸。見圖4。
圖4
復合培養7 d激光共聚焦顯微鏡觀察細胞形態（×100）
a. 0 ng/mL組；b. 100 ng/mL組；c. 200 ng/mL組
Figure4. Observation of cell morphology by laser confocal microscope at 7 days after co-culture (×100)a. 0 ng/mL group; b. 100 ng/mL group; c. 200 ng/mL group
② 活/死細胞染色觀察：復合培養7 d后，激光共聚焦顯微鏡下見各組ADSCs均在UAT表面生長良好，未見明顯紅染死細胞。0 ng/mL組、100 ng/mL組、200 ng/mL組活細胞數量分別為（85.33±2.51）、（138.65±2.52）、（178.02±2.64）個。組間差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5。
圖5
復合培養7 d激光共聚焦顯微鏡觀察細胞成活情況（×40）
a. 0 ng/mL組； b. 100 ng/mL組；c. 200 ng/mL組
Figure5. Observation of cell viability by laser confocal microscope at 7 days after co-culture (×40)a. 0 ng/mL group; b. 100 ng/mL group; c. 200 ng/mL group
③ 細胞增殖檢測：隨培養時間延長，各組ADSCs活性逐漸增加。培養前3 d各組細胞A值差異無統計學意義（P>0.05）；5 d后200 ng/mL組顯著高于其余組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖6。
圖6
各組細胞生長曲線
Figure6.
Cell growth curve of each group
2.3.2 ADSCs成骨和成血管能力檢測
① ALP染色及茜素紅染色： 隨EPCs-exo濃度升高，ADSCs成骨能力逐漸增強，200 ng/mL組ALP染色和茜素紅染色程度較其他兩組明顯增強（圖7）。
圖7
各組復合培養7 d ALP染色和21 d茜素紅染色觀察（×40）
從左至右依次為0 ng/mL組、100 ng/mL組、200 ng/mL組 a. ALP染色；b. 茜素紅染色
Figure7. ALP staining at 7 days after co-culture and alizarin red staining at 21 days after co-culture (×40)From left to right for 0 ng/mL group, 100 ng/mL group, and 200 ng/mL group, respectively a. ALP staining; b. Alizarin red staining
定量分析結果顯示，各時間點200 ng/mL組ADSCs的ALP活性和礦化能力均高于其余兩組，100 ng/mL組高于0 ng/mL組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。
表2
各組細胞ALP活性及礦化能力比較（n=3，）
Table2.
Comparison of ALP activity and mineralization ability between groups (n=3, )
② 成骨及成血管相關基因檢測：復合培養14 d后，與0 ng/mL組相比，100 ng/mL組和200 ng/mL組OCN、Runx2、COL-1、ALP 和VEGF基因表達均增強，其中以200 ng/mL組最明顯，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖8。
圖8
復合培養14 d RT-PCR檢測成骨及成血管相關基因表達
Figure8.
The expression of osteogenesis- and angiogenesis-related genes by RT-PCR at 14 days after co-culture
③ 成骨及成血管相關蛋白檢測：復合培養14 d，隨濃度增加，ADSCs中OCN和VEGF蛋白表達呈遞增趨勢，200 ng/mL組表達水平高于其他組，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖9及表3。
表3
各組細胞免疫熒光強度比較（n=3，）
Table3.
Comparison of immunofluorescence intensity between groups (n=3, )
圖9
復合培養14 d各組免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為Actin染色、OCN/VEGF染色、細胞核染色、三者合并圖像 從上至下依次為 0 ng/mL 組、100 ng/mL 組、200 ng/mL 組 a. OCN；b. VEGF
Figure9. Immunofluorescence staining at 14 days after co-culture (Fluorescence microscope×100)From left to right for Actin staining, OCN/VEGF staining, nucleus staining, and merge image, respectively From top to bottom for 0 ng/mL group, 100 ng/mL group, 200 ng/mL group, respectively a. OCN; b. VEGF
3 討論
exo是由細胞分泌的納米級細胞外囊泡，包含蛋白質、RNA等多種生物活性物質，具有介導細胞間通訊、促進抗原提呈等功能[9]，是骨組織工程領域中新興的治療手段，具有良好的骨修復作用[10]。Geng等[11]將miR-21納米膠囊負載至經酸處理的鈦表面，發現鈦促細胞成骨和成血管能力顯著增強。Zhai等[12]提取經成骨誘導10、15 d MSCs的exo，發現其能促進MSCs成骨分化，將其加載至3D打印純鈦支架后植入大鼠骨缺損處，發現有哈弗管結構的新骨和血管形成。以上研究表明exo具有同時促進細胞成骨及成血管的作用。本研究對負載exo的UAT生物相容性進行了觀測。結果顯示，復合培養后與0 ng/mL組相比，200 ng/mL組UAT表面上生長的ADSCs鋪展最充分；活/死細胞染色和CCK-8檢測結果示隨著exo濃度的增高，UAT表面ADSCs的活性提高；表明exo呈濃度依賴性提高細胞活性，促進細胞黏附和增殖。
ALP是成骨細胞分泌的一種酶，其表達活性常被作為成骨分化的一個重要指標[13]。新骨形成需要成骨細胞分泌細胞外基質，之后繼續礦化，產生鈣結節[14]。Runx2是成骨分化過程中的重要轉錄因子。OCN在骨形成過程中調節晶體生長[15]。為了驗證UAT-ADSCs-exo的成骨效果，本研究進行了ALP活性和細胞礦化能力檢測，結果表明exo能促進ADSCs在UAT表面的成骨分化。RT-PCR結果顯示隨著exo濃度增加，成骨相關基因OCN、 Runx2、ALP、COL-1表達量顯著提高，具有明顯劑量依賴性。我們認為UAT的納米多孔結構能促進ADSCs成骨分化，而加入exo后成骨效應顯著提高，這可能與exo能良好誘導血管生成有關。
血管化是骨再生的關鍵，血管形成后可以輸送營養物質、生長因子、礦物質和氧氣，促進新陳代謝，利于組織修復[16]。exo可以通過其內含的蛋白質、mRNA、微小RNA對血管新生微環境進行調節，從而促進血管生成，使骨再生效應增強。Jia等[7]研究提示EPCs-exo能顯著加速血管形成和成骨效應。然而exo是否能大量負載于UAT表面并保持恒定濃度，對血管生成至關重要。Zhai等[12]的研究表明exo可以很好地吸附在鈦合金支架上，并逐漸釋放到周圍環境中。我們用BCA試劑盒評估了UAT對exo的加載和釋放情況，結果顯示約77% exo在48 h內被吸附，且釋放比例均勻一致，分析這可能與陽極氧化后在鈦表面生成的納米級孔隙有關，該結構具有獨特性能，可以增加材料表面積，提高材料親水性，利于蛋白質的吸附和釋放。
VEGF在趨化細胞、促進有絲分裂和血管生成中發揮作用，并能促進ADSCs的成骨分化，其表達水平可反映血管化程度。本研究中，VEGF基因和蛋白表達都隨著exo濃度升高逐漸增強。exo可將有促血管生成作用的mRNA轉運至細胞中，通過激活信號通路，誘導細胞進入血管生成程序，從而促進毛細血管樣結構生成。有研究將間充質細胞來源exo注射至骨折大鼠體內，發現exo可通過誘導缺氧誘導因子1α促進VEGF的表達，使骨再生能力增強[17]。越來越多研究表明，成骨細胞和EPCs通過信號分子相互聯系，相互促進。成骨細胞可釋放VEGF，促進EPCs血管化；新生血管一方面為骨組織形成輸送氧氣和營養成分，另一方面還可以通過釋放成骨相關因子，如BMP-2或BMP-4促進成骨細胞分化成熟[18]。
本研究成功制備了UAT-ADSCs-exo，體外研究表明其具有較好的生物安全性、較強的成骨及成血管誘導能力，但體內成骨和成血管效果及相關分子機制有待進一步探索。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經滄州醫學高等專科學校動物實驗倫理委員會批準（CY-SYDW-2019-01）；實驗動物使用許可證號：SYXK（冀）2019-006
作者貢獻聲明 王靜：實驗實施、實驗結果統計分析及文章撰寫；邱嚴力：實驗設計；唐亮、劉洪利：結果收集整理
