引用本文： 李衛華, 梁風光, 董詩豫, 呂偉振, 劉延濤, 王曉, 馬靜毅. 含明膠納米粒的仿生關節潤滑液對人工關節材料的減摩抗磨作用研究. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(2): 196-201. doi: 10.7507/1002-1892.202209035 復制
人工關節材料磨損是影響關節使用壽命、導致關節置換失敗的首要原因[1-2]。因此，開展人工關節材料減摩、抗磨機制研究，將納米摩擦學的減摩、抗磨機制引入人工關節潤滑中，具有非常重要的臨床意義。本研究擬制備含明膠納米粒（gelatin nanoparticle，GLN-NP）的透明質酸（hyaluronic acid，HA）仿生關節潤滑液，測試其摩擦學性能和生物相容性，為解決人工關節磨損提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要材料及儀器
HA（昆明貝克諾頓藥品銷售有限公司）；98%膠原蛋白酸性（A型）明膠（上海愛必信生物科技有限公司）；丙酮、戊二醛（天津科密歐化學試劑公司）；MTT（上海阿拉丁生物科技有限公司）；DMSO（北京百靈威科技有限公司）；氧化鋯陶瓷球板（深圳佳日豐電子材料有限公司）；RAW264.7小鼠巨噬細胞（上海通派生物科技有限公司）。
Zeta sizer Nano-ZS90激光粒度儀（Malvern Instruments公司，英國）；Contour GT-K三維形貌儀（Bruker公司，德國）；Multiskan MK3酶標儀（Thermo Scientific公司，美國）；UMT-2型摩擦試驗機（Brucher公司，德國）。
1.2 GLN-NP相關觀測
1.2.1 GLN-NP制備
天平稱取98%A型明膠2.50 g，放入200 mL燒杯中，加去離子水50 mL，40℃水浴勻速攪拌，至明膠完全溶解。加入丙酮溶液50 mL，見溶液變渾濁，靜置10 min至溶液穩定；去除析出液體，加入50 mL去離子水再次水浴至明膠重新溶解，逐滴勻速加入1 mol/mL HCl溶液至pH值為2.5。
量取丙酮溶液80 mL，緩慢加入配置好的明膠溶液中。加入8%戊二醛水溶液1 000 μL，持續攪拌30 min后，以離心半徑9 cm、9 000 r/min離心10 min后棄上層溶液，收集底部沉淀。用丙酮溶液溶解沉淀物，同上法離心10 min×3次。水浴鍋中加熱沉淀物，快速揮發丙酮，用0.22 μm孔徑有機濾膜過濾，制備得到GLN-NP溶液，凍干后為GLN-NP粉末，3～6℃保存。
1.2.2 GLN-NP粒徑測量
取GLN-NP粉末，加入去離子水中充分溶解，放置于超聲波清洗機中超聲15 min，用激光粒度儀測定GLN-NP粒徑。
1.2.3 GLN-NP穩定性測試
取等量GLN-NP粉末3份，分別溶于去離子水、pH7.4 PBS及含10%FBS的DMEM培養基（完全培養基）中，超聲波清洗機超聲15 min，然后有機濾膜過濾除菌后無菌包裝密封，置于37℃、120 r/min恒溫震蕩箱中。于0、12、24、36、48 h后同1.2.2方法測量GLN-NP粒徑，觀察在模擬體溫條件下GLN-NP隨時間推移的穩定性。
1.3 仿生關節潤滑液相關觀測
1.3.1 各種潤滑液的配制
取適量GLN-NP粉末溶于去離子水中，配成濃度分別為10、30、60 mg/mL的GLN-NP溶液（溶液1）；然后取適量透明質酸鈉粉末，溶于去離子水中，配成濃度分別為30、60 mg/mL的HA溶液（溶液2），溶脹過夜；將溶液1與溶液2按體積比1∶1混合，配成6種不同濃度的HA+GLN-NP溶液，分別簡稱為HA+GLN-NP 15+5、HA+GLN-NP 15+15和HA+GLN-NP 15+30以及HA+GLN-NP 30+5、HA+GLN-NP 30+15和HA+GLN-NP 30+30的仿生關節潤滑液。
作為參照，將溶液1與生理鹽水按體積比1∶1混合，配置了含不同濃度（5、10、30 mg/mL）GLN-NP溶液，分別簡稱為GLN-NP 5、GLN-NP 15和GLN-NP 30；同時將溶液2與生理鹽水按體積比1∶1混合，配置了濃度為15、30 mg/mL的HA溶液，分別簡稱為HA 15和HA 30。
1.3.2 減摩測試
在UMT-2型摩擦試驗機上，測量各種潤滑液對氧化鋯陶瓷的減摩防護效果。采用氧化鋯陶瓷球（直徑4.0 mm）為上摩擦副，氧化鋯陶瓷板（20 mm×40 mm×3 mm)為下摩擦副，進行摩擦學測試。設定參數為時間30 min、運動距離5 mm、載荷30 N、頻率2 Hz、速率15 mm/s，運動方式為直線往復摩擦運動。測定不同潤滑液的摩擦系數。更換不同摩擦接觸點再次測試，重復3次，記錄數據。
1.3.3 抗磨測試
采用與1.3.2中相同的氧化鋯陶瓷球板為摩擦副，在UMT-2型摩擦試驗機上測試各種潤滑液對氧化鋯陶瓷的抗磨防護效果。設定參數同1.3.2。將不同潤滑液滴加于陶瓷摩擦球與陶瓷摩擦板摩擦接觸區域，記錄對應的每條磨痕，重復3次。氧化鋯陶瓷板用乙醇超聲清洗后晾干，對每條磨痕應用Contour GT-K三維形貌儀進行掃描，每條磨痕選取3處不同位置分別記錄磨痕的寬度、深度以及磨痕體積等數據。
1.3.4 生物相容性檢測
取RAW264.7小鼠巨噬細胞，應用MTT法觀測仿生關節潤滑液的體外生物相容性。取對數生長期的RAW264.7小鼠巨噬細胞接種于96孔板中，每孔加入100 μL約5 000個細胞，于37°C、5%CO2細胞培養箱中培養24 h；將濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.5、5.0 mg/mL的GLN-NP溶液、HA溶液和HA+GLN-NP溶液（HA∶GLN-NP為1∶1）加入各孔細胞中，同時設置空白對照組。培養48 h后棄上清液，于各孔中滴入用pH7.4 PBS配制的MTT溶液，繼續培養4 h后棄上清液，于各孔中加入100 μL DMSO后搖床震蕩10 min，至紫色結晶物充分溶解，用酶標儀測量570 nm波長處吸光度（A）值，計算細胞成活率。
1.4 統計學方法
采用GraphPad Prism 8.0.2統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 GLN-NP的粒徑表征及穩定性檢測
A型明膠加丙酮及戊二醛制備的GLN-NP 粒徑約為139 nm，粒徑分布指數為0.17，表現為單一的高峰，說明GLN-NP顆粒在去離子水中分布集中、粒徑較小。在模擬體溫條件下的完全培養基、pH7.4 PBS和去離子水中，GLN-NP隨時間變化的粒徑變化均不超過10 nm，說明GLN-NP有很好的分散穩定性，且未發生聚集現象。見圖1。
圖1
GLN-NP粒徑表征和穩定性檢測
a. 粒徑分布；b. 在不同介質中的粒徑變化
Figure1. Particle size characterization and stability test of GLN-NPa. Size distribution; b. Size variations in different mediums
2.2 仿生關節潤滑液相關觀測
2.2.1 減摩測試
與單純15、30 mg/mL HA及生理鹽水相比，在其中添加不同濃度GLN-NP后，其摩擦系數明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）；添加各濃度GLN-NP組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2。
圖2
載荷為30 N下不同介質中加入各濃度GLN-NP后的摩擦系數
a. 生理鹽水中；b. 15 mg/mL HA中；c. 30 mg/mL HA中
Figure2. The friction coefficient of different mediums with different concentration of GLN-NP under a load of 30 Na. In normal saline; b. In 15 mg/mL HA; c. In 30 mg/mL HA
2.2.2 抗磨測試
與單純15、30 mg/mL HA及生理鹽水相比，在其中添加不同濃度GLN-NP后，測得的磨痕深度和寬度及磨損體積均明顯減小，差異有統計學意義（P<0.05）；說明HA添加GLN-NP后抗磨能力明顯提高。添加各濃度GLN-NP組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3、4。
圖3
不同介質中加入各濃度GLN-NP后對氧化鋯陶瓷的抗磨損作用三維形貌圖
從左到右依次為生理鹽水、15 mg/mL HA、30 mg/mL HA中 a. 0 mg/mL GLN-NP；b. 5 mg/mL GLN-NP；c. 15 mg/mL GLN-NP；d. 30 mg/mL GLN-NP
Figure3. Three-dimensional topography of anti-wear effect of zirconia ceramics with different concentrations of GLN-NP in different mediaFrom left to right for normal saline, 15 mg/mL HA, and 30 mg/mL HA a. 0 mg/mL GLN-NP; b. 5 mg/mL GLN-NP; c. 15 mg/mL GLN-NP; d. 30 mg/mL GLN-NP
圖4
不同介質中加入各濃度GLN-NP后氧化鋯陶瓷表面的磨損體積
Figure4.
Wear volume of zirconia ceramic surface after adding different concentrations of GLN-NP in different media
2.2.3 生物相容性檢測
GLN-NP、HA和HA+GLN-NP溶液隨濃度提高細胞成活率稍有下降，但細胞成活率均在90%以上，組間差異無統計學意義（P>0.05）；說明3種溶液對小鼠巨噬細胞無明顯毒性，生物相容性良好。見圖5。
圖5
HA、GLN-NP及HA+GLN-NP 3種溶液對小鼠巨噬細胞成活率的影響
Figure5.
Effects of HA, GLN-NP, and HA+GLN-NP on the survival rate of macrophages in mouse
3 討論
人體關節能夠長時間保持正常活動并極少磨損，是由于滑膜和關節軟骨分泌的關節液起潤滑作用。人工關節假體置換手術時，需截骨去除關節軟骨，并切除關節周圍大部分關節囊及滑膜組織，這就人為清除了人體關節的天然潤滑系統，關節不再分泌關節液進行潤滑。潤滑不充分和承受的體質量負荷，使人工關節的摩擦系數很高，假體界面出現嚴重磨損，大大降低了人工關節使用壽命[3-4]。磨損產生大量亞微米級磨屑顆粒，可激活機體吞噬系統，促進破骨細胞生成，誘導炎癥因子產生，引起假體與骨界面間骨溶解吸收，從而產生關節假體松動，導致人工假體置換失敗[5-7]。針對上述由于缺乏潤滑導致摩擦磨損增加而出現的人工關節過早失敗問題，向人工關節中注射HA仿生潤滑液以改善潤滑狀況已得到廣泛研究，并在臨床得到初步應用[8]。
HA又稱玻璃酸鈉，是一種天然多糖類，廣泛分布于人體各部位，對運動部位摩擦起到良好的潤滑性能和誘導修復受損關節軟骨的作用。研究表明[9]HA可起到顯著抑制滑膜上肽類疼痛介質的作用，并迅速緩解關節疼痛；可抑制軟骨的變性變化，并改善變性軟骨中的軟骨代謝，從而改善關節功能，且其黏液彈性兼有提高關節液彈性黏度和減震的作用。人工關節摩擦的力學性能與傳統的工程機械摩擦副材料較為接近，因此，人工關節的潤滑防護可以從機械工程潤滑的技術和方法中參考借鑒[10]。大量研究揭示, 在潤滑油中按一定比例加入納米硫化物、納米軟金屬、納米氧化物及聚合物等納米粒子后，能顯著提高潤滑效果和承載負荷；同理，純水中加入納米粒子也能顯著提高其減摩、抗磨效果[11-12]。關于納米顆粒的抗磨潤滑機制，目前主要有兩種學術觀點，一種是認為納米顆粒在接受摩擦磨損時，由于剪切力作用在磨損表面形成沉積潤滑膜；另一種是認為納米顆粒在摩擦力作用下的微滾動[13]。由于生物相容性及細胞毒性反應的問題，作為潤滑液（油和水）添加劑的納米粒子均不能用于人工關節潤滑，但為我們尋找新型仿生關節潤滑液、為人工關節提供充分潤滑提供了新思路。
目前，針對人工關節材料進行減摩、抗磨和潤滑而研制的仿生關節潤滑液研究有很多[14-16]，其目的大多是為尋找可以應用于人工關節內具有減摩、抗磨特性且無機體排斥性的仿生關節潤滑液。納米水凝膠顆粒作為重要的納米藥物載體而備受關注，除了因其具有良好的生物相容性外，還有良好的水溶性、高含水量和納米尺寸[17-18]。這也是它能夠作為仿生關節潤滑液納米添加劑的必要條件。此外，內部交聯的網絡結構不僅賦予了它良好穩定性，而且使它具有相對其他納米藥物載體較高的剛性和承載能力[19]。
本研究中，我們采用明膠制備的納米顆粒添加至不同溶液中，起到了良好的減摩、抗磨作用。GLN-NP添加至FBS溶液中粒徑不升反降，說明顆粒表面未吸附溶液中的蛋白。采用動態光散射法測量的納米顆粒粒徑大小與溶液的黏度、介電常數有密切關系。因此，同一種納米顆粒在這3種溶液中的粒徑不同。但3種溶液中粒徑隨時間沒有變化，則很好地說明了GLN-NP未發生團聚，表現出良好的穩定性。
與含GLN-NP的生理鹽水溶液相比，HA+GLN-NP并未降低氧化鋯陶瓷的摩擦系數，反而略有升高。這是因為HA的加入增加了體系的黏度，從而增大了界面間摩擦力。與單純生理鹽水和HA溶液相比，添加了GLN-NP的溶液摩擦系數明顯降低，且濃度變化對摩擦系數無明顯影響。以上結果說明，人工關節植入人體后，無論是否引入HA溶液作為潤滑劑，其摩擦系數都相對較高，而引入納米顆粒則可以極大地降低摩擦系數。
相比而言，不含HA的GLN-NP水溶液摩擦系數最低，而且抗磨效果也非常明顯。此外，制備GLN-NP的明膠作為生物來源材料，其生物相容性良好，這一點也在細胞實驗中得到了證實。因此，GLN-NP水溶液作為仿生關節潤滑液具有一定潛在應用前景。
綜上述，本研究成功制備了一系列含GLN-NP的人工關節材料潤滑液，結果顯示添加GLN-NP的溶液能夠有效降低摩擦、減少磨損，為納米顆粒應用于生物潤滑領域提供了有效證明，也為我們研發除HA以外其他類型的仿生關節潤滑液提供了新的思路。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
作者貢獻聲明 李衛華：研究實施、文章撰寫；梁風光：數據收集整理及統計分析；董詩豫：實驗材料準備和數據收集；呂偉振、劉延濤：實驗實施及數據收集；王曉：經費支持；馬靜毅：實驗監督和領導、初稿審閱和修改
人工關節材料磨損是影響關節使用壽命、導致關節置換失敗的首要原因[1-2]。因此，開展人工關節材料減摩、抗磨機制研究，將納米摩擦學的減摩、抗磨機制引入人工關節潤滑中，具有非常重要的臨床意義。本研究擬制備含明膠納米粒（gelatin nanoparticle，GLN-NP）的透明質酸（hyaluronic acid，HA）仿生關節潤滑液，測試其摩擦學性能和生物相容性，為解決人工關節磨損提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要材料及儀器
HA（昆明貝克諾頓藥品銷售有限公司）；98%膠原蛋白酸性（A型）明膠（上海愛必信生物科技有限公司）；丙酮、戊二醛（天津科密歐化學試劑公司）；MTT（上海阿拉丁生物科技有限公司）；DMSO（北京百靈威科技有限公司）；氧化鋯陶瓷球板（深圳佳日豐電子材料有限公司）；RAW264.7小鼠巨噬細胞（上海通派生物科技有限公司）。
Zeta sizer Nano-ZS90激光粒度儀（Malvern Instruments公司，英國）；Contour GT-K三維形貌儀（Bruker公司，德國）；Multiskan MK3酶標儀（Thermo Scientific公司，美國）；UMT-2型摩擦試驗機（Brucher公司，德國）。
1.2 GLN-NP相關觀測
1.2.1 GLN-NP制備
天平稱取98%A型明膠2.50 g，放入200 mL燒杯中，加去離子水50 mL，40℃水浴勻速攪拌，至明膠完全溶解。加入丙酮溶液50 mL，見溶液變渾濁，靜置10 min至溶液穩定；去除析出液體，加入50 mL去離子水再次水浴至明膠重新溶解，逐滴勻速加入1 mol/mL HCl溶液至pH值為2.5。
量取丙酮溶液80 mL，緩慢加入配置好的明膠溶液中。加入8%戊二醛水溶液1 000 μL，持續攪拌30 min后，以離心半徑9 cm、9 000 r/min離心10 min后棄上層溶液，收集底部沉淀。用丙酮溶液溶解沉淀物，同上法離心10 min×3次。水浴鍋中加熱沉淀物，快速揮發丙酮，用0.22 μm孔徑有機濾膜過濾，制備得到GLN-NP溶液，凍干后為GLN-NP粉末，3～6℃保存。
1.2.2 GLN-NP粒徑測量
取GLN-NP粉末，加入去離子水中充分溶解，放置于超聲波清洗機中超聲15 min，用激光粒度儀測定GLN-NP粒徑。
1.2.3 GLN-NP穩定性測試
取等量GLN-NP粉末3份，分別溶于去離子水、pH7.4 PBS及含10%FBS的DMEM培養基（完全培養基）中，超聲波清洗機超聲15 min，然后有機濾膜過濾除菌后無菌包裝密封，置于37℃、120 r/min恒溫震蕩箱中。于0、12、24、36、48 h后同1.2.2方法測量GLN-NP粒徑，觀察在模擬體溫條件下GLN-NP隨時間推移的穩定性。
1.3 仿生關節潤滑液相關觀測
1.3.1 各種潤滑液的配制
取適量GLN-NP粉末溶于去離子水中，配成濃度分別為10、30、60 mg/mL的GLN-NP溶液（溶液1）；然后取適量透明質酸鈉粉末，溶于去離子水中，配成濃度分別為30、60 mg/mL的HA溶液（溶液2），溶脹過夜；將溶液1與溶液2按體積比1∶1混合，配成6種不同濃度的HA+GLN-NP溶液，分別簡稱為HA+GLN-NP 15+5、HA+GLN-NP 15+15和HA+GLN-NP 15+30以及HA+GLN-NP 30+5、HA+GLN-NP 30+15和HA+GLN-NP 30+30的仿生關節潤滑液。
作為參照，將溶液1與生理鹽水按體積比1∶1混合，配置了含不同濃度（5、10、30 mg/mL）GLN-NP溶液，分別簡稱為GLN-NP 5、GLN-NP 15和GLN-NP 30；同時將溶液2與生理鹽水按體積比1∶1混合，配置了濃度為15、30 mg/mL的HA溶液，分別簡稱為HA 15和HA 30。
1.3.2 減摩測試
在UMT-2型摩擦試驗機上，測量各種潤滑液對氧化鋯陶瓷的減摩防護效果。采用氧化鋯陶瓷球（直徑4.0 mm）為上摩擦副，氧化鋯陶瓷板（20 mm×40 mm×3 mm)為下摩擦副，進行摩擦學測試。設定參數為時間30 min、運動距離5 mm、載荷30 N、頻率2 Hz、速率15 mm/s，運動方式為直線往復摩擦運動。測定不同潤滑液的摩擦系數。更換不同摩擦接觸點再次測試，重復3次，記錄數據。
1.3.3 抗磨測試
采用與1.3.2中相同的氧化鋯陶瓷球板為摩擦副，在UMT-2型摩擦試驗機上測試各種潤滑液對氧化鋯陶瓷的抗磨防護效果。設定參數同1.3.2。將不同潤滑液滴加于陶瓷摩擦球與陶瓷摩擦板摩擦接觸區域，記錄對應的每條磨痕，重復3次。氧化鋯陶瓷板用乙醇超聲清洗后晾干，對每條磨痕應用Contour GT-K三維形貌儀進行掃描，每條磨痕選取3處不同位置分別記錄磨痕的寬度、深度以及磨痕體積等數據。
1.3.4 生物相容性檢測
取RAW264.7小鼠巨噬細胞，應用MTT法觀測仿生關節潤滑液的體外生物相容性。取對數生長期的RAW264.7小鼠巨噬細胞接種于96孔板中，每孔加入100 μL約5 000個細胞，于37°C、5%CO2細胞培養箱中培養24 h；將濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.5、5.0 mg/mL的GLN-NP溶液、HA溶液和HA+GLN-NP溶液（HA∶GLN-NP為1∶1）加入各孔細胞中，同時設置空白對照組。培養48 h后棄上清液，于各孔中滴入用pH7.4 PBS配制的MTT溶液，繼續培養4 h后棄上清液，于各孔中加入100 μL DMSO后搖床震蕩10 min，至紫色結晶物充分溶解，用酶標儀測量570 nm波長處吸光度（A）值，計算細胞成活率。
1.4 統計學方法
采用GraphPad Prism 8.0.2統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 GLN-NP的粒徑表征及穩定性檢測
A型明膠加丙酮及戊二醛制備的GLN-NP 粒徑約為139 nm，粒徑分布指數為0.17，表現為單一的高峰，說明GLN-NP顆粒在去離子水中分布集中、粒徑較小。在模擬體溫條件下的完全培養基、pH7.4 PBS和去離子水中，GLN-NP隨時間變化的粒徑變化均不超過10 nm，說明GLN-NP有很好的分散穩定性，且未發生聚集現象。見圖1。
圖1
GLN-NP粒徑表征和穩定性檢測
a. 粒徑分布；b. 在不同介質中的粒徑變化
Figure1. Particle size characterization and stability test of GLN-NPa. Size distribution; b. Size variations in different mediums
2.2 仿生關節潤滑液相關觀測
2.2.1 減摩測試
與單純15、30 mg/mL HA及生理鹽水相比，在其中添加不同濃度GLN-NP后，其摩擦系數明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）；添加各濃度GLN-NP組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2。
圖2
載荷為30 N下不同介質中加入各濃度GLN-NP后的摩擦系數
a. 生理鹽水中；b. 15 mg/mL HA中；c. 30 mg/mL HA中
Figure2. The friction coefficient of different mediums with different concentration of GLN-NP under a load of 30 Na. In normal saline; b. In 15 mg/mL HA; c. In 30 mg/mL HA
2.2.2 抗磨測試
與單純15、30 mg/mL HA及生理鹽水相比，在其中添加不同濃度GLN-NP后，測得的磨痕深度和寬度及磨損體積均明顯減小，差異有統計學意義（P<0.05）；說明HA添加GLN-NP后抗磨能力明顯提高。添加各濃度GLN-NP組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3、4。
圖3
不同介質中加入各濃度GLN-NP后對氧化鋯陶瓷的抗磨損作用三維形貌圖
從左到右依次為生理鹽水、15 mg/mL HA、30 mg/mL HA中 a. 0 mg/mL GLN-NP；b. 5 mg/mL GLN-NP；c. 15 mg/mL GLN-NP；d. 30 mg/mL GLN-NP
Figure3. Three-dimensional topography of anti-wear effect of zirconia ceramics with different concentrations of GLN-NP in different mediaFrom left to right for normal saline, 15 mg/mL HA, and 30 mg/mL HA a. 0 mg/mL GLN-NP; b. 5 mg/mL GLN-NP; c. 15 mg/mL GLN-NP; d. 30 mg/mL GLN-NP
圖4
不同介質中加入各濃度GLN-NP后氧化鋯陶瓷表面的磨損體積
Figure4.
Wear volume of zirconia ceramic surface after adding different concentrations of GLN-NP in different media
2.2.3 生物相容性檢測
GLN-NP、HA和HA+GLN-NP溶液隨濃度提高細胞成活率稍有下降，但細胞成活率均在90%以上，組間差異無統計學意義（P>0.05）；說明3種溶液對小鼠巨噬細胞無明顯毒性，生物相容性良好。見圖5。
圖5
HA、GLN-NP及HA+GLN-NP 3種溶液對小鼠巨噬細胞成活率的影響
Figure5.
Effects of HA, GLN-NP, and HA+GLN-NP on the survival rate of macrophages in mouse
3 討論
人體關節能夠長時間保持正常活動并極少磨損，是由于滑膜和關節軟骨分泌的關節液起潤滑作用。人工關節假體置換手術時，需截骨去除關節軟骨，并切除關節周圍大部分關節囊及滑膜組織，這就人為清除了人體關節的天然潤滑系統，關節不再分泌關節液進行潤滑。潤滑不充分和承受的體質量負荷，使人工關節的摩擦系數很高，假體界面出現嚴重磨損，大大降低了人工關節使用壽命[3-4]。磨損產生大量亞微米級磨屑顆粒，可激活機體吞噬系統，促進破骨細胞生成，誘導炎癥因子產生，引起假體與骨界面間骨溶解吸收，從而產生關節假體松動，導致人工假體置換失敗[5-7]。針對上述由于缺乏潤滑導致摩擦磨損增加而出現的人工關節過早失敗問題，向人工關節中注射HA仿生潤滑液以改善潤滑狀況已得到廣泛研究，并在臨床得到初步應用[8]。
HA又稱玻璃酸鈉，是一種天然多糖類，廣泛分布于人體各部位，對運動部位摩擦起到良好的潤滑性能和誘導修復受損關節軟骨的作用。研究表明[9]HA可起到顯著抑制滑膜上肽類疼痛介質的作用，并迅速緩解關節疼痛；可抑制軟骨的變性變化，并改善變性軟骨中的軟骨代謝，從而改善關節功能，且其黏液彈性兼有提高關節液彈性黏度和減震的作用。人工關節摩擦的力學性能與傳統的工程機械摩擦副材料較為接近，因此，人工關節的潤滑防護可以從機械工程潤滑的技術和方法中參考借鑒[10]。大量研究揭示, 在潤滑油中按一定比例加入納米硫化物、納米軟金屬、納米氧化物及聚合物等納米粒子后，能顯著提高潤滑效果和承載負荷；同理，純水中加入納米粒子也能顯著提高其減摩、抗磨效果[11-12]。關于納米顆粒的抗磨潤滑機制，目前主要有兩種學術觀點，一種是認為納米顆粒在接受摩擦磨損時，由于剪切力作用在磨損表面形成沉積潤滑膜；另一種是認為納米顆粒在摩擦力作用下的微滾動[13]。由于生物相容性及細胞毒性反應的問題，作為潤滑液（油和水）添加劑的納米粒子均不能用于人工關節潤滑，但為我們尋找新型仿生關節潤滑液、為人工關節提供充分潤滑提供了新思路。
目前，針對人工關節材料進行減摩、抗磨和潤滑而研制的仿生關節潤滑液研究有很多[14-16]，其目的大多是為尋找可以應用于人工關節內具有減摩、抗磨特性且無機體排斥性的仿生關節潤滑液。納米水凝膠顆粒作為重要的納米藥物載體而備受關注，除了因其具有良好的生物相容性外，還有良好的水溶性、高含水量和納米尺寸[17-18]。這也是它能夠作為仿生關節潤滑液納米添加劑的必要條件。此外，內部交聯的網絡結構不僅賦予了它良好穩定性，而且使它具有相對其他納米藥物載體較高的剛性和承載能力[19]。
本研究中，我們采用明膠制備的納米顆粒添加至不同溶液中，起到了良好的減摩、抗磨作用。GLN-NP添加至FBS溶液中粒徑不升反降，說明顆粒表面未吸附溶液中的蛋白。采用動態光散射法測量的納米顆粒粒徑大小與溶液的黏度、介電常數有密切關系。因此，同一種納米顆粒在這3種溶液中的粒徑不同。但3種溶液中粒徑隨時間沒有變化，則很好地說明了GLN-NP未發生團聚，表現出良好的穩定性。
與含GLN-NP的生理鹽水溶液相比，HA+GLN-NP并未降低氧化鋯陶瓷的摩擦系數，反而略有升高。這是因為HA的加入增加了體系的黏度，從而增大了界面間摩擦力。與單純生理鹽水和HA溶液相比，添加了GLN-NP的溶液摩擦系數明顯降低，且濃度變化對摩擦系數無明顯影響。以上結果說明，人工關節植入人體后，無論是否引入HA溶液作為潤滑劑，其摩擦系數都相對較高，而引入納米顆粒則可以極大地降低摩擦系數。
相比而言，不含HA的GLN-NP水溶液摩擦系數最低，而且抗磨效果也非常明顯。此外，制備GLN-NP的明膠作為生物來源材料，其生物相容性良好，這一點也在細胞實驗中得到了證實。因此，GLN-NP水溶液作為仿生關節潤滑液具有一定潛在應用前景。
綜上述，本研究成功制備了一系列含GLN-NP的人工關節材料潤滑液，結果顯示添加GLN-NP的溶液能夠有效降低摩擦、減少磨損，為納米顆粒應用于生物潤滑領域提供了有效證明，也為我們研發除HA以外其他類型的仿生關節潤滑液提供了新的思路。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
作者貢獻聲明 李衛華：研究實施、文章撰寫；梁風光：數據收集整理及統計分析；董詩豫：實驗材料準備和數據收集；呂偉振、劉延濤：實驗實施及數據收集；王曉：經費支持；馬靜毅：實驗監督和領導、初稿審閱和修改
