近紅外光激發氧化石墨烯/磷酸銀/殼聚糖涂層改善鈦表面抗菌性能的研究_《中國修復重建外科雜志》

作者：

王軼凡 ¹ , 許英德 ¹ , 張雪楓 ¹ , 劉菁宇 ¹ , 韓金彤 ¹ , 朱勝利 ¹ , 梁硯琴 ¹ , 吳水林 ¹ , 崔振鐸 ¹ , 呂維加 ² ,  李朝陽 ¹

1. 天津市復合與功能材料重點實驗室天津大學材料科學與工程學院（天津 300350）;
2. 中國科學院深圳先進技術研究院藥學院（廣東深圳 518055）;

關鍵詞：

細菌感染抗菌涂層異質結構光熱-光動力抗菌

DOI：

10.7507/1002-1892.202303041

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的設計并構建一種氧化石墨烯（graphene oxide，GO）/磷酸銀（Ag₃PO₄）/殼聚糖（chitosan，CS）復合涂層，用于植入物手術中快速殺滅細菌，預防術后感染。方法使用離子交換法制備GO/Ag₃PO₄復合材料，并在生物鈦（Ti）片上依次沉積CS和GO/Ag₃PO₄復合材料，制備Ti-GO/Ag₃PO₄/CS材料。對材料的形貌、物相、光熱和光催化性能、抗菌能力以及與基體的結合力進行表征。結果使用離子交換法成功制備GO/Ag₃PO₄復合材料，通過形貌物相測試證明了GO/Ag₃PO₄的異質結構，Ag₃PO₄和GO形成的異質結構使帶隙從1.79 eV降低到1.39 eV，可以被808 nm近紅外光激發。光熱、光催化實驗表明GO/Ag₃PO₄/CS復合涂層具有良好的光熱和光動力性能；體外抗菌實驗表明，GO/Ag₃PO₄/CS復合涂層在808 nm近紅外光照射20 min后對金黃色葡萄球菌的抑菌率達到99.81%；同時該復合涂層具有良好的光穩定性，可以提供穩定和持續的抗菌效果。結論 GO/Ag₃PO₄/CS復合涂層可以被808 nm近紅外光激發產生活性氧，在光照下具有優異的抗菌能力。

開放性手術引起的切口感染嚴重降低了人工骨植入手術成功率，植入體內的骨植入物表面會因為蛋白凝聚等原因附著大量細菌^[1]。據報道，骨科手術后引發的植入物感染發生率達5%^[2]。目前針對體內細菌感染采取的主要治療方式依舊是口服和注射抗生素，而預防性使用抗生素無法靶向清除材料表面細菌，同時抗生素濫用導致了嚴重的抗生素耐藥性問題和超級細菌的出現^[3]。2021年世界衛生組織（WHO）透露目前處于研發中的43種抗生素均無法解決細菌耐藥性問題。植入物表面涂層既可以保留材料基本特性，又可使抗菌材料直接作用于病灶部位^[4]，提升了植入物表面抗細菌黏附和抗菌能力，有利于預防和治療植入物感染^[5]。

近年來，光熱療法和光動力療法因其抑制細菌生長的作用獲得廣泛研究^[6]，但仍未出現能夠完美解決植入物表面抗菌問題的涂層材料。光熱和光動力材料分別通過光激發產生的局部熱和活性氧（reactive oxygen species，ROS）來破壞細菌膜結構和蛋白質^[7]。相對于可見光激發源，808 nm近紅外光具有優秀的穿透效果，更容易穿透人體組織和血液，且更容易聚焦到患處^[8]。同時由于光療依賴光源提供能量進行抗菌，在無光條件下涂層不會對身體組織產生危害。因此，利用表面涂層增強材料表面抗菌能力可行且具有應用價值。

殼聚糖（chitosan，CS）具有優秀的成膜性及抗菌效果，其表面含有豐富的陽離子基團，覆蓋了CS的鈦片與負電性氧化石墨烯（graphene oxide，GO）可以產生靜電吸附作用，增強涂層結合力^[9-10]。GO比表面積大，表面富含各種官能團，金屬納米顆粒更容易均勻分散在其表面，從而減少納米顆粒團聚，是納米復合材料的優良載體^[11-13]；同時，GO還具有優秀的光熱性能，可以吸收光能產生局部熱，利用GO抗菌性能的研究已成為熱點^[14-16]。磷酸銀（Ag₃PO₄）具有優秀的光催化能力，微溶于水的特點使其可在水中緩慢溶解釋放Ag⁺，實現長期抑菌作用^[17-19]。然而Ag₃PO₄ 2.52 eV的過大帶隙導致其無法被808 nm近紅外光激發產生ROS^[20]。鑒于此，本研究擬利用GO作為載體裝載Ag₃PO₄并調整其帶隙，形成GO/Ag₃PO₄異質結構用于光熱-光動力協同抗菌，并利用CS增強材料與基體的結合力，以期為預防鈦植入物感染提供解決策略。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器

GO粉末（南京先豐納米材料科技有限公司）；AgNO₃（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；CS（上海源葉生物科技有限公司；生物試劑，脫乙酰度90%）；生物鈦片（直徑6 mm、高2.5 mm；上海寶山鋼鐵股份有限公司）；化學品均為分析級，無需進一步純化即可使用。

細胞粉碎機（寧波新芝生物科技有限公司）；Cu Kα輻射X射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD；Bruker公司，德國）；S-4800掃描電鏡（Hitachi公司，日本）； JEM2100F透射電鏡（JEOL公司，日本）；FLIR熱照相機（FLIR公司，美國）；UV-2700型紫外-可見光分光光度計（島津公司，日本）；帶有標準三電極系統的電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；酶標儀（Biotek公司，美國）。

1.2 GO/Ag₃PO₄/CS涂層制備方法

首先，取10 mg GO粉末與12.17 mg AgNO₃于試管中，加入4 mL去離子水，使用細胞粉碎機超聲破碎5 min使材料完全溶解；放置2 h使GO和Ag⁺ 通過靜電吸附相互結合；加入50 mg/mL Na₂HPO₄溶液100 μL，所得溶液即為GO/Ag₃PO₄溶液。

然后，取50 mg CS溶解于裝有10 mL去離子水的燒杯中，加入200 μL冰醋酸攪拌至完全溶解；將生物鈦片于CS溶液中浸泡30 min后，在60℃烘箱中烘干，得到材料Ti-CS。在Ti-CS上滴加20 μL GO/Ag₃PO₄溶液并于37℃烘箱中烘干，重復4次，得到材料Ti-GO/Ag₃PO₄/CS。以同樣方式滴加相同濃度GO溶液，得到材料Ti-GO/CS。

1.3 材料的形貌物相觀察

取材料Ti-CS、Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag₃PO₄/CS，采用Cu Kα輻射XRD進行物相表征，采用掃描電鏡和透射電鏡進行微觀結構和形貌分析。

1.4 材料的光熱性能檢測

用近紅外光（808 nm，0.5 W/cm²）對材料Ti、Ti-CS、Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag₃PO₄/CS照射5 min，通過FLIR熱照相機記錄材料每分鐘的溫度和熱圖像，測量材料升溫曲線。Ag₃PO₄光腐蝕是影響Ti-GO/Ag₃PO₄/CS涂層光穩定性的主要因素，因此對Ti-GO/Ag₃PO₄/CS涂層進行3次光熱循環測試，即使用近紅外光照射材料5 min，然后冷卻5 min，連續測試3個循環，以10 s間隔記錄材料的加熱-冷卻曲線。

1.5 材料的光催化性能檢測

用UV-2700型紫外-可見分光光度計測量Ti、Ti-CS、Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag₃PO₄/CS的光吸收能力；并使用Tauc Plot法計算材料帶隙，計算公式：αhv=A（hv?E_g）^n/2。其中α表示吸收系數，h表示普朗克常量，v表示光頻率，A表示比例常數，E_g表示帶隙，n與半導體材料的類型有關（直接帶隙半導體n=1，間接帶隙半導體n=4）。

使用帶有標準三電極系統的電化學工作站進行暫態光電流響應、電化學阻抗譜的測試。其中工作電極為涂層材料，對電極為鉑片，參比電極為Ag/AgCl電極，電解液為0.5 mol/L Na₂SO₄溶液。

利用DCFH-DA測量材料ROS總釋放量。首先，將以乙醇為溶劑的0.5 mL 1 mmol/L DCFH-DA溶液與2 mL 10 mmol/L NaOH溶液在黑暗中混合并攪拌30 min；之后用PBS（pH=7.4）稀釋溶液，?20℃下避光保存備用。黑暗中在放入各測試材料的96孔板中加入0.1 mL稀釋的DCFH-DA溶液，然后用近紅外光（808 nm，0.5 W/cm²）照射該孔；將0.1 mL溶液全部轉移至另一96孔板中，通過酶標儀測量溶液在525 nm波長處吸光度（A）值，以5 min為間隔測量20 min，ROS總釋放量由各材料的A值得出。

1.6 材料的體外抗菌能力檢測

通過涂布平板法研究各材料對金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）的抗菌活性。細菌于37℃下在普通培養基（含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、15 g/mL瓊脂）中培養，然后稀釋至1×10⁷ CFU/mL用于后續實驗。取稀釋后的10 μL細菌懸液滴加在各材料上，模擬細菌在植入物表面附著。材料通過光照產生ROS和局部熱進行殺菌，因此分為光照組和黑暗組。黑暗組涂層在黑暗中放置20 min，光照組涂層采用808 nm近紅外光照射20 min。然后，將處理后的材料放入有1 mL普通培養基的離心管中稀釋并震蕩，將黏附于材料上的細菌剝離；然后將稀釋后的20 μL細菌溶液均勻涂抹在LB瓊脂平板上，于37℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察各材料黑暗和光照下的抑菌情況。以未接觸材料而直接稀釋至相同濃度的細菌作為對照組。按以下公式計算抗菌效率：抗菌效率=（CFU_對照?CFU_材料）/ CFU_對照×100%。

1.7 材料與基體結合力測試

將Ti-GO/Ag₃PO₄/CS置于含2 mL PBS溶液的離心管中，放在搖床中震蕩以模擬身體運動，搖床轉速120 r/min，12 h后取出材料在烘箱中烘干。浸泡前后分別行大體觀察和掃描電鏡觀察。

1.8 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行統計分析。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，多組間比較采用雙向ANOVA分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 材料的形貌物相

GO/Ag₃PO₄透射電鏡觀察示，GO為層片狀結構，粒徑為5～50 nm的Ag₃PO₄顆粒緊密貼合在GO層片狀結構上；GO/Ag₃PO₄高分辨率透射電鏡觀察示，Ag₃PO₄的晶格條紋在圖中被放大并作出標記，其中0.303 nm和0.190 nm晶格間距分別對應Ag₃PO₄的（200）和（310）晶格平面。見圖1a～c。

圖1 各材料形貌物相觀察

a. GO/Ag₃PO₄透射電鏡觀察（×100 k）；b. 圖a局部放大（×400 k）；c. GO/Ag₃PO₄ 高分辨率透射電鏡觀察（×4 000 k）　方框為局部放大的晶格條紋；d. Ti-GO/Ag₃PO₄/CS涂層掃描電鏡觀察（×5 000）　箭頭示Ag₃PO₄納米顆粒；e. Ti-GO/CS涂層掃描電鏡觀察（×5 000）；f. Ti-CS涂層掃描電鏡觀察（×5 000）；g. Ag₃PO₄和GO的XRD圖譜；h. Ti-GO/Ag₃PO₄/CS、Ti-GO/CS、Ti-CS和純Ti的XRD圖譜

Figure1. Morphology and phase observation of each material

a. Transmission electron microscope observation of GO/Ag₃PO₄(×100 k); b. Local magnification of figure a (×400 k); c. High resolution transmission electron microscope observation of GO/Ag₃PO₄(×4 000 k) Box indicated locally amplified lattice stripes; d. Scanning electron microscope observation of Ti-GO/Ag₃PO₄/CS coating (×5 000)　Arrows indicated Ag₃PO₄ nanoparticles; e. Scanning electron microscope observation of Ti-GO/CS coating (×5 000); f. Scanning electron microscope observation of Ti-CS coating (×5 000); g. XRD patterns of Ag₃PO₄ and GO; h. XRD patterns of Ti-GO/Ag₃PO₄/CS, Ti-GO/CS, Ti-CS, and pure Ti, respectively

圖選項

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《中國修復重建外科雜志》

優先發表近紅外光激發氧化石墨烯/磷酸銀/殼聚糖涂層改善鈦表面抗菌性能的研究

摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器

1.2 GO/Ag3PO4/CS涂層制備方法

1.3 材料的形貌物相觀察

1.4 材料的光熱性能檢測

1.5 材料的光催化性能檢測

1.6 材料的體外抗菌能力檢測

1.7 材料與基體結合力測試

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 材料的形貌物相

2.2 材料的光熱性能

2.3 材料的光催化性能

2.4 材料的體外抗菌能力

2.5 材料與基體結合力測試

3 討論

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器

1.2 GO/Ag3PO4/CS涂層制備方法

1.3 材料的形貌物相觀察

1.4 材料的光熱性能檢測

1.5 材料的光催化性能檢測

1.6 材料的體外抗菌能力檢測

1.7 材料與基體結合力測試

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 材料的形貌物相

2.2 材料的光熱性能

2.3 材料的光催化性能

2.4 材料的體外抗菌能力

2.5 材料與基體結合力測試

3 討論

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摘要全文圖表視頻參考文獻施引文獻補充材料

1.2 GO/Ag₃PO₄/CS涂層制備方法

1.2 GO/Ag₃PO₄/CS涂層制備方法