引用本文： 韋文, 張巖, 肖麗霞, 王濤, 周輝年. PDO和PDX模型在胰腺癌研究中的應用進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(6): 739-744. doi: 10.7507/1007-9424.202301015 復制
患者源性類器官（patient-derived organoid，PDO）模型，是從患者的活檢組織樣本中或干細胞的誘導中建立的體外模型，通過構建腫瘤生長微環境，可以在培養基中對患者源性組織進行定向培養[1]，能夠實現特定藥物測試和個體化治療方案的開發[2]。人源腫瘤異種移植（patient-derived tumor xenograft， PDX）模型，是將患者來源的腫瘤組織以組織的形式移植至免疫缺陷小鼠體內，很好的保持了腫瘤的異質性，因其并沒有經過任何人工培養，所以其生物學特性保持得更加完整，是現階段最優秀的腫瘤動物模型。
胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統腫瘤，總體5年生存率只有9%～10%[3]。其中，基因突變是胰腺癌發生的主要原因，主要的驅動基因包括KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4[4]。有研究[5]統計，在胰腺癌的高風險個體中，早期成像并沒有檢測到病變，在晚期才會出現特征性影像。非特異性癥狀和缺乏可早期診斷的檢查凸顯了提高胰腺癌臨床診療新策略的重要性[6]。PDO模型和PDX模型作為新型的腫瘤研究模型，可高度模擬原位組織的生理結構和功能，在胰腺癌研究及個體化用藥中發揮重要作用。筆者將深入探討如何具體在胰腺癌的轉化研究中應用PDO模型和PDX模型，以期為胰腺癌的轉化研究提供幫助。
1 PDO模型的研究歷史及最新進展
PDO是不同類型和功能細胞的有機結合體，接近體內細胞生存空間、生長狀態及功能表達。1946年Smith等[7]用類器官來描述囊性畸胎瘤，這是類器官的概念第一次進入大眾的視野。2009年有研究者[8]首次在實驗中引入了類器官技術，成功培養出依賴于干細胞培養的小鼠小腸細胞；隨后在2013年Huch等[9]從胰腺組織和其他小鼠和人類的胃腸道上皮組織中衍生出PDO模型。2015年，Clevers和Tuveson實驗室合作建立了人類胰腺癌的PDO模型[10]。在以后的發展中，人們逐漸發現了PDO高度相似的原器官，并可以代表原器官的某些特征。
因PDO具有和原發疾病類似的主要組織學和分子特征，故能夠使研究者在治療前期更好地觀察腫瘤的發展[11]。近年來，許多研究者通過PDO模型發展創新了多種研究與應用，如類器官芯片（organoids-on-a-chip） [12]、3D生物打印（3D-bioprinting of PDO） [13]、成簇有規律的間隔短回文重復序列及其相關蛋白9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats -associated protein 9， CRISPR-Cas9）介導的基因編輯、免疫治療（immunotherapy） [14]等。研究人員利用慢病毒轉基因、CRISPR/Cas9基因編輯、單細胞讀取等強大的方法來研究基因功能，并在類器官中進行遺傳篩選[15]或修改類器官構建模塊[16] 。
CRISPER-Cas9基因編輯技術是最早發現[17]且目前最常用的一種基因編輯手段，被廣泛應用于動物、植物和微生物DNA的精準編輯[18]。CRISPR-Cas9基因組編輯能夠破壞目標基因，慢病毒利用自身將基因組整合到宿主基因組的能力[19]，二者共同推動了PDO模型基因編輯技術的發展。Heitink等[20]利用被Cas9系統和模型小鼠全基因組慢病毒文庫共同感染的細胞，揭示了誘發乳腺腫瘤發生的腫瘤抑制基因之間的關系。現階段有關胰腺PDO基因編輯的研究仍較有限，如何建立胰腺癌PDO模型以及其基因編輯的探索仍有待研究。
2 PDX模型的研究歷史及最新進展
PDX模型，是將來源于患者的腫瘤組織或原代細胞植入免疫缺陷小鼠體內形成的移植瘤模型。相較于傳統的細胞系移植模型（cell-derived xenograft，CDX），PDX模型未經過體外培養，較好地保持了原發腫瘤的遺傳特性和異質性，如Etsuko Fujiituan團隊建立結腸腺癌PDX模型時連續移植3代，成功地恢復了原始組織的病理特征[21]。PDX模型可以說是現階段最優秀的腫瘤動物模型。目前，PDX的研究方向多為藥物耐藥機制研究[22]、腫瘤免疫治療[23]、腫瘤生物標志物的識別和定量[24]、篩選生物標志物和藥物靶點等[25]。
盡管PDX模型有諸多優勢，但仍存在某些局限性。Gendoo等[26]在做類器官胰腺癌模型全基因組研究中發現，胰腺導管細胞的PDX模型會產生多倍體的存在，而這些多倍體理論上需要被消除。有一些腫瘤組織在傳代過程中發生突變導致培養出的PDX模型產生差異[27]。即使成功建立了PDX模型，在研究過程中還需要監測PDX腫瘤生長和治療反應的能力。一些監測的儀器如計算機斷層掃描、磁共振成像和正電子發射斷層掃描，可對腫瘤解剖、血管化和代謝活動進行詳細評估，這些研究昂貴且耗時，限制了其在臨床環境中的廣泛使用[28]。另一方面，在連續傳代過程中，人類基質逐漸被小鼠基質取代，導致腫瘤的特殊調節機制以及諸如間質液壓力等物理特性的改變，從而擾亂腫瘤微環境，使得相關藥物的研究存在較大的誤差[29]。因此，PDX模型的建立和研究需要研究者投入大量的人力、物力和財力。
3 胰腺癌臨床前研究模型的選擇
3.1 胰腺癌中PDO模型的應用
胰腺癌可分為經典型、準間質型和內分泌型[30]，最新研究表明又有一類患者的胰腺癌細胞可歸類為免疫原性型[28]。胰腺癌PDO模型的建立可以取患者組織中的干細胞進行分化培養[31]，也可以直接取來自于患者腫瘤活檢組織中的細胞，再加以誘導，就能得到和原發灶類似的PDO。胰腺癌PDO模型能夠聚焦胰腺細胞、細胞內蛋白質表達、腫瘤基因等細胞層次的研究，目前有以下幾種應用研究。
3.1.1 蛋白質表達，蛋白標志物的檢測
通過監測不同階段蛋白標志物的表達水平，能夠研究胰腺癌蛋白的表達情況。Rittmann等[32]通過建立PDO模型來預測胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）切除后早期復發的血漿蛋白生物標志物； Meng等[33]用患者外周血中的T細胞刺激自體腫瘤類器官2周，生成類器官啟動的T（opT）細胞，監測28種細胞表面和檢查點蛋白表達水平的變化來分析opT細胞表型，確定了NKG2A-HLA-E軸是CD8+ T細胞在胰腺癌中的一個潛在的重要檢查點。
3.1.2 研究細胞間、細胞因子間相互作用的機理
因PDO是不同類型和功能細胞的有機結合體，故可利用PDO模型研究胰腺癌微環境中細胞間和多細胞間相互作用的方法。如研究胰腺癌微環境（tumor microenvironment，TME）的生理特征，識別多種細胞類型之間的通信機制[34]等。Sándor等[35]通過使用患者衍生的類器官獲得上皮組織的細胞異質性，研究了多個組織中產生Wnt的微細胞和細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）分泌之間的聯系，表明Wnt活性和細胞增殖在多種正常組織類型中與EV釋放耦合。利用PDO模型還能夠確定人體組織中信號的轉錄靶點[36]。
3.1.3 進行細胞毒性測試和藥物分子機制研究
在體外進行培養的PDO在研究過程中既具有原發腫瘤特點，又不會對患者產生實質性傷害，故可作為平臺篩選溶瘤腺病毒（oncolytic adenovirus，OAds）的選擇性和效力的能力[37]。Palzer等[38]對Mia PaCa-2和PANC-1細胞以及患者切除組織產生的PDAC 3D類器官培養物進行磁脂質體（magnetic liposomes，ML）細胞毒性測試，證明了改變ML設置可以解決細胞內和ML位置的差異。
通過將PDO的分子分析和治療分析相結合，可以預測臨床反應并實現前瞻性治療選擇，如將其用作確定胰腺癌化療的常見反應，評估化療對患者的影響[39]。Demyan等[40]收集了117例胰腺癌患者的136個樣本，證明了快速PDO藥物篩查的可行性。另有研究者將PDAC類器官與腫瘤相關成纖維細胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）共培養，發現PDAC類器官的增殖增加，化療誘導的細胞死亡減少，證明了胰腺癌PDO模型不僅可以用于藥物反應譜分析，還可以用于闡明腫瘤基質的耐藥支持作用的分子機制[41]。
3.1.4 研究腫瘤的發生發展
PDO模型具有患者腫瘤組織的組織特征，其清晰、可觀和可操作的特性為研究胰腺癌的發生發展提供了很好的條件。Merkle等[42]對攜帶一種致病的CDKN2A變體的兩兄妹的角質形成細胞進行了基因編輯，發現PDO模型通過進行特異性癌基因表達和全外顯子組能夠分析胰腺腫瘤不同發展路徑的病理生理機制。而另一項研究[43]表明，可以利用PDO模型進行全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）檢測突變變異體。Krieger等[44]也通過對PDAC類器官和原發性PDAC的單細胞轉錄組分析，證明PDO模型能夠清楚看到腫瘤細胞不同時期的狀態。此外，有研究者[45]在研究胰腺癌中引入微生物，通過PDO與TME微生物群的共培養，進一步研究了PDAC-癌干細胞（pancreatic ductal adenocarcinoma associated Cancer stem cells，CSCsPDAC-CSC），完善對PDAC的研究。
除了以上應用，PDO模型也可與PDX模型聯合使用。Dantes等[46]為了證明PDO的腫瘤起始能力（tumor-initiating capacity），將建立好的PDO原位移植到無胸腺裸鼠中，以生成PDX。移植后50 d，蘇木精和伊紅染色顯示多灶性導管樣形成，具有單個到多層多形性細胞，原位腫瘤形成可觀察到實體或囊性形態，說明PDO已成功植入，并具有良好的腫瘤起始能力。
盡管胰腺癌PDO模型在胰腺癌精準治療方面具有很大優勢，但仍有許多方面有待完善和發展。例如，因其在培養皿中培養的緣故，所培養的PDO往往缺乏毛細血管網，使得研究者在培養過程中針對患者源性腫瘤組織對營養的攝取吸收格外關注；免疫細胞和神經元的缺乏[47]也是胰腺癌PDO建模過程中一個重要的問題。同時，由于個體化治療的要求，若對不同病因的胰腺癌使用一致的培養方法，在持續培養過程中則可能會不利于其同等有效的生長，甚至會喪失胰腺癌PDO模型的異質性，從而失去培養價值。
3.2 胰腺癌中PDX模型的應用
建立胰腺癌PDX模型，一般方法是手術獲取患者的腫瘤組織之后，將患者的組織標本剪碎成碎片接種入小鼠體內，根據實驗目的可選取原位接種、皮下接種、腋下接種等接種方式。建模成功后，待腫瘤長至直徑約1～2 cm 時，將腫瘤組織從第1代小鼠轉移到第2代小鼠進行傳代，以此類推。建立模型常用的小鼠為免疫缺陷小鼠，如裸鼠、NOD-SCID小鼠等。也可以通過引入特定的致癌基因突變、滅活抑癌基因對小鼠進行基因修飾建立胰腺癌基因工程小鼠模型。如PDAC是一種分子異質性疾病，其特征是大部分患者具有4種常見的遺傳改變，包括致癌性KRAS突變和腫瘤抑制因子CDKN2A、TP53和SMAD4的失活[48]。通過一定的基因編輯方法改變某一基因，就可復制PDAC的PDO模型。
PDX模型成功率一般與腫瘤侵襲性、組織學類型、植入組織大小和植入部位有關[49]。皮下胰腺癌PDX模型的植入成功率明顯高于原位胰腺、腹膜和肝臟PDX模型[50]。研究[51]表明，PDX模型在胰腺導管癌中的成功植入率為55.8%，其成功建立與腫瘤大小有關。一般來說，PDX模型從接種到收獲需要2～4個月的時間，超過6個月的非腫瘤被視為植入失敗[52]。建立胰腺癌PDX模型，大致有以下幾個方面的用途。
3.2.1 臨床前藥物測試
在胰腺癌患者中，研究人員可以使用手術樣本為胰腺癌（pancreatic cancer，PC）患者建立患者源性PDX模型，一旦患者復發和轉移，可以用PDX模型同時測試所有化療藥物和靶向藥物對PC的敏感性，甚至可以在PDX模型中測試其他腫瘤藥物，根據測試結果選擇合適的處理方法。此外，如果所選藥物在使用過程中表現出二次耐藥，便可通過PDX模型小鼠的耐藥模型重新選擇藥物或通過重新活檢建立新的模型。Saenz等[53]通過先建立PDX模型，再將小鼠PDX腫瘤塊分離出單個細胞在培養皿中培養的方法，利用PDX小鼠模型口服含有維甲酸相關孤兒受體γt（retinoic acid-related orphangammat， RORγt）抑制劑的咪唑等藥物，檢驗證明了小分子變構抑制劑阻斷Th17依賴性炎癥和精氨基琥珀酸合成酶（argininosuccinate synthetase，ASS）相關基因在體內的表達。Tu等[54]發現，PC發生時胰腺中的microRNA-1291（miR-1291）下調，同時miR-1291修復抑制PC細胞的腫瘤發生，為此，他們從臨床胰腺癌樣本中建立了3個PDX模型，評估miR-1291前藥療法，發現在小鼠PDX模型中miR-1291前藥療法可更廣泛和最大程度地降低胰腺癌腫瘤生長（70%～90%）。韓品盛等[55]通過建立PDX模型，設置模型組、吉西他濱+白蛋白結合型紫杉醇（AG）組和奧沙利鉑+亞葉酸鈣+5-氟尿嘧啶（FOLFOX）組，以評價兩種化療方案對胰腺癌PDX模型的腫瘤抑制效果。
3.2.2 腫瘤發生機制的研究
因PDX模型能高度模擬腫瘤在活體組織中的發生發展，故可以為研究腫瘤的發生機制提供可能。PDX模型能夠再現患者癌癥的基因型和表型[56]。Giraud等[57]在免疫缺陷小鼠中建立PDX模型，證實了一種罕見的干細胞亞群的存在，而這種干細胞是腫瘤起始、生長和化療耐藥性的起源，有助于推進研究并改善臨床管理。另有研究者[58]將活檢來源的早期傳代類器官在免疫缺陷小鼠中接種，產生了皮下腫瘤，研究者發現，異種移植瘤在組織學上與原始腫瘤相似，并能夠產生無限增殖的類器官，具有鮮明的特征和高水平的胰蛋白酶分泌。基于此，研究者發現補充了新的胰腺腺泡細胞癌（pancreatic acinar cell carcinoma，PACC）細胞系，對以后的ACC研究進行了補充和完善[59]。
3.2.3 藥物靶點的發現與藥物分子治療機制研究
吉西他濱最常用于胰腺癌的治療。Yang等[60]建立了66例患者源性異種移植物（PDX模型），并用吉西他濱治療，前后生成了15個藥物敏感和13個耐藥PDX模型的多組學數據探索吉西他濱耐藥性的分子特征，系統地研究了胰腺癌化療耐藥的預測標志物和分子機制，并為克服吉西他濱耐藥提供了潛在的治療靶點。除研究藥物靶點和分子治療機制外，PDX模型還能夠應用于藥物分子路徑的完善，反映人類腫瘤分子多樣性[61]。
近年來，PDX模型中免疫重建問題逐漸成為熱點研究問題。在建立胰腺癌PDX模型過程中也并不例外。通過將人源性免疫細胞與腫瘤組織同時植入重度免疫缺陷小鼠體內，就可獲得異質性和免疫微環境與患者相似的免疫和腫瘤雙人源化模型。目前常用的免疫重建方案有人源淋巴細胞（human perihperal blood lymphocyte，Hu-PBL）或 CD34 陽性人源造血干細胞（human hematopoietic stem cell，Hu-HSC）移植、人源化基因改造等[23]。如將Hu-HSC移植入新生免疫缺陷小鼠體內，構建出的多譜系人源化免疫重建模型（簡稱 Hu-HSC 模型）可以使人源化免疫在小鼠體內穩定保持12周以上。這種免疫重建的PDX模型不僅能夠模擬腫瘤在患者體內的生長過程，還可以重現腫瘤與免疫系統之間的相互作用。
4 總結
基于動物實驗倫理的問題，類器官和器官芯片的應用將成為主流趨勢，而PDO模型和PDX模型會作為其中首選的模型被廣泛應用。對于需要個性化用藥和研究的胰腺癌疾病，研究者在面臨選擇使用PDO模型還是PDX模型時，可適時考慮：如需進行基礎理論研究和藥物作用機制研究時，選擇胰腺癌PDO模型更為清楚有效；如需觀測研究細胞層次以上即組織、器官、機體等的反應或藥物療效等，則選擇PDX模型能更好地模擬體內過程。
目前PDO模型建立時缺乏毛細血管網、免疫細胞、神經元等問題限制了其發展，而PDX模型昂貴且耗時也是當下需要解決的主要問題。這些“瓶頸”還需要大量的研究去探索和突破。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：韋文負責查閱文獻、設計選題及撰寫文稿；張巖、肖麗霞和王濤負責整理文獻；周輝年負責選題設計和論文審閱。
患者源性類器官（patient-derived organoid，PDO）模型，是從患者的活檢組織樣本中或干細胞的誘導中建立的體外模型，通過構建腫瘤生長微環境，可以在培養基中對患者源性組織進行定向培養[1]，能夠實現特定藥物測試和個體化治療方案的開發[2]。人源腫瘤異種移植（patient-derived tumor xenograft， PDX）模型，是將患者來源的腫瘤組織以組織的形式移植至免疫缺陷小鼠體內，很好的保持了腫瘤的異質性，因其并沒有經過任何人工培養，所以其生物學特性保持得更加完整，是現階段最優秀的腫瘤動物模型。
胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統腫瘤，總體5年生存率只有9%～10%[3]。其中，基因突變是胰腺癌發生的主要原因，主要的驅動基因包括KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4[4]。有研究[5]統計，在胰腺癌的高風險個體中，早期成像并沒有檢測到病變，在晚期才會出現特征性影像。非特異性癥狀和缺乏可早期診斷的檢查凸顯了提高胰腺癌臨床診療新策略的重要性[6]。PDO模型和PDX模型作為新型的腫瘤研究模型，可高度模擬原位組織的生理結構和功能，在胰腺癌研究及個體化用藥中發揮重要作用。筆者將深入探討如何具體在胰腺癌的轉化研究中應用PDO模型和PDX模型，以期為胰腺癌的轉化研究提供幫助。
1 PDO模型的研究歷史及最新進展
PDO是不同類型和功能細胞的有機結合體，接近體內細胞生存空間、生長狀態及功能表達。1946年Smith等[7]用類器官來描述囊性畸胎瘤，這是類器官的概念第一次進入大眾的視野。2009年有研究者[8]首次在實驗中引入了類器官技術，成功培養出依賴于干細胞培養的小鼠小腸細胞；隨后在2013年Huch等[9]從胰腺組織和其他小鼠和人類的胃腸道上皮組織中衍生出PDO模型。2015年，Clevers和Tuveson實驗室合作建立了人類胰腺癌的PDO模型[10]。在以后的發展中，人們逐漸發現了PDO高度相似的原器官，并可以代表原器官的某些特征。
因PDO具有和原發疾病類似的主要組織學和分子特征，故能夠使研究者在治療前期更好地觀察腫瘤的發展[11]。近年來，許多研究者通過PDO模型發展創新了多種研究與應用，如類器官芯片（organoids-on-a-chip） [12]、3D生物打印（3D-bioprinting of PDO） [13]、成簇有規律的間隔短回文重復序列及其相關蛋白9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats -associated protein 9， CRISPR-Cas9）介導的基因編輯、免疫治療（immunotherapy） [14]等。研究人員利用慢病毒轉基因、CRISPR/Cas9基因編輯、單細胞讀取等強大的方法來研究基因功能，并在類器官中進行遺傳篩選[15]或修改類器官構建模塊[16] 。
CRISPER-Cas9基因編輯技術是最早發現[17]且目前最常用的一種基因編輯手段，被廣泛應用于動物、植物和微生物DNA的精準編輯[18]。CRISPR-Cas9基因組編輯能夠破壞目標基因，慢病毒利用自身將基因組整合到宿主基因組的能力[19]，二者共同推動了PDO模型基因編輯技術的發展。Heitink等[20]利用被Cas9系統和模型小鼠全基因組慢病毒文庫共同感染的細胞，揭示了誘發乳腺腫瘤發生的腫瘤抑制基因之間的關系。現階段有關胰腺PDO基因編輯的研究仍較有限，如何建立胰腺癌PDO模型以及其基因編輯的探索仍有待研究。
2 PDX模型的研究歷史及最新進展
PDX模型，是將來源于患者的腫瘤組織或原代細胞植入免疫缺陷小鼠體內形成的移植瘤模型。相較于傳統的細胞系移植模型（cell-derived xenograft，CDX），PDX模型未經過體外培養，較好地保持了原發腫瘤的遺傳特性和異質性，如Etsuko Fujiituan團隊建立結腸腺癌PDX模型時連續移植3代，成功地恢復了原始組織的病理特征[21]。PDX模型可以說是現階段最優秀的腫瘤動物模型。目前，PDX的研究方向多為藥物耐藥機制研究[22]、腫瘤免疫治療[23]、腫瘤生物標志物的識別和定量[24]、篩選生物標志物和藥物靶點等[25]。
盡管PDX模型有諸多優勢，但仍存在某些局限性。Gendoo等[26]在做類器官胰腺癌模型全基因組研究中發現，胰腺導管細胞的PDX模型會產生多倍體的存在，而這些多倍體理論上需要被消除。有一些腫瘤組織在傳代過程中發生突變導致培養出的PDX模型產生差異[27]。即使成功建立了PDX模型，在研究過程中還需要監測PDX腫瘤生長和治療反應的能力。一些監測的儀器如計算機斷層掃描、磁共振成像和正電子發射斷層掃描，可對腫瘤解剖、血管化和代謝活動進行詳細評估，這些研究昂貴且耗時，限制了其在臨床環境中的廣泛使用[28]。另一方面，在連續傳代過程中，人類基質逐漸被小鼠基質取代，導致腫瘤的特殊調節機制以及諸如間質液壓力等物理特性的改變，從而擾亂腫瘤微環境，使得相關藥物的研究存在較大的誤差[29]。因此，PDX模型的建立和研究需要研究者投入大量的人力、物力和財力。
3 胰腺癌臨床前研究模型的選擇
3.1 胰腺癌中PDO模型的應用
胰腺癌可分為經典型、準間質型和內分泌型[30]，最新研究表明又有一類患者的胰腺癌細胞可歸類為免疫原性型[28]。胰腺癌PDO模型的建立可以取患者組織中的干細胞進行分化培養[31]，也可以直接取來自于患者腫瘤活檢組織中的細胞，再加以誘導，就能得到和原發灶類似的PDO。胰腺癌PDO模型能夠聚焦胰腺細胞、細胞內蛋白質表達、腫瘤基因等細胞層次的研究，目前有以下幾種應用研究。
3.1.1 蛋白質表達，蛋白標志物的檢測
通過監測不同階段蛋白標志物的表達水平，能夠研究胰腺癌蛋白的表達情況。Rittmann等[32]通過建立PDO模型來預測胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）切除后早期復發的血漿蛋白生物標志物； Meng等[33]用患者外周血中的T細胞刺激自體腫瘤類器官2周，生成類器官啟動的T（opT）細胞，監測28種細胞表面和檢查點蛋白表達水平的變化來分析opT細胞表型，確定了NKG2A-HLA-E軸是CD8+ T細胞在胰腺癌中的一個潛在的重要檢查點。
3.1.2 研究細胞間、細胞因子間相互作用的機理
因PDO是不同類型和功能細胞的有機結合體，故可利用PDO模型研究胰腺癌微環境中細胞間和多細胞間相互作用的方法。如研究胰腺癌微環境（tumor microenvironment，TME）的生理特征，識別多種細胞類型之間的通信機制[34]等。Sándor等[35]通過使用患者衍生的類器官獲得上皮組織的細胞異質性，研究了多個組織中產生Wnt的微細胞和細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）分泌之間的聯系，表明Wnt活性和細胞增殖在多種正常組織類型中與EV釋放耦合。利用PDO模型還能夠確定人體組織中信號的轉錄靶點[36]。
3.1.3 進行細胞毒性測試和藥物分子機制研究
在體外進行培養的PDO在研究過程中既具有原發腫瘤特點，又不會對患者產生實質性傷害，故可作為平臺篩選溶瘤腺病毒（oncolytic adenovirus，OAds）的選擇性和效力的能力[37]。Palzer等[38]對Mia PaCa-2和PANC-1細胞以及患者切除組織產生的PDAC 3D類器官培養物進行磁脂質體（magnetic liposomes，ML）細胞毒性測試，證明了改變ML設置可以解決細胞內和ML位置的差異。
通過將PDO的分子分析和治療分析相結合，可以預測臨床反應并實現前瞻性治療選擇，如將其用作確定胰腺癌化療的常見反應，評估化療對患者的影響[39]。Demyan等[40]收集了117例胰腺癌患者的136個樣本，證明了快速PDO藥物篩查的可行性。另有研究者將PDAC類器官與腫瘤相關成纖維細胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）共培養，發現PDAC類器官的增殖增加，化療誘導的細胞死亡減少，證明了胰腺癌PDO模型不僅可以用于藥物反應譜分析，還可以用于闡明腫瘤基質的耐藥支持作用的分子機制[41]。
3.1.4 研究腫瘤的發生發展
PDO模型具有患者腫瘤組織的組織特征，其清晰、可觀和可操作的特性為研究胰腺癌的發生發展提供了很好的條件。Merkle等[42]對攜帶一種致病的CDKN2A變體的兩兄妹的角質形成細胞進行了基因編輯，發現PDO模型通過進行特異性癌基因表達和全外顯子組能夠分析胰腺腫瘤不同發展路徑的病理生理機制。而另一項研究[43]表明，可以利用PDO模型進行全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）檢測突變變異體。Krieger等[44]也通過對PDAC類器官和原發性PDAC的單細胞轉錄組分析，證明PDO模型能夠清楚看到腫瘤細胞不同時期的狀態。此外，有研究者[45]在研究胰腺癌中引入微生物，通過PDO與TME微生物群的共培養，進一步研究了PDAC-癌干細胞（pancreatic ductal adenocarcinoma associated Cancer stem cells，CSCsPDAC-CSC），完善對PDAC的研究。
除了以上應用，PDO模型也可與PDX模型聯合使用。Dantes等[46]為了證明PDO的腫瘤起始能力（tumor-initiating capacity），將建立好的PDO原位移植到無胸腺裸鼠中，以生成PDX。移植后50 d，蘇木精和伊紅染色顯示多灶性導管樣形成，具有單個到多層多形性細胞，原位腫瘤形成可觀察到實體或囊性形態，說明PDO已成功植入，并具有良好的腫瘤起始能力。
盡管胰腺癌PDO模型在胰腺癌精準治療方面具有很大優勢，但仍有許多方面有待完善和發展。例如，因其在培養皿中培養的緣故，所培養的PDO往往缺乏毛細血管網，使得研究者在培養過程中針對患者源性腫瘤組織對營養的攝取吸收格外關注；免疫細胞和神經元的缺乏[47]也是胰腺癌PDO建模過程中一個重要的問題。同時，由于個體化治療的要求，若對不同病因的胰腺癌使用一致的培養方法，在持續培養過程中則可能會不利于其同等有效的生長，甚至會喪失胰腺癌PDO模型的異質性，從而失去培養價值。
3.2 胰腺癌中PDX模型的應用
建立胰腺癌PDX模型，一般方法是手術獲取患者的腫瘤組織之后，將患者的組織標本剪碎成碎片接種入小鼠體內，根據實驗目的可選取原位接種、皮下接種、腋下接種等接種方式。建模成功后，待腫瘤長至直徑約1～2 cm 時，將腫瘤組織從第1代小鼠轉移到第2代小鼠進行傳代，以此類推。建立模型常用的小鼠為免疫缺陷小鼠，如裸鼠、NOD-SCID小鼠等。也可以通過引入特定的致癌基因突變、滅活抑癌基因對小鼠進行基因修飾建立胰腺癌基因工程小鼠模型。如PDAC是一種分子異質性疾病，其特征是大部分患者具有4種常見的遺傳改變，包括致癌性KRAS突變和腫瘤抑制因子CDKN2A、TP53和SMAD4的失活[48]。通過一定的基因編輯方法改變某一基因，就可復制PDAC的PDO模型。
PDX模型成功率一般與腫瘤侵襲性、組織學類型、植入組織大小和植入部位有關[49]。皮下胰腺癌PDX模型的植入成功率明顯高于原位胰腺、腹膜和肝臟PDX模型[50]。研究[51]表明，PDX模型在胰腺導管癌中的成功植入率為55.8%，其成功建立與腫瘤大小有關。一般來說，PDX模型從接種到收獲需要2～4個月的時間，超過6個月的非腫瘤被視為植入失敗[52]。建立胰腺癌PDX模型，大致有以下幾個方面的用途。
3.2.1 臨床前藥物測試
在胰腺癌患者中，研究人員可以使用手術樣本為胰腺癌（pancreatic cancer，PC）患者建立患者源性PDX模型，一旦患者復發和轉移，可以用PDX模型同時測試所有化療藥物和靶向藥物對PC的敏感性，甚至可以在PDX模型中測試其他腫瘤藥物，根據測試結果選擇合適的處理方法。此外，如果所選藥物在使用過程中表現出二次耐藥，便可通過PDX模型小鼠的耐藥模型重新選擇藥物或通過重新活檢建立新的模型。Saenz等[53]通過先建立PDX模型，再將小鼠PDX腫瘤塊分離出單個細胞在培養皿中培養的方法，利用PDX小鼠模型口服含有維甲酸相關孤兒受體γt（retinoic acid-related orphangammat， RORγt）抑制劑的咪唑等藥物，檢驗證明了小分子變構抑制劑阻斷Th17依賴性炎癥和精氨基琥珀酸合成酶（argininosuccinate synthetase，ASS）相關基因在體內的表達。Tu等[54]發現，PC發生時胰腺中的microRNA-1291（miR-1291）下調，同時miR-1291修復抑制PC細胞的腫瘤發生，為此，他們從臨床胰腺癌樣本中建立了3個PDX模型，評估miR-1291前藥療法，發現在小鼠PDX模型中miR-1291前藥療法可更廣泛和最大程度地降低胰腺癌腫瘤生長（70%～90%）。韓品盛等[55]通過建立PDX模型，設置模型組、吉西他濱+白蛋白結合型紫杉醇（AG）組和奧沙利鉑+亞葉酸鈣+5-氟尿嘧啶（FOLFOX）組，以評價兩種化療方案對胰腺癌PDX模型的腫瘤抑制效果。
3.2.2 腫瘤發生機制的研究
因PDX模型能高度模擬腫瘤在活體組織中的發生發展，故可以為研究腫瘤的發生機制提供可能。PDX模型能夠再現患者癌癥的基因型和表型[56]。Giraud等[57]在免疫缺陷小鼠中建立PDX模型，證實了一種罕見的干細胞亞群的存在，而這種干細胞是腫瘤起始、生長和化療耐藥性的起源，有助于推進研究并改善臨床管理。另有研究者[58]將活檢來源的早期傳代類器官在免疫缺陷小鼠中接種，產生了皮下腫瘤，研究者發現，異種移植瘤在組織學上與原始腫瘤相似，并能夠產生無限增殖的類器官，具有鮮明的特征和高水平的胰蛋白酶分泌。基于此，研究者發現補充了新的胰腺腺泡細胞癌（pancreatic acinar cell carcinoma，PACC）細胞系，對以后的ACC研究進行了補充和完善[59]。
3.2.3 藥物靶點的發現與藥物分子治療機制研究
吉西他濱最常用于胰腺癌的治療。Yang等[60]建立了66例患者源性異種移植物（PDX模型），并用吉西他濱治療，前后生成了15個藥物敏感和13個耐藥PDX模型的多組學數據探索吉西他濱耐藥性的分子特征，系統地研究了胰腺癌化療耐藥的預測標志物和分子機制，并為克服吉西他濱耐藥提供了潛在的治療靶點。除研究藥物靶點和分子治療機制外，PDX模型還能夠應用于藥物分子路徑的完善，反映人類腫瘤分子多樣性[61]。
近年來，PDX模型中免疫重建問題逐漸成為熱點研究問題。在建立胰腺癌PDX模型過程中也并不例外。通過將人源性免疫細胞與腫瘤組織同時植入重度免疫缺陷小鼠體內，就可獲得異質性和免疫微環境與患者相似的免疫和腫瘤雙人源化模型。目前常用的免疫重建方案有人源淋巴細胞（human perihperal blood lymphocyte，Hu-PBL）或 CD34 陽性人源造血干細胞（human hematopoietic stem cell，Hu-HSC）移植、人源化基因改造等[23]。如將Hu-HSC移植入新生免疫缺陷小鼠體內，構建出的多譜系人源化免疫重建模型（簡稱 Hu-HSC 模型）可以使人源化免疫在小鼠體內穩定保持12周以上。這種免疫重建的PDX模型不僅能夠模擬腫瘤在患者體內的生長過程，還可以重現腫瘤與免疫系統之間的相互作用。
4 總結
基于動物實驗倫理的問題，類器官和器官芯片的應用將成為主流趨勢，而PDO模型和PDX模型會作為其中首選的模型被廣泛應用。對于需要個性化用藥和研究的胰腺癌疾病，研究者在面臨選擇使用PDO模型還是PDX模型時，可適時考慮：如需進行基礎理論研究和藥物作用機制研究時，選擇胰腺癌PDO模型更為清楚有效；如需觀測研究細胞層次以上即組織、器官、機體等的反應或藥物療效等，則選擇PDX模型能更好地模擬體內過程。
目前PDO模型建立時缺乏毛細血管網、免疫細胞、神經元等問題限制了其發展，而PDX模型昂貴且耗時也是當下需要解決的主要問題。這些“瓶頸”還需要大量的研究去探索和突破。
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