引用本文： 孟文, 劉朝暉, 范偉, 梁志科, 蔡廣平. 蛋白酶體抑制劑MG-132對脂多糖致急性肺損傷大鼠的抗炎作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2014, 13(4): 370-373. doi: 10.7507/1671-6205.2014090 復制
急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)是指由心源性以外的各種如感染、創傷、休克等肺內、外致病因素所致的急性、進行性缺氧性呼吸衰竭[1]。ALI/ARDS是一種常見的臨床危重病癥，有較高的患病率和死亡率[2]。蛋白酶體抑制劑MG-132是一種醛基肽類蛋白酶體抑制劑，能抑制NF-κB抑制蛋白(IκB)的降解，而下調核因子κB(NF-κB)的表達，減少機體的炎癥反應[3]。本實驗使用蛋白酶體抑制劑MG-132來觀察其對內毒素性大鼠急性肺損傷后細胞間粘附分子1(ICAM-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、NF-κB P65表達的影響，進一步探討MG-132對內毒素性肺損傷后NF-κB信號通路和炎癥反應的影響及其機制。
對象與方法
一 材料
1．實驗動物：清潔級成年雄性SD大鼠54只，由南方醫科大學動物實驗中心提供，體質量240~270 g。
2．主要試劑：脂多糖(LPS，美國sigma公司)；MG-132(美國Calbiochem公司)；ICAM-1、TNF-α ELISA試劑盒(均購于上海研吉生物公司)；大鼠NF-κB P65抗體(美國Cell Signaling公司)。
二 方法
1．動物分組與造模：健康清潔級成年雄性SD大鼠54只，按隨機數字表法分為對照組、ALI組和MG-132組，每組18只。參照文獻[4]的方法經尾靜脈注射LPS 5 mg/kg制備大鼠急性肺損傷模型。對照組尾靜脈注入生理鹽水，ALI組和MG-132組尾靜脈注射LPS 5 mg/kg，MG-132組于實驗前30 min腹腔注射MG-132 10 mg/kg。
2．標本采集：3組大鼠在注射生理鹽水或LPS后2、4、8 h各隨機處死6只。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，心臟穿刺抽血處死大鼠，打開胸腔，取肺組織。結扎右肺門，經氣管插入一次性靜脈輸液導管并固定，將7.5 mL無菌PBS分3次灌洗左肺，回收支氣管肺泡灌洗液(BALF)。將BALF 4 ℃ 1 200 r/min離心10 min，上清液轉移到離心管至于-80 ℃超低溫冰箱中備測。同時分離出右肺組織。
3．病理檢查：取右肺上葉，用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，常規蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理學變化。
4．肺組織濕/干重比值(W/D)檢測：取大鼠右肺中葉，用濾紙吸干表面的血跡，稱肺濕質量，然后置于75 ℃恒溫干燥箱烘烤48 h至恒重，稱肺干質量。肺濕質量與干質量的比值即W/D。
5．BALF中ICAM-1、TNF-α的檢測：ELISA法測BALF中ICAM-1、TNF-α水平，方法嚴格按產品說明書進行。
6．Western blot法測定肺組織NF-κB P65蛋白的表達：取右肺下葉，迅速凍存于液氮中以備勻漿。參照文獻[5]中介紹的方法，提取肺組織的胞核蛋白。用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，定量后-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。取50 μg樣品蛋白，加人5×SDS加樣緩沖液，100 ℃沸水浴中6 min使蛋白變性，進行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后，加一抗(NF-κB P65一抗濃度為1∶1 000，β-actin濃度為1∶1 000)，4 ℃過夜，棄一抗，洗膜3次，加相應二抗，室溫孵育1 h，洗膜3次，ECL顯影，用BIORAD凝膠成像分析系統拍照并進行圖像分析，實驗重復3次，取平均值，計算目的蛋白的相對表達量(目的蛋白的相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參β-actin條帶灰度值)。
三 統計學處理
采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學處理。計量資料以
結果
一 各組大鼠病理特點
各組大鼠肺大體及光鏡下觀察，對照組大鼠肺組織表面光滑，呈均勻淡粉紅色，表面未見病損灶，無充血、水腫；光鏡下肺間質及肺泡無充血、水腫、炎癥等改變。ALI組大鼠肺組織呈暗紅色，肺充血、水腫明顯，肺組織體積增大，并隨觀察時間的延長肺充血、水腫更加明顯；光鏡下可見肺泡間隔增寬，肺灶性出血，肺泡和肺間質水腫，肺泡腔明顯變狹窄，大量炎性細胞浸潤。MG-132組大鼠造模后肺組織可見充血、水腫，體積與ALI組比較變化不大；光鏡下可見炎性細胞浸潤較模型組減輕。結果見圖 1。
圖1
各組大鼠肺組織病理學變化(HE× 100) a．對照組；b．ALI組；c．MG-132組
二 大鼠肺組織W/D比值情況
對照組大鼠W/D比值在3個時間點變化不顯著，差異無統計學意義。ALI組與對照組比較，各觀察時間點肺組織W/D比值均明顯升高(P＜0.05)。MG-132組各觀察時間點肺組織W/D比值較ALI組明顯降低，但高于對照組(P＜0.05)。結果見表 1。
表1
各時間點三組大鼠肺組織W/D(n=6，三 大鼠BALF中ICAM-1、TNF-α水平
與對照組比較，ALI組、MG-132組BALF中ICAM-1、TNF-α含量在各觀察時間點均明顯升高(P＜0.05)，并隨著觀察時間的延長有升高的趨勢；MG-132組各觀察時間點BALF中ICAM-1、TNF-α含量均較ALI組降低(P＜0.05)。結果見表 2。
表2
各時間點三組大鼠BALF 中ICAM-1、TNF-α的表達(n=6，n=50，四 肺組織NF-κB P65蛋白的表達
各觀察時間點ALI組、MG-132組肺組織NF-κB P65蛋白的相對表達量較對照組升高(P＜0.05)；MG-132組肺組織NF-κB P65蛋白的相對表達量較ALI組降低(P＜0.05)。結果見圖 2、表 3。
圖2
各時間點三組大鼠肺組織NF-κB P65蛋白的表達
表3
各時間點三組大鼠肺組織NF-κB P65蛋白的相對表達量(n=6，五 相關性分析
三組大鼠肺組織NF-κB P65蛋白的表達與ICAM-1、TNF-α的表達呈顯著正相關(r值為0.783~0.962，P均＜0.01)。
討論
本研究參照文獻采用尾靜脈注射LPS 5 mg/kg的方法制備大鼠內毒素性急性肺損傷模型[4]，實驗表明ALI組與對照組相比肺組織W/D升高，BALF中ICAM-1、TNF-α含量升高，光鏡下可見肺組織充血、水腫、大量炎癥細胞浸潤，肺泡結構明顯破壞，提示大鼠內毒素性急性肺損傷模型制備成功。LPS是革蘭陰性細菌外膜的主要組成部分，它在ALI的病因中起重要作用，可以激活多種效應細胞釋放大量炎癥介質如TNF-α、ICAM-1，從而導致ALI[6]。本研究結果發現ALI組大鼠BALF中ICAM-1、TNF-α含量在使用內毒素2 h后開始明顯升高，并隨著時間的延長呈進行性增加趨勢，證明ICAM-1、TNF-α參與了大鼠內毒素性急性肺損傷時的病理生理改變，與文獻報道相符。
NF-κB作為一種轉錄調節因子，NF-κB的活化可上調ICAM-1、TNF-α等炎癥相關因子的表達，誘發炎癥反應，導致臟器損傷[7]。NF-κB的激活在LPS導致的ALI/ARDS中起關鍵作用[8]。NF-κB包括P50、P65兩個亞基，且常以它們形成的異二聚體形式存在。在靜止細胞中NF-κB與其抑制蛋白(IκB)偶聯形成無活性的三聚體存留于胞漿[9-10]。在炎癥刺激時，IκB發生磷酸化降解，釋放出NF-κB，并轉移至細胞核，與調控基因的啟動子或增強子結合，啟動和調控參與炎癥反應的炎癥相關因子[11]。研究發現蛋白酶體抑制劑MG-132作為一種新型的抗炎藥物，能夠通過抑制IκB發生磷酸化降解從而抑制NF-κB激活，減少ICAM-1、TNF-α等炎癥相關因子的表達，最終減輕炎癥損傷[12-13]。提前使用蛋白酶體抑制劑MG-132可明顯提高重癥肺炎大鼠的生存率[14]。參照文獻[15]及預實驗結果，選擇MG-132劑量為10 mg/kg，結果表明與ALI組相比MG-132組肺組織光鏡下可見肺組織損傷減輕，肺組織W/D降低，BALF中ICAM-1、TNF-α含量降低，核蛋白中NF-κB P65較模型組表達降低，提示MG-132可改善內毒素性急性肺損傷炎癥反應。相關性分析表明三組大鼠肺組織NF-κB P65蛋白的表達與ICAM-1、TNF-α的表達呈顯著正相關，證實抑制NF-κB的激活可以減少炎癥相關因子ICAM-1、TNF-α的表達。
綜上所述，本實驗證實MG-132可改善內毒素性急性肺損傷炎癥反應，這種作用可能與抑制NF-κB的激活，從而減少炎癥相關因子ICAM-1、TNF-α的表達，抑制炎癥損傷有關。然而，本研究MG-132為制備模型前用藥，未設置模型制備后MG-132對照組，我們還需要進一步明確MG-132的最佳治療時間及劑量，深入探討和研究MG-132對脂多糖致急性肺損傷大鼠的抗炎作用機制。
急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)是指由心源性以外的各種如感染、創傷、休克等肺內、外致病因素所致的急性、進行性缺氧性呼吸衰竭[1]。ALI/ARDS是一種常見的臨床危重病癥，有較高的患病率和死亡率[2]。蛋白酶體抑制劑MG-132是一種醛基肽類蛋白酶體抑制劑，能抑制NF-κB抑制蛋白(IκB)的降解，而下調核因子κB(NF-κB)的表達，減少機體的炎癥反應[3]。本實驗使用蛋白酶體抑制劑MG-132來觀察其對內毒素性大鼠急性肺損傷后細胞間粘附分子1(ICAM-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、NF-κB P65表達的影響，進一步探討MG-132對內毒素性肺損傷后NF-κB信號通路和炎癥反應的影響及其機制。
對象與方法
一 材料
1．實驗動物：清潔級成年雄性SD大鼠54只，由南方醫科大學動物實驗中心提供，體質量240~270 g。
2．主要試劑：脂多糖(LPS，美國sigma公司)；MG-132(美國Calbiochem公司)；ICAM-1、TNF-α ELISA試劑盒(均購于上海研吉生物公司)；大鼠NF-κB P65抗體(美國Cell Signaling公司)。
二 方法
1．動物分組與造模：健康清潔級成年雄性SD大鼠54只，按隨機數字表法分為對照組、ALI組和MG-132組，每組18只。參照文獻[4]的方法經尾靜脈注射LPS 5 mg/kg制備大鼠急性肺損傷模型。對照組尾靜脈注入生理鹽水，ALI組和MG-132組尾靜脈注射LPS 5 mg/kg，MG-132組于實驗前30 min腹腔注射MG-132 10 mg/kg。
2．標本采集：3組大鼠在注射生理鹽水或LPS后2、4、8 h各隨機處死6只。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，心臟穿刺抽血處死大鼠，打開胸腔，取肺組織。結扎右肺門，經氣管插入一次性靜脈輸液導管并固定，將7.5 mL無菌PBS分3次灌洗左肺，回收支氣管肺泡灌洗液(BALF)。將BALF 4 ℃ 1 200 r/min離心10 min，上清液轉移到離心管至于-80 ℃超低溫冰箱中備測。同時分離出右肺組織。
3．病理檢查：取右肺上葉，用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，常規蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理學變化。
4．肺組織濕/干重比值(W/D)檢測：取大鼠右肺中葉，用濾紙吸干表面的血跡，稱肺濕質量，然后置于75 ℃恒溫干燥箱烘烤48 h至恒重，稱肺干質量。肺濕質量與干質量的比值即W/D。
5．BALF中ICAM-1、TNF-α的檢測：ELISA法測BALF中ICAM-1、TNF-α水平，方法嚴格按產品說明書進行。
6．Western blot法測定肺組織NF-κB P65蛋白的表達：取右肺下葉，迅速凍存于液氮中以備勻漿。參照文獻[5]中介紹的方法，提取肺組織的胞核蛋白。用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，定量后-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。取50 μg樣品蛋白，加人5×SDS加樣緩沖液，100 ℃沸水浴中6 min使蛋白變性，進行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后，加一抗(NF-κB P65一抗濃度為1∶1 000，β-actin濃度為1∶1 000)，4 ℃過夜，棄一抗，洗膜3次，加相應二抗，室溫孵育1 h，洗膜3次，ECL顯影，用BIORAD凝膠成像分析系統拍照并進行圖像分析，實驗重復3次，取平均值，計算目的蛋白的相對表達量(目的蛋白的相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參β-actin條帶灰度值)。
三 統計學處理
采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學處理。計量資料以
結果
一 各組大鼠病理特點
各組大鼠肺大體及光鏡下觀察，對照組大鼠肺組織表面光滑，呈均勻淡粉紅色，表面未見病損灶，無充血、水腫；光鏡下肺間質及肺泡無充血、水腫、炎癥等改變。ALI組大鼠肺組織呈暗紅色，肺充血、水腫明顯，肺組織體積增大，并隨觀察時間的延長肺充血、水腫更加明顯；光鏡下可見肺泡間隔增寬，肺灶性出血，肺泡和肺間質水腫，肺泡腔明顯變狹窄，大量炎性細胞浸潤。MG-132組大鼠造模后肺組織可見充血、水腫，體積與ALI組比較變化不大；光鏡下可見炎性細胞浸潤較模型組減輕。結果見圖 1。
圖1
各組大鼠肺組織病理學變化(HE× 100) a．對照組；b．ALI組；c．MG-132組
二 大鼠肺組織W/D比值情況
對照組大鼠W/D比值在3個時間點變化不顯著，差異無統計學意義。ALI組與對照組比較，各觀察時間點肺組織W/D比值均明顯升高(P＜0.05)。MG-132組各觀察時間點肺組織W/D比值較ALI組明顯降低，但高于對照組(P＜0.05)。結果見表 1。
表1
各時間點三組大鼠肺組織W/D(n=6，三 大鼠BALF中ICAM-1、TNF-α水平
與對照組比較，ALI組、MG-132組BALF中ICAM-1、TNF-α含量在各觀察時間點均明顯升高(P＜0.05)，并隨著觀察時間的延長有升高的趨勢；MG-132組各觀察時間點BALF中ICAM-1、TNF-α含量均較ALI組降低(P＜0.05)。結果見表 2。
表2
各時間點三組大鼠BALF 中ICAM-1、TNF-α的表達(n=6，n=50，四 肺組織NF-κB P65蛋白的表達
各觀察時間點ALI組、MG-132組肺組織NF-κB P65蛋白的相對表達量較對照組升高(P＜0.05)；MG-132組肺組織NF-κB P65蛋白的相對表達量較ALI組降低(P＜0.05)。結果見圖 2、表 3。
圖2
各時間點三組大鼠肺組織NF-κB P65蛋白的表達
表3
各時間點三組大鼠肺組織NF-κB P65蛋白的相對表達量(n=6，五 相關性分析
三組大鼠肺組織NF-κB P65蛋白的表達與ICAM-1、TNF-α的表達呈顯著正相關(r值為0.783~0.962，P均＜0.01)。
討論
本研究參照文獻采用尾靜脈注射LPS 5 mg/kg的方法制備大鼠內毒素性急性肺損傷模型[4]，實驗表明ALI組與對照組相比肺組織W/D升高，BALF中ICAM-1、TNF-α含量升高，光鏡下可見肺組織充血、水腫、大量炎癥細胞浸潤，肺泡結構明顯破壞，提示大鼠內毒素性急性肺損傷模型制備成功。LPS是革蘭陰性細菌外膜的主要組成部分，它在ALI的病因中起重要作用，可以激活多種效應細胞釋放大量炎癥介質如TNF-α、ICAM-1，從而導致ALI[6]。本研究結果發現ALI組大鼠BALF中ICAM-1、TNF-α含量在使用內毒素2 h后開始明顯升高，并隨著時間的延長呈進行性增加趨勢，證明ICAM-1、TNF-α參與了大鼠內毒素性急性肺損傷時的病理生理改變，與文獻報道相符。
NF-κB作為一種轉錄調節因子，NF-κB的活化可上調ICAM-1、TNF-α等炎癥相關因子的表達，誘發炎癥反應，導致臟器損傷[7]。NF-κB的激活在LPS導致的ALI/ARDS中起關鍵作用[8]。NF-κB包括P50、P65兩個亞基，且常以它們形成的異二聚體形式存在。在靜止細胞中NF-κB與其抑制蛋白(IκB)偶聯形成無活性的三聚體存留于胞漿[9-10]。在炎癥刺激時，IκB發生磷酸化降解，釋放出NF-κB，并轉移至細胞核，與調控基因的啟動子或增強子結合，啟動和調控參與炎癥反應的炎癥相關因子[11]。研究發現蛋白酶體抑制劑MG-132作為一種新型的抗炎藥物，能夠通過抑制IκB發生磷酸化降解從而抑制NF-κB激活，減少ICAM-1、TNF-α等炎癥相關因子的表達，最終減輕炎癥損傷[12-13]。提前使用蛋白酶體抑制劑MG-132可明顯提高重癥肺炎大鼠的生存率[14]。參照文獻[15]及預實驗結果，選擇MG-132劑量為10 mg/kg，結果表明與ALI組相比MG-132組肺組織光鏡下可見肺組織損傷減輕，肺組織W/D降低，BALF中ICAM-1、TNF-α含量降低，核蛋白中NF-κB P65較模型組表達降低，提示MG-132可改善內毒素性急性肺損傷炎癥反應。相關性分析表明三組大鼠肺組織NF-κB P65蛋白的表達與ICAM-1、TNF-α的表達呈顯著正相關，證實抑制NF-κB的激活可以減少炎癥相關因子ICAM-1、TNF-α的表達。
綜上所述，本實驗證實MG-132可改善內毒素性急性肺損傷炎癥反應，這種作用可能與抑制NF-κB的激活，從而減少炎癥相關因子ICAM-1、TNF-α的表達，抑制炎癥損傷有關。然而，本研究MG-132為制備模型前用藥，未設置模型制備后MG-132對照組，我們還需要進一步明確MG-132的最佳治療時間及劑量，深入探討和研究MG-132對脂多糖致急性肺損傷大鼠的抗炎作用機制。
