引用本文： 倪娟, 林遠貴, 吳蘭, 黃蔚, 江曉琴. 妊娠期糖尿病對肺發育的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2015, 14(2): 190-193. doi: 10.7507/1671-6205.2015048 復制
未控制的母體糖尿病，其高濃度的血糖可透過胎盤進入胎兒血液循環，致使胎兒代謝異常，從而引起胎兒中樞神經系統、心臟系統、肺等多種器官發育異常[1-3]，對胎兒和新生兒近期或遠期結局產生影響[4]。研究表明，胎兒高血糖可修改大鼠神經巢和卵黃囊中編碼促凋亡蛋白、細胞增殖的基因表達[5-7]。而細胞凋亡和增殖的調節與正常胎兒肺發育和成熟過程密切相關。高氧暴露、機械通氣和急性炎癥反應所引起的急性肺損傷，也觀察到細胞凋亡和細胞增殖的改變，這些改變可能引起肺的形態學改變。目前，關于胎兒高血糖對肺細胞凋亡和細胞增殖的影響以及這些影響是否改變肺結構發育的研究較少，因此，我們設計了該研究探討胎兒宮內高血糖暴露對新生鼠肺細胞凋亡、增殖和肺結構發育的影響。
材料與方法
一 材料
健康SD大鼠由四川大學實驗動物中心提供，其中雄性體質量250~350 g,雌性240~280 g。鏈脲佐菌素(STZ)購自sigma公司,TUNEL試劑盒購自美國Promega公司，增殖細胞核抗原(PCNA)單克隆抗體購于SANTA Gruz公司。
二 方法
1．1% STZ的配制：將2.1 g檸檬酸加入雙蒸水100 mL中配成A液，2.94 g檸檬酸鈉加入雙蒸水100 mL中配成B液。將新鮮配置的A液28 mL、B液22 mL混合，調節pH值為4.2～4.5，配制為0.1 mol/L檸檬酸緩沖液。1% STZ的配制方法：100 mg鏈脲佐菌素溶解在10 mL新鮮配制的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中。
2．實驗分組：將妊娠大鼠隨機分成高血糖組(STZ組)和正常妊娠組，每組各20只。STZ組：孕鼠妊娠第4.5天腹腔注射STZ建立胎鼠高血糖模型。正常妊娠組：在相同條件下腹腔注射相同體積檸檬酸緩沖液。兩組妊娠SD大鼠在腹腔注射前、注射后48 h(即妊娠6.5 d)，妊娠11.5 d、16.5 d和20.5 d分別測尾靜脈隨機血糖。記錄自然分娩后兩組新生大鼠一般情況和存活情況。
3．胎鼠高血糖模型的建立：適應性喂養1周后，將健康SD大鼠于下午3：00～4：00點合籠(雄雌比例為1∶3)，次日上午8:00～9:00雌鼠陰道觀察到陰栓或分泌物涂片查見精子者視為受孕，記為妊娠0.5 d。將孕鼠分籠飼養并標記，每只孕鼠給予充足的孕鼠飼料和飲水。孕鼠妊娠第4.5 d，STZ組腹腔注射新配制的1%STZ溶液40 mg/kg，注射前保證足夠飲水且禁食至少12 h。腹腔注射1%STZ溶液48 h后首次測定尾靜脈隨機血糖值，STZ組血糖>16.7 mmol/L視為造模成功并納入研究，反之剔除。此后每五天監測尾靜脈隨機血糖1次，STZ組隨機血糖低于16.7 mmol/L者剔除研究。
4．標本的采取：于出生當天(D0)和第7天(D7)，分別在STZ組和正常妊娠組每組隨機抽取40只存活的SD新生大鼠。其中20只吸入七氟醚麻醉后立即剖胸取肺組織，擦干血跡后稱量濕肺重。另20只七氟醚吸入麻醉，打開胸腔，剪開右心耳，在心尖左心室插管，先用冰生理鹽水10 mL灌洗，再用40 g/L多聚甲醛10 mL灌洗10～15 min，迅速取下肺組織，100 g/L福爾馬林固定24~48 h，石蠟包埋。
5．肺間隔厚度和輻射狀肺泡計數(radical alveolar count,RAC)：肺間隔厚度和RAC是肺泡發育期評價肺泡發育的重要指標之一。將肺組織常規固定、脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色。RAC值指在HE切片上從終末細支氣管中心至最近的纖維隔引垂線,該直線上的肺泡數，其反映終末呼吸單位所含肺泡數目。每組每個標本取1張HE切片，在100倍光鏡下，每張切片計數10視野,取平均值作為每只胎鼠的RAC值。
6．肺組織凋亡的檢測：按照TUNEL試劑盒說明書步驟，檢測D0、D7時點肺細胞凋亡。熒光顯微鏡下正常肺細胞呈藍色，凋亡細胞呈綠色。每個標本選5個視野，計數每個視野肺細胞中凋亡的細胞數，計算凋亡指數。凋亡指數(%)=凋亡肺細胞/肺細胞總數×100%。
7．肺細胞增殖的檢測：PCNA是細胞DNA聚合酶的附屬蛋白，僅僅在增殖細胞內合成和表達，反映細胞增殖情況。用免疫組化法檢測D0、D7不同時點肺細胞PCNA染色情況，分析肺細胞增殖情況。顯微鏡下，細胞核出現棕黃色顆粒為陽性細胞。每個標本選5個視野，計數每個視野肺細胞中增殖細胞數，計算增殖指數。PI增殖指數=增殖肺細胞/肺細胞總數×100%。
三 統計學處理
使用SPSS 15.0進行統計分析，計量資料采用
結果
一 兩組孕鼠一般情況
兩組孕鼠各時點體質量均比孕前增加。妊娠11.5 d、16.5 d和20.5 d STZ組母鼠體質量增加均明顯低于正常對照組。結果見表 1。
表1
兩組孕鼠不同時點體質量(g, 二 兩組孕鼠各時點隨機血糖比較
SD大鼠妊娠4.5 d腹腔注射STZ(40 mg/kg)可誘發隨機血糖顯著增加,且可持續整個妊娠期。結果見表 2。
表2
兩組不同時點隨機血糖值(mmol/L,三 兩組新生鼠存活率比較
STZ組和正常妊娠組新生鼠出生當天存活率分別為79.6%(144/181)和99.0%(207/209),差異有統計學意義(P=0.00)。出生當天兩組各取40只新生大鼠取標本后，STZ組和正常妊娠組各剩余大鼠104和167只。至出生第7 d剩余大鼠STZ組累計死亡12只，正常對照組無新生鼠死亡，存活率分別為88.5%(92/104)和100.0%(167/167)，差異有統計學意義(P=0.00)。
四 胎鼠高血糖暴露對出生后肺發育的影響
宮內高血糖暴露可引起新生大鼠出生時體質量降低，相對肺質量降低，肺間隔變薄(P<0.05)。但宮內高血糖對RAC無顯著影響。出生第7 d，STZ組肺間隔仍顯著薄于對照組(P<0.05)。結果見表 3。
表3
兩組新生鼠體質量、相對肺質量、肺間隔厚度和RAC(五 新生鼠肺組織的凋亡和增殖
D0時，STZ組新生鼠肺組織凋亡指數比正常妊娠組增加(P=0.00),D7時兩組新生鼠肺組織凋亡指數差異無統計學意義。結果見圖 1，表 4。與正常妊娠組比，STZ組新生鼠在D0、D7 PCNA陽性細胞率顯著增加(P<0.05)。結果見表 4。
表4
兩組新生鼠肺細胞凋亡和增殖比較(%，
圖1
各組新生大鼠肺組織各時點的細胞凋亡(TUNEL ×400) a.正常妊娠組D0；b.STZ 組D0；c.正常妊娠組D7；d.STZ 組D7
討論
STZ是一種含亞硝基化合物的廣譜抗生素，對胰島細胞具有高選擇性毒性作用，可特異性破壞大鼠胰島β細胞。因此，我們選擇STZ建立妊娠期糖尿病模型。我們研究結果顯示：在妊娠4.5 d腹腔注射新配制的1% STZ溶液40 mg/kg可使妊娠大鼠孕期血糖維持16.7 mmol/L以上，該方法可成功建立妊娠糖尿病模型。預實驗中，我們于妊娠第1天腹腔注射STZ建立妊娠糖尿病模型。在妊娠第12天時，妊娠大鼠剖腹探查發現胚胎數量少，陰道涂片陽性的SD大鼠沒有或僅1~4個胚胎。我們推測：早期高血糖暴露可能會損傷精子或受精卵。而在妊娠4.5天腹腔注射同劑量的STZ，則上述情況明顯改善。臨床上，妊娠糖尿病也常常在妊娠中期診斷和發病。因此，我們選擇在妊娠4.5 d腹腔注射STZ建立妊娠糖尿病模型。
本研究在腹腔注射STZ后48 h(妊娠6.5 d)、妊娠11.5 d、妊娠16.5 d和妊娠20.5 d持續監測妊娠大鼠血糖濃度，結果證明整個孕期妊娠大鼠血糖濃度均大于20 mmol/L。而血糖分子可通過胎盤到達胎兒體內，這提示腹腔注射40 mg/kg STZ可成功建立胎兒宮內高糖模型。研究結果發現，妊娠糖尿病孕鼠體質量增加比正常妊娠大鼠低，胎鼠宮內高糖暴露后新生鼠體質量降低，胎兒死亡率增加，出生當天存活率降低。胎鼠宮內高糖暴露后新生鼠體質量降低與既往李鑫等[8]和Kiss等[9]研究結果不一致，推測其可能原因：(1)本研究中孕鼠血糖較高，均超過了20 mmol/L，而李鑫等[8]研究中孕鼠血糖為10～20 mmol/L。(2)本研究是正常大鼠受孕后注射STZ建立的高血糖模型，而Kiss等[9]是先建立了大鼠糖尿病模型再受孕。
正常情況下，肺在新生大鼠出生后開始進行氣體交換，完成呼吸功能。新生大鼠與人不同，出生后肺組織仍在不斷的發育，原始肺泡壁第二嵴形成，肺泡壁再次分隔、變薄，囊泡期肺逐漸發育成肺泡期肺。這一肺發育成熟過程與細胞增殖和分化過程密切相關，肺細胞增殖分化異常可能導致肺成熟異常。本研究結果表明：正常組新生兒D0、D7天肺組織中可見大量PCNA陽性細胞，這說明該時期肺細胞具有較強的增殖能力。胎兒宮內高血糖暴露刺激后，新生鼠D0、D7天PCNA陽性細胞率均比正常妊娠組增加，提示胎兒宮內高糖暴露使出生后肺細胞增殖能力增強。本研究也證明了胎兒宮內高血糖暴露可使肺間隔相對變薄。我們推測變薄的肺間隔可能加速肺的成熟。既往研究發現，妊娠糖尿病可使新生兒肺發育不成熟或相對肺發育延遲[10]，結果與我們研究不一致。分析其可能原因是：本研究僅僅從形態學證明宮內高糖暴露的新生鼠肺相對成熟，這種成熟并不一定對應代謝或肺生理、生化功能的成熟。胎兒宮內高血糖暴露可引起胎兒代謝異常和肺生理生化功能方面發育不成熟。為適應這些功能不成熟，通過調節基因信號系統，機體調節促進肺間隔變薄，肺泡壁細胞凋亡及增殖增加。
綜上所述，胎兒宮內高糖暴露可使新生鼠體質量減輕，死亡率增加，不成熟肺間隔相對變薄，肺細胞凋亡增加，增殖能力增強。然而，宮內高糖暴露通過何種信號通路調節肺細胞的凋亡和增殖能力尚需進一步研究。
未控制的母體糖尿病，其高濃度的血糖可透過胎盤進入胎兒血液循環，致使胎兒代謝異常，從而引起胎兒中樞神經系統、心臟系統、肺等多種器官發育異常[1-3]，對胎兒和新生兒近期或遠期結局產生影響[4]。研究表明，胎兒高血糖可修改大鼠神經巢和卵黃囊中編碼促凋亡蛋白、細胞增殖的基因表達[5-7]。而細胞凋亡和增殖的調節與正常胎兒肺發育和成熟過程密切相關。高氧暴露、機械通氣和急性炎癥反應所引起的急性肺損傷，也觀察到細胞凋亡和細胞增殖的改變，這些改變可能引起肺的形態學改變。目前，關于胎兒高血糖對肺細胞凋亡和細胞增殖的影響以及這些影響是否改變肺結構發育的研究較少，因此，我們設計了該研究探討胎兒宮內高血糖暴露對新生鼠肺細胞凋亡、增殖和肺結構發育的影響。
材料與方法
一 材料
健康SD大鼠由四川大學實驗動物中心提供，其中雄性體質量250~350 g,雌性240~280 g。鏈脲佐菌素(STZ)購自sigma公司,TUNEL試劑盒購自美國Promega公司，增殖細胞核抗原(PCNA)單克隆抗體購于SANTA Gruz公司。
二 方法
1．1% STZ的配制：將2.1 g檸檬酸加入雙蒸水100 mL中配成A液，2.94 g檸檬酸鈉加入雙蒸水100 mL中配成B液。將新鮮配置的A液28 mL、B液22 mL混合，調節pH值為4.2～4.5，配制為0.1 mol/L檸檬酸緩沖液。1% STZ的配制方法：100 mg鏈脲佐菌素溶解在10 mL新鮮配制的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中。
2．實驗分組：將妊娠大鼠隨機分成高血糖組(STZ組)和正常妊娠組，每組各20只。STZ組：孕鼠妊娠第4.5天腹腔注射STZ建立胎鼠高血糖模型。正常妊娠組：在相同條件下腹腔注射相同體積檸檬酸緩沖液。兩組妊娠SD大鼠在腹腔注射前、注射后48 h(即妊娠6.5 d)，妊娠11.5 d、16.5 d和20.5 d分別測尾靜脈隨機血糖。記錄自然分娩后兩組新生大鼠一般情況和存活情況。
3．胎鼠高血糖模型的建立：適應性喂養1周后，將健康SD大鼠于下午3：00～4：00點合籠(雄雌比例為1∶3)，次日上午8:00～9:00雌鼠陰道觀察到陰栓或分泌物涂片查見精子者視為受孕，記為妊娠0.5 d。將孕鼠分籠飼養并標記，每只孕鼠給予充足的孕鼠飼料和飲水。孕鼠妊娠第4.5 d，STZ組腹腔注射新配制的1%STZ溶液40 mg/kg，注射前保證足夠飲水且禁食至少12 h。腹腔注射1%STZ溶液48 h后首次測定尾靜脈隨機血糖值，STZ組血糖>16.7 mmol/L視為造模成功并納入研究，反之剔除。此后每五天監測尾靜脈隨機血糖1次，STZ組隨機血糖低于16.7 mmol/L者剔除研究。
4．標本的采取：于出生當天(D0)和第7天(D7)，分別在STZ組和正常妊娠組每組隨機抽取40只存活的SD新生大鼠。其中20只吸入七氟醚麻醉后立即剖胸取肺組織，擦干血跡后稱量濕肺重。另20只七氟醚吸入麻醉，打開胸腔，剪開右心耳，在心尖左心室插管，先用冰生理鹽水10 mL灌洗，再用40 g/L多聚甲醛10 mL灌洗10～15 min，迅速取下肺組織，100 g/L福爾馬林固定24~48 h，石蠟包埋。
5．肺間隔厚度和輻射狀肺泡計數(radical alveolar count,RAC)：肺間隔厚度和RAC是肺泡發育期評價肺泡發育的重要指標之一。將肺組織常規固定、脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色。RAC值指在HE切片上從終末細支氣管中心至最近的纖維隔引垂線,該直線上的肺泡數，其反映終末呼吸單位所含肺泡數目。每組每個標本取1張HE切片，在100倍光鏡下，每張切片計數10視野,取平均值作為每只胎鼠的RAC值。
6．肺組織凋亡的檢測：按照TUNEL試劑盒說明書步驟，檢測D0、D7時點肺細胞凋亡。熒光顯微鏡下正常肺細胞呈藍色，凋亡細胞呈綠色。每個標本選5個視野，計數每個視野肺細胞中凋亡的細胞數，計算凋亡指數。凋亡指數(%)=凋亡肺細胞/肺細胞總數×100%。
7．肺細胞增殖的檢測：PCNA是細胞DNA聚合酶的附屬蛋白，僅僅在增殖細胞內合成和表達，反映細胞增殖情況。用免疫組化法檢測D0、D7不同時點肺細胞PCNA染色情況，分析肺細胞增殖情況。顯微鏡下，細胞核出現棕黃色顆粒為陽性細胞。每個標本選5個視野，計數每個視野肺細胞中增殖細胞數，計算增殖指數。PI增殖指數=增殖肺細胞/肺細胞總數×100%。
三 統計學處理
使用SPSS 15.0進行統計分析，計量資料采用
結果
一 兩組孕鼠一般情況
兩組孕鼠各時點體質量均比孕前增加。妊娠11.5 d、16.5 d和20.5 d STZ組母鼠體質量增加均明顯低于正常對照組。結果見表 1。
表1
兩組孕鼠不同時點體質量(g, 二 兩組孕鼠各時點隨機血糖比較
SD大鼠妊娠4.5 d腹腔注射STZ(40 mg/kg)可誘發隨機血糖顯著增加,且可持續整個妊娠期。結果見表 2。
表2
兩組不同時點隨機血糖值(mmol/L,三 兩組新生鼠存活率比較
STZ組和正常妊娠組新生鼠出生當天存活率分別為79.6%(144/181)和99.0%(207/209),差異有統計學意義(P=0.00)。出生當天兩組各取40只新生大鼠取標本后，STZ組和正常妊娠組各剩余大鼠104和167只。至出生第7 d剩余大鼠STZ組累計死亡12只，正常對照組無新生鼠死亡，存活率分別為88.5%(92/104)和100.0%(167/167)，差異有統計學意義(P=0.00)。
四 胎鼠高血糖暴露對出生后肺發育的影響
宮內高血糖暴露可引起新生大鼠出生時體質量降低，相對肺質量降低，肺間隔變薄(P<0.05)。但宮內高血糖對RAC無顯著影響。出生第7 d，STZ組肺間隔仍顯著薄于對照組(P<0.05)。結果見表 3。
表3
兩組新生鼠體質量、相對肺質量、肺間隔厚度和RAC(五 新生鼠肺組織的凋亡和增殖
D0時，STZ組新生鼠肺組織凋亡指數比正常妊娠組增加(P=0.00),D7時兩組新生鼠肺組織凋亡指數差異無統計學意義。結果見圖 1，表 4。與正常妊娠組比，STZ組新生鼠在D0、D7 PCNA陽性細胞率顯著增加(P<0.05)。結果見表 4。
表4
兩組新生鼠肺細胞凋亡和增殖比較(%，
圖1
各組新生大鼠肺組織各時點的細胞凋亡(TUNEL ×400) a.正常妊娠組D0；b.STZ 組D0；c.正常妊娠組D7；d.STZ 組D7
討論
STZ是一種含亞硝基化合物的廣譜抗生素，對胰島細胞具有高選擇性毒性作用，可特異性破壞大鼠胰島β細胞。因此，我們選擇STZ建立妊娠期糖尿病模型。我們研究結果顯示：在妊娠4.5 d腹腔注射新配制的1% STZ溶液40 mg/kg可使妊娠大鼠孕期血糖維持16.7 mmol/L以上，該方法可成功建立妊娠糖尿病模型。預實驗中，我們于妊娠第1天腹腔注射STZ建立妊娠糖尿病模型。在妊娠第12天時，妊娠大鼠剖腹探查發現胚胎數量少，陰道涂片陽性的SD大鼠沒有或僅1~4個胚胎。我們推測：早期高血糖暴露可能會損傷精子或受精卵。而在妊娠4.5天腹腔注射同劑量的STZ，則上述情況明顯改善。臨床上，妊娠糖尿病也常常在妊娠中期診斷和發病。因此，我們選擇在妊娠4.5 d腹腔注射STZ建立妊娠糖尿病模型。
本研究在腹腔注射STZ后48 h(妊娠6.5 d)、妊娠11.5 d、妊娠16.5 d和妊娠20.5 d持續監測妊娠大鼠血糖濃度，結果證明整個孕期妊娠大鼠血糖濃度均大于20 mmol/L。而血糖分子可通過胎盤到達胎兒體內，這提示腹腔注射40 mg/kg STZ可成功建立胎兒宮內高糖模型。研究結果發現，妊娠糖尿病孕鼠體質量增加比正常妊娠大鼠低，胎鼠宮內高糖暴露后新生鼠體質量降低，胎兒死亡率增加，出生當天存活率降低。胎鼠宮內高糖暴露后新生鼠體質量降低與既往李鑫等[8]和Kiss等[9]研究結果不一致，推測其可能原因：(1)本研究中孕鼠血糖較高，均超過了20 mmol/L，而李鑫等[8]研究中孕鼠血糖為10～20 mmol/L。(2)本研究是正常大鼠受孕后注射STZ建立的高血糖模型，而Kiss等[9]是先建立了大鼠糖尿病模型再受孕。
正常情況下，肺在新生大鼠出生后開始進行氣體交換，完成呼吸功能。新生大鼠與人不同，出生后肺組織仍在不斷的發育，原始肺泡壁第二嵴形成，肺泡壁再次分隔、變薄，囊泡期肺逐漸發育成肺泡期肺。這一肺發育成熟過程與細胞增殖和分化過程密切相關，肺細胞增殖分化異常可能導致肺成熟異常。本研究結果表明：正常組新生兒D0、D7天肺組織中可見大量PCNA陽性細胞，這說明該時期肺細胞具有較強的增殖能力。胎兒宮內高血糖暴露刺激后，新生鼠D0、D7天PCNA陽性細胞率均比正常妊娠組增加，提示胎兒宮內高糖暴露使出生后肺細胞增殖能力增強。本研究也證明了胎兒宮內高血糖暴露可使肺間隔相對變薄。我們推測變薄的肺間隔可能加速肺的成熟。既往研究發現，妊娠糖尿病可使新生兒肺發育不成熟或相對肺發育延遲[10]，結果與我們研究不一致。分析其可能原因是：本研究僅僅從形態學證明宮內高糖暴露的新生鼠肺相對成熟，這種成熟并不一定對應代謝或肺生理、生化功能的成熟。胎兒宮內高血糖暴露可引起胎兒代謝異常和肺生理生化功能方面發育不成熟。為適應這些功能不成熟，通過調節基因信號系統，機體調節促進肺間隔變薄，肺泡壁細胞凋亡及增殖增加。
綜上所述，胎兒宮內高糖暴露可使新生鼠體質量減輕，死亡率增加，不成熟肺間隔相對變薄，肺細胞凋亡增加，增殖能力增強。然而，宮內高糖暴露通過何種信號通路調節肺細胞的凋亡和增殖能力尚需進一步研究。
