引用本文： 肖華, 陳思, 張偉, 陸乘俊, 梁曉飛, 沈鶴柏, 金海, 吳俊杰, 李強. 抗體免疫脂質磁球法檢測肺癌循環腫瘤細胞初探. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(2): 147-152. doi: 10.7507/1671-6205.2016035 復制
最近的全球癌癥統計表明肺癌是男性癌癥死亡的主要原因，并且在發達國家中已經超過乳腺癌成為女性癌癥死亡的主要原因[1]。遠處轉移是腫瘤的基本特征之一，是許多腫瘤致死的關鍵因素[2]。隨著病情的進展，肺癌患者會出現骨、腦、肝、腎上腺等遠處轉移，嚴重影響預后。目前臨床上用于腫瘤診斷及預后判斷的方法主要包括腫瘤組織活檢、影像學、血清腫瘤標志物等檢查，這些方法在評估腫瘤轉移上均具有一定的局限性[3-4]。循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是存在于實體瘤患者外周血中的腫瘤細胞，有研究表明在腫瘤患者中CTCs計數對治療療效的評價優于血清腫瘤標志物，且CTCs對臨床療效的早期評估優于影像學檢查，但是目前在肺癌患者中尚缺乏檢測CTCs的有效手段[5-6]。
前期我們以十八烷基三甲基氯化銨對羧甲基殼聚糖和膽固醇為原料找到了一種簡單快速制備磁性陽離子高聚物脂質體的方法，較傳統脂質體相比，有許多優良的特性，如物理和熱穩定性好，有良好的水溶性等，且表面可連接多種生物活性物質[7-9]。上皮細胞粘附分子(EpCAM)是最常用于上皮來源循環腫瘤細胞陽性富集法的細胞表面標志物，細胞角蛋白家族(CK8，CK18，CK19)是檢測上皮表型腫瘤的金標準[10-11]。此外，有研究發現表皮生長因子受體(EGFR)在肺癌細胞表面高表達[12]。本研究通過將肺癌表面抗體anti-EpCAM和anti-EGFR接于磁性陽離子高聚物脂質體上獲得EpCAM和EGFR抗體免疫脂質磁球，以此兩種磁球為捕獲材料檢測CTCs，并與CellsearchTM系統進行比較，評估這兩種磁球是否可用于捕獲肺癌患者CTCs。
材料與方法
一 材料
1．細胞系、主要試劑、外周血樣本：肺癌細胞系A549細胞購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection，ATCC)細胞庫；DMEM培養液、胎牛血清、胰蛋白酶購于Gibco公司；EpCAM抗體購于Sigma公司；CD45-PE購自eBioscience公司；藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標記的CK19抗體購自強生Veridex公司；Cellsearch循環腫瘤細胞檢測試劑盒購于強生Veridex公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色液購自碧云天生物技術有限公司；EpCAM抗體衍生物購自上海銳勁生物技術有限公司；磁性納米顆粒購自上海晟納實業有限公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSAPC-APCG)購自Avanti公司；膽固醇、二氯甲烷以及其他常用試劑均購自國藥公司。10名健康成年志愿者，其中8名志愿者每人抽取外周血15~21 mL，2名抽取3 mL；16例病理確診肺癌患者(無其他部位腫瘤)，其中13例患者抽取外周血6 mL(甲組樣本)，3例抽取15 mL(乙組樣本)；健康志愿者和甲組血樣置于EDTA抗凝管中，乙組血樣置于強生專用采血管中，24 h內處理。所有樣本均取自于長海醫院，受試者知情同意，研究通過醫學倫理會審查。
2．實驗儀器：磁力架(上海柏慧康生物科技有限公司)；離心機(上海安亭科學儀器廠)；熒光顯微鏡，OLYMPUS B×61；CellTracks(強生Veridex公司)；PE標記的CD45抗體(CD45-PE)和BD FACSEALIBUR流式細胞儀均為美國碧迪公司生產；強生CellTracks? AutoPrep? System CTCs檢測儀(簡稱CellsearchTM系統，強生Veridex公司)。
二 方法
1．制備EpCAM和EGFR免疫脂質磁球：采用反向蒸發法制備免疫脂質磁球，后用EpCAM和EGFR抗體進行修飾，并用粒徑分析儀分析，確保所制備的免疫脂質磁球的性能穩定。
2．制備磷酸緩沖鹽溶液(PBS)CTCs模型：取肺癌A549細胞，計數后分別以1~10、11~50、51~100、 101~500、501~1 000個細胞5個梯度加入3 mL PBS溶液中，模擬CTCs模型。
3．制備外周血CTCs模型：取肺癌A549細胞，計數后分別以1~10、11~50、51~100、101~500、501~1 000個細胞5個梯度加入3 mL健康人外周血中，進一步模擬CTCs模型。
4．CTCs的捕獲和鑒定：用EpCAM和EGFR免疫脂質磁捕獲肺癌患者CTCs并使用DAPI、CK19-FITC、CD45-PE進行染色鑒定。本研究中CTCs捕獲及鑒定為人工操作，方法原理與CellsearchTM相近[7]。具體步驟：將待測標本進行1 000 r/min離心10 min；小心取中上層液置于對應的EP管中后，加入與其等量的PBS(pH=7.4)充分混勻；隨后加入選定免疫脂質磁球(EpCAM和EGFR免疫脂質磁球)120 μL，室溫孵育30 min，每10 min混勻1次；將EP管插入磁分離架上吸附10 min，吸棄上清液，取出EP管；使用PBS對捕獲的CTCs進行磁分離洗滌2次；加DAPI 30 μL、CK19-FITC 30 μL、CD45-PE 10 μL混勻避光染色15 min；染色結束后磁分離架上去離子水洗滌2次；最后，向EP管中加入30 μL去離子水重懸，混勻后的液體均勻涂于防脫載玻片中心，待液滴干后在熒光顯微鏡下拍照計數。
5．CTCs判斷標準：熒光顯微鏡下藍色通道觀察DAPI染色，顯示藍色熒光為細胞核；綠色通道下觀察呈綠色熒光表明該細胞表達CK，上皮來源可能性大；紅色通道下顯示紅色熒光表明該細胞表達CD45，為白細胞。循環腫瘤細胞的判斷標準為：將藍色通道下顯示藍色熒光，綠色通道下顯示綠色熒光且紅色通道下不顯示熒光的細胞判定為CTCs(圖 1a、1b)；將藍色通道下顯示藍色熒光，綠色通道下顯示綠色熒光且紅色通道下顯示紅色熒光的細胞判定為白細胞(圖 1c)。
圖1
免疫脂質磁球捕獲肺癌患者CTCs后熒光顯微鏡下的觀察與鑒定圖像(×400，白場) a.EpCAM免疫脂質磁球捕獲后 熒光顯微鏡下CTCs的圖像；b.EGFR免疫脂質磁球捕獲后熒光顯微鏡下CTCs的圖像；c.熒光顯微鏡下觀察到的白細胞的圖像
三 統計學處理
將各組數據經SPSS 21.0統計軟件處理。計數資料以
結 果
一 抗體修飾對免疫脂質磁球粒徑的影響
用粒徑分析儀檢測納米磁球，未經抗體修飾前的納米磁球平均粒徑為261.0 nm(圖 2a)，經EpCAM抗體修飾后免疫脂質磁球平均粒徑增大為319.5 nm(圖 2b)，經EGFR抗體修飾后免疫脂質磁球平均粒徑增大為325.4 nm(圖 2c)。較小的粒徑有助于抗體磁球保持在水相溶液中的穩定性，本實驗制備的抗體磁球符合要求。
圖2
磁球粒徑分布 a.未經抗體修飾前的納米磁球平均粒徑；b.經EpCAM抗體修飾后免疫脂質磁球平均粒徑；c.經EGFR抗體修飾后的免疫脂質磁球平均粒徑
二 EpCAM與EGFR免疫脂質磁球對PBS溶液CTCs模型中A549細胞捕獲結果
取不同細胞密度梯度的PBS溶液CTCs模型6組，其中3組用EpCAM免疫脂質磁球法，另外3組用EGFR免疫脂質磁球法進行CTCs捕獲及鑒定。在不同濃度梯度下，兩種磁球均能有效捕獲A549細胞(圖 3a~e)，對A549細胞的中位檢出率分別為92%和90%，同種磁球在不同濃度梯度的PBS溶液CTCs模型中捕獲效率差異無統計學意義(P＞0.05)，不同磁球在同種細胞密度下捕獲效率差異無統計學意義(圖 3f)。
圖3
EpCAM與EGFR免疫脂質磁球捕獲鑒定不同濃度梯度的PBS溶液CTCs模型 a~e.分別為在3 mL的PBS溶液中加入1~10、11~50、51~100、101~500、501~1 000個A549細胞時兩種磁球的捕獲結果；f.5個濃度梯度下兩種磁球捕獲效率的比較(P＞0.05)
三 EpCAM與EGFR免疫脂質磁球對外周血CTCs模型中肺癌A549細胞的捕獲結果
取不同濃度梯度的外周血CTCs模型8組，其中4組用EpCAM免疫脂質磁球，另外4組用EGFR免疫脂質磁球進行CTCs捕獲鑒定。結果顯示，在不同腫瘤細胞密度梯度下，兩種磁球均能有效捕獲外周血中的A549細胞(圖 4a~e)，且捕獲效率均大于70%；同種磁球在不同細胞密度的外周血CTCs模型中捕獲效率差異無統計學意義(P＞0.05)(圖 4f)；在同種溶劑中兩種磁球的捕獲效率差異無統計學意義(P＞0.05)(圖 4g)；EpCAM免疫脂質磁球在PBS溶液CTCs模型中對A549細胞的捕獲效率大于在外周血CTCs模型(P＜0.05)，EGFR免疫脂質磁球在PBS溶液CTCs模型中對A549細胞的捕獲效率大于在外周血CTCs模型(P＜0.05)(圖 4h)。
圖4
EpCAM與EGFR免疫脂質磁球捕獲鑒定不同濃度梯度的外周血CTCs模型 a~e.分別為在3 mL的健康者的外周血中加入1~10、11~50、51~100、101~500、501~1 000個A549細胞時兩種磁球的捕獲結果； f.外周血CTCs模型中5個濃度梯度下兩種磁球捕獲效率差異無統計學意義(P＞0.05)；g.在同種溶劑中兩種磁球對A549細胞的捕獲效率差異無統計學意義(P＞0.05)；h.兩種磁球在PBS中對A549細胞的捕獲效率均大于在外周血中的捕獲效率(P＜0.05)
四 EpCAM與EGFR免疫脂質磁球對肺癌患者CTCs捕獲結果
將13份甲組樣本的每份血樣平均分為2份，分別用EpCAM與EGFR免疫脂質磁球捕獲鑒定CTCs，將檢測結果標準化為7.5 mL血液標本。結果顯示，兩種磁球均能檢測出肺癌患者CTCs，且兩種磁球的捕獲效率差異無統計學意義(P＞0.05)(圖 5a、b)。取10名健康志愿者外周血的每份血樣平均分為2份，分別用EpCAM與EGFR免疫脂質磁球捕獲鑒定CTCs(作為陰性對照)，與肺癌患者檢測結果進行比較，肺癌患者與對照組間差異有統計學意義(P＜0.05)(圖 5c、d)，說明EpCAM免疫脂質磁球具有較低的假陽性率。
圖5
EpCAM與EGFR免疫脂質磁球捕獲鑒定肺癌患者CTCs a、b：EpCAM與EGFR免疫脂質磁球檢測肺癌患者CTCs的結果；c、d：EpCAM與EGFR免疫脂質磁球檢測健康志愿者與肺癌患者CTCs比較(P＜0.05)
①表示第12號患者EGFR檢測結果缺失
五 EpCAM免疫脂質磁球與CellsearchTM系統對肺癌患者CTCs捕獲結果比較
將乙組每例樣本平均分成2份后分別用EpCAM免疫脂質磁球人工操作法和CellsearchTM系統檢測CTCs。結果顯示，EpCAM免疫脂質磁球對其中2例患者的CTCs檢出量高于CellsearchTM系統(圖 6)。
圖6
EpCAM免疫脂質磁球法與CellsearchTM系統對肺癌患者CTCs捕獲結果比較
討 論
1869年Ashworth[13]首次報道了外周血中存在的CTCs，并認為CTCs是腫瘤進展和復發的原因。此后，尤其是近幾十年來，科研工作者們不斷地探索CTCs的檢測方法，包括“免疫磁分離技術捕獲血液中的CTCs”“微芯片分離技術”等[14-15]。研究發現，CTCs的數量與腫瘤患者的預后相關[16-17]。由于 CTCs較血細胞而言數量極少，約1個/1012~1個/109，捕獲CTCs有如大海撈針，故目前尚無一種具有高敏感性、特異性且經濟簡便的檢測方法可應用于臨床。即便是FDA批準的CellsearchTM系統，也僅可用于乳腺癌、前列腺癌和結腸癌患者CTCs的檢測，且因其檢測費用高昂，在臨床上并未廣泛使用，而又因肺癌CTCs上皮標志物表達量低，CellsearchTM系統不能對其進行有效捕獲[6]。
本課題組前期研制的脂質磁球具有穩定的理化性質和良好的水溶性，以及表面可更好地與抗體結合的特點，基于此設計了EpCAM及EGFR抗體免疫脂質磁球捕獲CTCs，再以是否表達CK19和CD45作為判定的標準，檢測CTCs。利用抗體免疫脂質磁球法檢測肺癌CTCs，發現其能有效捕獲1~300個/mL A549的CTCs模型，且可有效捕獲不同類型肺癌患者的循環腫瘤細胞。與CellsearchTM系統進行對比的3例患者CTCs檢測結果提示抗體免疫脂質磁球法CTCs檢出率較高。由此可見，抗體免疫脂質磁球法具有較好的臨床應用前景。但因檢測臨床樣本數量限制，本研究未結合患者的臨床資料作統計分析。EpCAM及EGFR抗體免疫脂質磁球對CTCs的捕獲效能還需進一步擴大樣本量進行臨床驗證。
最近的全球癌癥統計表明肺癌是男性癌癥死亡的主要原因，并且在發達國家中已經超過乳腺癌成為女性癌癥死亡的主要原因[1]。遠處轉移是腫瘤的基本特征之一，是許多腫瘤致死的關鍵因素[2]。隨著病情的進展，肺癌患者會出現骨、腦、肝、腎上腺等遠處轉移，嚴重影響預后。目前臨床上用于腫瘤診斷及預后判斷的方法主要包括腫瘤組織活檢、影像學、血清腫瘤標志物等檢查，這些方法在評估腫瘤轉移上均具有一定的局限性[3-4]。循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是存在于實體瘤患者外周血中的腫瘤細胞，有研究表明在腫瘤患者中CTCs計數對治療療效的評價優于血清腫瘤標志物，且CTCs對臨床療效的早期評估優于影像學檢查，但是目前在肺癌患者中尚缺乏檢測CTCs的有效手段[5-6]。
前期我們以十八烷基三甲基氯化銨對羧甲基殼聚糖和膽固醇為原料找到了一種簡單快速制備磁性陽離子高聚物脂質體的方法，較傳統脂質體相比，有許多優良的特性，如物理和熱穩定性好，有良好的水溶性等，且表面可連接多種生物活性物質[7-9]。上皮細胞粘附分子(EpCAM)是最常用于上皮來源循環腫瘤細胞陽性富集法的細胞表面標志物，細胞角蛋白家族(CK8，CK18，CK19)是檢測上皮表型腫瘤的金標準[10-11]。此外，有研究發現表皮生長因子受體(EGFR)在肺癌細胞表面高表達[12]。本研究通過將肺癌表面抗體anti-EpCAM和anti-EGFR接于磁性陽離子高聚物脂質體上獲得EpCAM和EGFR抗體免疫脂質磁球，以此兩種磁球為捕獲材料檢測CTCs，并與CellsearchTM系統進行比較，評估這兩種磁球是否可用于捕獲肺癌患者CTCs。
材料與方法
一 材料
1．細胞系、主要試劑、外周血樣本：肺癌細胞系A549細胞購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection，ATCC)細胞庫；DMEM培養液、胎牛血清、胰蛋白酶購于Gibco公司；EpCAM抗體購于Sigma公司；CD45-PE購自eBioscience公司；藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標記的CK19抗體購自強生Veridex公司；Cellsearch循環腫瘤細胞檢測試劑盒購于強生Veridex公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色液購自碧云天生物技術有限公司；EpCAM抗體衍生物購自上海銳勁生物技術有限公司；磁性納米顆粒購自上海晟納實業有限公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSAPC-APCG)購自Avanti公司；膽固醇、二氯甲烷以及其他常用試劑均購自國藥公司。10名健康成年志愿者，其中8名志愿者每人抽取外周血15~21 mL，2名抽取3 mL；16例病理確診肺癌患者(無其他部位腫瘤)，其中13例患者抽取外周血6 mL(甲組樣本)，3例抽取15 mL(乙組樣本)；健康志愿者和甲組血樣置于EDTA抗凝管中，乙組血樣置于強生專用采血管中，24 h內處理。所有樣本均取自于長海醫院，受試者知情同意，研究通過醫學倫理會審查。
2．實驗儀器：磁力架(上海柏慧康生物科技有限公司)；離心機(上海安亭科學儀器廠)；熒光顯微鏡，OLYMPUS B×61；CellTracks(強生Veridex公司)；PE標記的CD45抗體(CD45-PE)和BD FACSEALIBUR流式細胞儀均為美國碧迪公司生產；強生CellTracks? AutoPrep? System CTCs檢測儀(簡稱CellsearchTM系統，強生Veridex公司)。
二 方法
1．制備EpCAM和EGFR免疫脂質磁球：采用反向蒸發法制備免疫脂質磁球，后用EpCAM和EGFR抗體進行修飾，并用粒徑分析儀分析，確保所制備的免疫脂質磁球的性能穩定。
2．制備磷酸緩沖鹽溶液(PBS)CTCs模型：取肺癌A549細胞，計數后分別以1~10、11~50、51~100、 101~500、501~1 000個細胞5個梯度加入3 mL PBS溶液中，模擬CTCs模型。
3．制備外周血CTCs模型：取肺癌A549細胞，計數后分別以1~10、11~50、51~100、101~500、501~1 000個細胞5個梯度加入3 mL健康人外周血中，進一步模擬CTCs模型。
4．CTCs的捕獲和鑒定：用EpCAM和EGFR免疫脂質磁捕獲肺癌患者CTCs并使用DAPI、CK19-FITC、CD45-PE進行染色鑒定。本研究中CTCs捕獲及鑒定為人工操作，方法原理與CellsearchTM相近[7]。具體步驟：將待測標本進行1 000 r/min離心10 min；小心取中上層液置于對應的EP管中后，加入與其等量的PBS(pH=7.4)充分混勻；隨后加入選定免疫脂質磁球(EpCAM和EGFR免疫脂質磁球)120 μL，室溫孵育30 min，每10 min混勻1次；將EP管插入磁分離架上吸附10 min，吸棄上清液，取出EP管；使用PBS對捕獲的CTCs進行磁分離洗滌2次；加DAPI 30 μL、CK19-FITC 30 μL、CD45-PE 10 μL混勻避光染色15 min；染色結束后磁分離架上去離子水洗滌2次；最后，向EP管中加入30 μL去離子水重懸，混勻后的液體均勻涂于防脫載玻片中心，待液滴干后在熒光顯微鏡下拍照計數。
5．CTCs判斷標準：熒光顯微鏡下藍色通道觀察DAPI染色，顯示藍色熒光為細胞核；綠色通道下觀察呈綠色熒光表明該細胞表達CK，上皮來源可能性大；紅色通道下顯示紅色熒光表明該細胞表達CD45，為白細胞。循環腫瘤細胞的判斷標準為：將藍色通道下顯示藍色熒光，綠色通道下顯示綠色熒光且紅色通道下不顯示熒光的細胞判定為CTCs(圖 1a、1b)；將藍色通道下顯示藍色熒光，綠色通道下顯示綠色熒光且紅色通道下顯示紅色熒光的細胞判定為白細胞(圖 1c)。
圖1
免疫脂質磁球捕獲肺癌患者CTCs后熒光顯微鏡下的觀察與鑒定圖像(×400，白場) a.EpCAM免疫脂質磁球捕獲后 熒光顯微鏡下CTCs的圖像；b.EGFR免疫脂質磁球捕獲后熒光顯微鏡下CTCs的圖像；c.熒光顯微鏡下觀察到的白細胞的圖像
三 統計學處理
將各組數據經SPSS 21.0統計軟件處理。計數資料以
結 果
一 抗體修飾對免疫脂質磁球粒徑的影響
用粒徑分析儀檢測納米磁球，未經抗體修飾前的納米磁球平均粒徑為261.0 nm(圖 2a)，經EpCAM抗體修飾后免疫脂質磁球平均粒徑增大為319.5 nm(圖 2b)，經EGFR抗體修飾后免疫脂質磁球平均粒徑增大為325.4 nm(圖 2c)。較小的粒徑有助于抗體磁球保持在水相溶液中的穩定性，本實驗制備的抗體磁球符合要求。
圖2
磁球粒徑分布 a.未經抗體修飾前的納米磁球平均粒徑；b.經EpCAM抗體修飾后免疫脂質磁球平均粒徑；c.經EGFR抗體修飾后的免疫脂質磁球平均粒徑
二 EpCAM與EGFR免疫脂質磁球對PBS溶液CTCs模型中A549細胞捕獲結果
取不同細胞密度梯度的PBS溶液CTCs模型6組，其中3組用EpCAM免疫脂質磁球法，另外3組用EGFR免疫脂質磁球法進行CTCs捕獲及鑒定。在不同濃度梯度下，兩種磁球均能有效捕獲A549細胞(圖 3a~e)，對A549細胞的中位檢出率分別為92%和90%，同種磁球在不同濃度梯度的PBS溶液CTCs模型中捕獲效率差異無統計學意義(P＞0.05)，不同磁球在同種細胞密度下捕獲效率差異無統計學意義(圖 3f)。
圖3
EpCAM與EGFR免疫脂質磁球捕獲鑒定不同濃度梯度的PBS溶液CTCs模型 a~e.分別為在3 mL的PBS溶液中加入1~10、11~50、51~100、101~500、501~1 000個A549細胞時兩種磁球的捕獲結果；f.5個濃度梯度下兩種磁球捕獲效率的比較(P＞0.05)
三 EpCAM與EGFR免疫脂質磁球對外周血CTCs模型中肺癌A549細胞的捕獲結果
取不同濃度梯度的外周血CTCs模型8組，其中4組用EpCAM免疫脂質磁球，另外4組用EGFR免疫脂質磁球進行CTCs捕獲鑒定。結果顯示，在不同腫瘤細胞密度梯度下，兩種磁球均能有效捕獲外周血中的A549細胞(圖 4a~e)，且捕獲效率均大于70%；同種磁球在不同細胞密度的外周血CTCs模型中捕獲效率差異無統計學意義(P＞0.05)(圖 4f)；在同種溶劑中兩種磁球的捕獲效率差異無統計學意義(P＞0.05)(圖 4g)；EpCAM免疫脂質磁球在PBS溶液CTCs模型中對A549細胞的捕獲效率大于在外周血CTCs模型(P＜0.05)，EGFR免疫脂質磁球在PBS溶液CTCs模型中對A549細胞的捕獲效率大于在外周血CTCs模型(P＜0.05)(圖 4h)。
圖4
EpCAM與EGFR免疫脂質磁球捕獲鑒定不同濃度梯度的外周血CTCs模型 a~e.分別為在3 mL的健康者的外周血中加入1~10、11~50、51~100、101~500、501~1 000個A549細胞時兩種磁球的捕獲結果； f.外周血CTCs模型中5個濃度梯度下兩種磁球捕獲效率差異無統計學意義(P＞0.05)；g.在同種溶劑中兩種磁球對A549細胞的捕獲效率差異無統計學意義(P＞0.05)；h.兩種磁球在PBS中對A549細胞的捕獲效率均大于在外周血中的捕獲效率(P＜0.05)
四 EpCAM與EGFR免疫脂質磁球對肺癌患者CTCs捕獲結果
將13份甲組樣本的每份血樣平均分為2份，分別用EpCAM與EGFR免疫脂質磁球捕獲鑒定CTCs，將檢測結果標準化為7.5 mL血液標本。結果顯示，兩種磁球均能檢測出肺癌患者CTCs，且兩種磁球的捕獲效率差異無統計學意義(P＞0.05)(圖 5a、b)。取10名健康志愿者外周血的每份血樣平均分為2份，分別用EpCAM與EGFR免疫脂質磁球捕獲鑒定CTCs(作為陰性對照)，與肺癌患者檢測結果進行比較，肺癌患者與對照組間差異有統計學意義(P＜0.05)(圖 5c、d)，說明EpCAM免疫脂質磁球具有較低的假陽性率。
圖5
EpCAM與EGFR免疫脂質磁球捕獲鑒定肺癌患者CTCs a、b：EpCAM與EGFR免疫脂質磁球檢測肺癌患者CTCs的結果；c、d：EpCAM與EGFR免疫脂質磁球檢測健康志愿者與肺癌患者CTCs比較(P＜0.05)
①表示第12號患者EGFR檢測結果缺失
五 EpCAM免疫脂質磁球與CellsearchTM系統對肺癌患者CTCs捕獲結果比較
將乙組每例樣本平均分成2份后分別用EpCAM免疫脂質磁球人工操作法和CellsearchTM系統檢測CTCs。結果顯示，EpCAM免疫脂質磁球對其中2例患者的CTCs檢出量高于CellsearchTM系統(圖 6)。
圖6
EpCAM免疫脂質磁球法與CellsearchTM系統對肺癌患者CTCs捕獲結果比較
討 論
1869年Ashworth[13]首次報道了外周血中存在的CTCs，并認為CTCs是腫瘤進展和復發的原因。此后，尤其是近幾十年來，科研工作者們不斷地探索CTCs的檢測方法，包括“免疫磁分離技術捕獲血液中的CTCs”“微芯片分離技術”等[14-15]。研究發現，CTCs的數量與腫瘤患者的預后相關[16-17]。由于 CTCs較血細胞而言數量極少，約1個/1012~1個/109，捕獲CTCs有如大海撈針，故目前尚無一種具有高敏感性、特異性且經濟簡便的檢測方法可應用于臨床。即便是FDA批準的CellsearchTM系統，也僅可用于乳腺癌、前列腺癌和結腸癌患者CTCs的檢測，且因其檢測費用高昂，在臨床上并未廣泛使用，而又因肺癌CTCs上皮標志物表達量低，CellsearchTM系統不能對其進行有效捕獲[6]。
本課題組前期研制的脂質磁球具有穩定的理化性質和良好的水溶性，以及表面可更好地與抗體結合的特點，基于此設計了EpCAM及EGFR抗體免疫脂質磁球捕獲CTCs，再以是否表達CK19和CD45作為判定的標準，檢測CTCs。利用抗體免疫脂質磁球法檢測肺癌CTCs，發現其能有效捕獲1~300個/mL A549的CTCs模型，且可有效捕獲不同類型肺癌患者的循環腫瘤細胞。與CellsearchTM系統進行對比的3例患者CTCs檢測結果提示抗體免疫脂質磁球法CTCs檢出率較高。由此可見，抗體免疫脂質磁球法具有較好的臨床應用前景。但因檢測臨床樣本數量限制，本研究未結合患者的臨床資料作統計分析。EpCAM及EGFR抗體免疫脂質磁球對CTCs的捕獲效能還需進一步擴大樣本量進行臨床驗證。
