引用本文： 侯東妮, 何福生, 王明幫, 陳翠翠, 王葆青, 周文浩, 宋元林. H7N9禽流感患者恢復期T細胞受體庫特征研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(5): 429-436. doi: 10.7507/1671-6205.2016102 復制
自2013年，在中國首次報道實驗室確診的人感染禽流感病毒H7N9以來[1]，該新發傳染病在2014年、2015年流感季節仍呈現局部流行趨勢，持續威脅公共衛生安全。據WHO在2015年2月發布的疾病監測報告，截止當時已收到報告的共571例確診病例，死亡率達38%。雖然至今并沒有人際傳播的證據，由于流感病毒持續突變和重組的特性，該病毒獲得人際傳播能力的可能性仍然受到全球研究者的高度關注。面對此種新型流感病毒，人群缺乏相應的中和抗體保護[2-3]。此時，體內已經存在的能夠對不同流感病毒產生交叉反應的記憶性T細胞免疫則有望減低H7N9感染的嚴重性[4-6]。然而目前對于H7N9病毒感染的T細胞免疫研究仍非常有限[7]。T細胞受體（Tcell receptor, TCR)特異性識別的分子結構基礎是抗原互補決定區(complementary determining region, CDR)序列形成的受體可變區，其中CDR3區序列參與形成直接與抗原肽相互作用的重要結構，是后續效應T細胞識別被病毒感染的機體細胞、清除病毒過程的分子基礎[8]。因此，TCR的序列分析將有助于理解病原特異性的T細胞應答，尋找疾病特異性T細胞克隆，同時對研究特殊感染狀態下機體的免疫病理反應具有重要意義，有望指導感染性疾病的診斷和鑒別診斷，為探索新的治療措施提供思路。
本研究采用高通量測序技術，建立了8例H7N9感染患者恢復期以及10例健康成年人TCRβ鏈（Tcell receptor β chain, TRB)序列庫，并通過生物信息學方法，分析患者恢復期淋巴細胞V-D-J基因的取用、免疫多樣性等特征信息，在分子水平展示感染性疾病的細胞免疫病理，有助于指導臨床對H7N9患者的診斷和免疫功能評價，并對挖掘H7N9特異性T淋巴細胞用于疾病治療和疫苗開發有重要意義。
對象與方法
一 對象
本研究納入2013年3月至5月確診H7N9感染的存活患者8例（男6例，女2例），年齡62~81歲，平均年齡(69. 8±6. 1)歲。患者因咽拭子中分離出H7N9病毒確診，于上海公共衛生臨床中心救治。在患者病愈出院后5~7個月對其進行隨訪。所有患者出院后未再次出現發熱、咳嗽、咳痰等呼吸道感染癥狀。采集患者外周血樣本，并同日復查血常規、C反應蛋白、降鈣素原，均正常。本研究另外同期納入10例健康志愿者作為對照組，采集其外周血樣本。對照組入組條件:1年內無流感樣癥狀，1年內無疫苗接種史，無慢性基礎疾病，采血時無任何臨床癥狀及體征。所有患者及志愿者均對此研究知情并提供知情同意書。
二 方法
1. DNA提取及PCR擴增:清晨空腹采集外周血樣本后，立即-80 °C凍存。根據說明書采用Omega公司核酸純化試劑盒（SQ Blood DNA Kit Ⅱ)從上述外周血樣本中提取DNA保存。采用TRB擴增引物(深圳華大基因科技有限公司）建立PCR反應體系，通過多重PCR法和5′TACE PCR實現TRB CDR3區的半定量擴增。第1輪PCR采用針對CDR3的V區及J區兩端設計引物，引入共同序列，反應條件為95 ℃ 15 min, 94 ℃ 30 s × 15個循環, 60 ℃ 40 min, 72 ℃ 30 s, 94 ℃ 30 s × 10個循環，72 ℃10 min, 4 C保存。第2輪PCR使用相應的共同引物，以第1輪PCR產物為模板進行擴增，反應條件為95 ℃ 15 min, 94 ℃ 30 s × 15個循環, 60 ℃ 40 min, 72 ℃ 30 s, 94 ℃ 30 s × 10個循環, 72 ℃ 10 min, 4 C保存。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳純化并測定濃度后，使用新一代測序平臺Ilumina HiSeq2000 platform對TRBCDR3區測序，獲得長度為100個堿基對（bp)左右的CDR3核苷酸序列。
2.測序數據分析:原始數據處理測序獲得數據的分析采用Imonitor軟件[9]。分析過程中主要采取以下方法消除PCR和測序誤差：（1)篩選出帶有合適配對尾端的序列，沒有尾端或尾端小于50 bp的序列認為是符合條件序列，且要求PE1≥60 bp, PE2≥50 bp；(2)除去低質量的序列:整個序列中不能識別的堿基比例小于5%，平均堿基質量大于15, 若每個序列尾端的堿基質量低于10則予以刪除；(3)將配對尾端作為重疊群:每個含有配對尾端的序列的PE1和PE2應有至少10 bp的重疊部分，重疊部分的錯配數應小于2。V-D-J基因的識別采用首先公認的BLAST系統，并通過全序列比對法重新比對, 并米用M-mismatch extension model提高準確率。結果中未獲得V或J基因，或V-J序列方向沖突的序列予以刪除。
3.免疫組庫多樣性的計算:采用目前最常用的兩種描述免疫組庫大小和多樣性的指標評價TRB多樣性，即香農-威納指數（Shannon-Weiner index)和辛普森指數（Simpson Index)。Shanno-Weiner指數計算公式為：H=-∑(Pi)(log2Pi)；Simpson指數計算公式為:D=1-∑(Ni-N)2。
4.評價TRB受體庫相似性的方法:采用重疊距離（overlap distance)計算分析樣品間序列相似性，計算公式為：
| $ OverlapDistance\left( a,b \right)=1/\frac{\sum{_{j=1}^{k}{{\left\{ Ci\left( a \right)+Ci\left( b \right) \right\}}^{-1}}}}{\sum{\left\{ C\left( a \right)+C\left( b \right) \right\}}} $ |
其中k是表示a、b兩樣品有k種兩個樣品都有表達的克隆型，Ci(a)是第i種兩個樣品都有表達的克隆型在a樣品里面的表達量。
三 統計學處理
本研究統計分析及圖表呈現采用R語言。超表達克隆（hyper-expression clone, HEC)定義為克隆讀數占到整個序列庫0.1%以上的克隆。組間定量資料數據的比較使用Student’s t檢驗。P< 0.05時判定結果差異有統計學意義。
結果
一 深度測序結果
本研究共搜集8例H7N9患者外周血樣本、10例正常志愿者外周血樣本建立TRB免疫組庫。經過前述方法實現序列與生殖組基因比對以及誤差修正，Ⅰllumina HeSeq2000 platform測序平臺從每份標本獲得8 x106(6 × 106~14 × 106)CDR3序列，包括24 292(16 242~34 931)個唯一序列。
二 V-D-J取用模式在H7N9患者與正常人群的比較
TCR多樣性集中于CDR3區。CDR3區來源于V-D-J基因在原始T淋巴細胞發育過程中的重組，并伴有堿基的插入與刪除[10-11]，是決定抗原識別的特異性的關鍵因素。V-D-J基因的使用偏倚是整個組庫的重要特征，提示免疫組庫形成過程中的多樣性，并反映識別各種抗原的TCR的數量分布。眾多研究均表明某些疾病狀態下，尤其是感染和疫苗接種后，免疫系統V-D-J基因的分布具有特征性[12]。為探究H7N9患者V-D-J取用的特征性，首先比較患者和正常人TRBV、TRBD和TRBJ基因使用頻率(圖 1)，發現某些在正常人群中較為罕見的特殊TRBV序列在H7N9患者中占主導地位，如H4號患者的TRBV4-3、H1號患者的TRBV25-1，提示患者免疫系統處于激活狀態。但由于免疫系統在不同個體間的較大差異，每位患者高頻使用的V基因并不相同。
圖1
恢復期H7N9患者和健康人群TRB序列庫V-D-J基因使用情況
為確定以上變化，進一步使用統計學方法比較兩組之間不同TRBV基因的頻率差異，發現某些TRBV基因如TRBV30、TRBV27、TRBV18頻率在兩組間有顯著差異（圖 2)。此外，TRBV-TRBJ基因配對作為更準確反映CDR3識別特異性的關鍵特征，其使用頻率在正常人和對照組也存在顯著差異(圖 2)。
圖2
兩組TRBV基因頻率和TRBV-TRVJ基因配對頻率比較
比較不同組各個V基因), V-J基因配對使用頻率的差異?(Student’s
由此，我們提出通過TRBV基因和TRBV-TRBJ基因的使用情況，區分健康人和H7N9恢復期患者兩個不同人群。在此基礎上，使用主成分分析的方法為眾多的基因使用頻率指標降維。結果表明，通過主成分分析能夠成功區分兩組人群，從人群TRBV-TRBJ配對的頻率出發，其區分效率高于V基因頻率分析（圖 3)。同時，針對兩組人群TRBV基因及TRBV-TRBJ配對的線性判別分析也表現出良好的區分度（圖 3)。綜上，通過統計學方法能夠使用該特征較好區分H7N9恢復期患者和正常人群，表明TRBV-TRB基因配對模式在恢復期病人與正常人有顯者差別。
圖3
TRBV基因(a、b)及TRBV-TRBJ基因配對(c、d)使用頻率的主成分分析和線性判別分析
三 正常人群和患者人群中共有序列的分析
CDR3氨基酸序列是免疫組庫的功能單位，相較于V-D-J基因，其能更為精確地體現TCR與抗原結合的特異性。為探討TRB序列庫的相似性，首先分析了CDR3序列長度的分布[13-14]，發現CDR3長度在兩組間并無顯著差異。我們將患者和正常人兩兩比對，尋找每個配對樣本間共有序列的數量。發現在患者-正常人配對中，共有序列極其罕見，但是在患者-患者、正常人-正常人之間存在相當數量的共享序列，且在患者組內共有序列的頻率遠大于正常組內（圖 4a)。較大的組間差異和組內的大量共有序列說明在H7N9患者中TRB受體庫相似性增高，且這些共有序列在正常人中極其罕見。
圖4
TRB CDR3區序列相似度分析
a.共享CDR3序列頻率分布；b.患者與對照組間CDR3序列相似度
進一步采用了重疊距離衡量兩個樣本之間相似性, 發現患者組和正常組之間TRB序列庫CDR3序列的相似性很低，而組內樣本間的相似性較好（圖 4b), 可見此類共有序列可能是H7N9感染特異性的，在感染的免疫反應中扮演重要角色。
四 H7N9患者免疫組庫多樣性的分析
在兩組測序獲得的總CDR3克隆數相仿的情況下，多樣性指數在患者組明顯低于正常人群(Student’s t檢驗，P < 0. 05)(圖 5)。提示TRB庫多樣性的減少是H7N9患者免疫系統的重要特征，在感染恢復期，其免疫功能仍處于相對低下狀態。
圖5
H7N9恢復期患者與正常組間TRB庫多樣性比較
五 比較不同克隆表達水平分布在患者與正常對照間的差異
從以上研究結果出發，考慮多樣性的減少可能為TRB序列庫中某些克隆增加或減少引起，進而檢驗克隆頻率分布。將所有的克隆區分成5個不同表達水平組，包括HEC(>1%)、高表達克隆(0.01%~1%)、中表達克隆(0.001%~1%)、低表達克隆（ < 0. 001%但讀數大于1)和罕見克隆（讀數為1)。相比于正常人群，患者組中HEC和低表達克隆的數量明顯增高，而高表達克隆的數量則減少（圖 6)。這些結果表明，TCR庫在患者組中多樣性相對低下'是HEC增加而高表達克隆明顯減少所致'為了解患者TRB庫所有克隆的整體分布和偏移提供了重要線索。
圖6
不同表達水平的TRB克隆個數在兩組之間的比較
六 HEC序列分析
HEC的數量和累計頻率在患者組高于正常組'提示TRB序列庫在H7N9感染后產生了明顯偏斜，而這些HEC則很有可能與該種病毒感染相關(為探究患者人群中HEC的特征'進一步采用CLUSTAL W序列比對軟件將正常組和患者組中得到的HEC序列做全序列比對，得到以序列相似性為基礎的樹形圖(圖 7)。結果發現患者HEC盡管來自于不同個體，其序列相似性較高；而在對照組，超高表達序列之間相似度較低。因此，患者中這些HEC極有可能來自與H7N9病毒相關的效應T淋巴細胞。
圖7
超高表達TRB CDR3序列比對相似性樹形圖
討論
TCR與抗原肽的特異性結合是細胞免疫過程特異性的核心，因此感染后的TCR序列庫中包含致病微生物相關的重要線索。新一代測序使得在分子序列水平深入研究TCR序列庫成為可能，促進了對各種疾病狀態下TCR序列庫特征性變化的研究。本研究對8例H7N9病毒感染的存活患者恢復期外周血TCR進行深度測序，首次建立了人感染H7H9恢復期TCR數據庫，并將其與10例健康志愿者比較闡釋存活患者的細胞免疫特征性變化。
由于整體患者人數有限，加上該疾病的高死亡率以及患者隨訪困難等多種因素，樣本量受到了一定的限制。此外，本研究隊列標本取材自患者恢復期，然而結果顯示恢復期患者雖然感染已經清除，臨床表現和體征已經消失，各種實驗室指標也已恢復正常，但感染對其免疫組庫造成的影響仍持續存在，如患者TRBV-TRBJ基因的取用及多樣性仍異于正常人群，且含有H7N9特異性的TCR序列。在感染原清除后，細胞免疫應答進入收斂過程，即大多數抗原特異性CD8+ T細胞進入凋亡，以恢復免疫系統應對新的外界抗原刺激的靈活性[15-16]。同時，其余的T細胞將轉化為記憶T細胞建立對該種病原體的免疫記憶[17-19]。研究表明，在記憶性T細胞產生的過程中，T細胞數量相對減少，但仍保持效應T細胞的多樣性，保留對某些罕見抗原的反應能力[18]。目前對于病毒特異性T細胞克隆在感染恢復期的動態變化仍缺少足夠的認識，本研究對TRB序列的研究為感染后T細胞免疫的恢復和T細胞免疫記憶的進程提供了重要信息。
V-D-J基因的取用是免疫組庫最根本的特征之一，來源于淋巴細胞發育過程中的基因重組，是構成T細胞免疫多樣性的重要機制[20]。代表淋巴細胞受體多樣性的CDR3區由V基因后端、D基因和J基因起始端構成，由于D基因長度較短，且在重組過程中因堿基的插入和刪除損失較大，在最終的多態性中占非主導地位。因此，V基因以及V-J基因的配對是決定CDR3區序列和功能的主要因素。眾多研究表明，V基因和V-J基因的取用在人群中表現出疾病特異性[21-23]。本研究運用聚類分析、主成分分析和線性判別分析法，證明了TRBV基因頻率和TRBV-TRBJ配對的頻率分布在H7N9患者與對照組相異，通過分析可將患者與對照組區分。說明H7N9感染患者在出院后6個月，H7N9感染所導致的免疫組庫的特征仍存在，提示感染導致的特異性免疫組庫持續時間超過半年，且此時免疫記憶仍在持續形成。同時該結果也提示，TRBV基因和TRBV-TRBJ配對分析在區分患者人群、隨訪患者免疫狀態中有潛在的應用價值。
一直以來，免疫多樣性作為宏觀上描述免疫系統狀態的指標，被用于評價免疫系統的應變能力，其損害和多種疾病狀態密切相關[24-26]。感染性疾病病程中，隨著免疫反應的啟動，能與pMHC復合體特異性結合的原始T細胞大量擴增，導致免疫系統多樣性的減少，因此多樣性不僅可以反映免疫系統功能的失調，也可以反映感染狀態下免疫系統應答的強度。不僅如此，在衰老人群也觀察到免疫多樣性的減少，并被認為與流感病毒的易感性密切相關[27-29]。研究發現老年人群中免疫多樣性的低下可能是由于原始淋巴細胞的耗竭，導致機體中的淋巴細胞難以對遇到的抗原刺激產生高效應答[16]。此機制也被證明參與老年人對流感病毒的易感性[30]。因此，本研究觀察到的患者免疫多樣性的相對低下可能是由以上多種因素參與導致的。
如上所述，在免疫應答的過程中，抗原特異性T細胞的擴增以及效應性T細胞的產生是T細胞免疫應答中的關鍵一環。在病原體清除、感染得以控制后，效應性T細胞逐漸減少，免疫系統趨向于恢復。本研究觀察到HEC在患者人群中增高，證明患者的免疫組庫并未從感染中完全復原，這些HEC代表了免疫系統對H7N9病毒感染產生的特異性免疫應答。運用序列比對分析建立H7N9患者和正常個體HEC的序列樹形圖，發現部分患者HEC的序列間相似性高，可與大多數對照組HEC區分。這些研究結果證明，HEC作為感染后免疫應答的主導序列，其在不同個體間雖然不完全相同，但具有序列相似性，這些相似序列可能是H7N9感染的特征性序列。
綜上所述，本研究通過建立H7N9感染恢復期患者TCR序列庫，與正常人受體庫比較，首次揭示了人感染H7N9病毒后免疫組庫的特征性變化。我們發現trbv、trbj基因在兩種人群中有明顯差別，可據以識別H7N9感染患者；同時在患者中發現免疫組庫有偏斜，HEC增多且具有H7N9疾病特異性。這些結果對理解該疾病的免疫病理學特征，以及對患者在恢復期免疫功能的評價具有重要意義。
自2013年，在中國首次報道實驗室確診的人感染禽流感病毒H7N9以來[1]，該新發傳染病在2014年、2015年流感季節仍呈現局部流行趨勢，持續威脅公共衛生安全。據WHO在2015年2月發布的疾病監測報告，截止當時已收到報告的共571例確診病例，死亡率達38%。雖然至今并沒有人際傳播的證據，由于流感病毒持續突變和重組的特性，該病毒獲得人際傳播能力的可能性仍然受到全球研究者的高度關注。面對此種新型流感病毒，人群缺乏相應的中和抗體保護[2-3]。此時，體內已經存在的能夠對不同流感病毒產生交叉反應的記憶性T細胞免疫則有望減低H7N9感染的嚴重性[4-6]。然而目前對于H7N9病毒感染的T細胞免疫研究仍非常有限[7]。T細胞受體（Tcell receptor, TCR)特異性識別的分子結構基礎是抗原互補決定區(complementary determining region, CDR)序列形成的受體可變區，其中CDR3區序列參與形成直接與抗原肽相互作用的重要結構，是后續效應T細胞識別被病毒感染的機體細胞、清除病毒過程的分子基礎[8]。因此，TCR的序列分析將有助于理解病原特異性的T細胞應答，尋找疾病特異性T細胞克隆，同時對研究特殊感染狀態下機體的免疫病理反應具有重要意義，有望指導感染性疾病的診斷和鑒別診斷，為探索新的治療措施提供思路。
本研究采用高通量測序技術，建立了8例H7N9感染患者恢復期以及10例健康成年人TCRβ鏈（Tcell receptor β chain, TRB)序列庫，并通過生物信息學方法，分析患者恢復期淋巴細胞V-D-J基因的取用、免疫多樣性等特征信息，在分子水平展示感染性疾病的細胞免疫病理，有助于指導臨床對H7N9患者的診斷和免疫功能評價，并對挖掘H7N9特異性T淋巴細胞用于疾病治療和疫苗開發有重要意義。
對象與方法
一 對象
本研究納入2013年3月至5月確診H7N9感染的存活患者8例（男6例，女2例），年齡62~81歲，平均年齡(69. 8±6. 1)歲。患者因咽拭子中分離出H7N9病毒確診，于上海公共衛生臨床中心救治。在患者病愈出院后5~7個月對其進行隨訪。所有患者出院后未再次出現發熱、咳嗽、咳痰等呼吸道感染癥狀。采集患者外周血樣本，并同日復查血常規、C反應蛋白、降鈣素原，均正常。本研究另外同期納入10例健康志愿者作為對照組，采集其外周血樣本。對照組入組條件:1年內無流感樣癥狀，1年內無疫苗接種史，無慢性基礎疾病，采血時無任何臨床癥狀及體征。所有患者及志愿者均對此研究知情并提供知情同意書。
二 方法
1. DNA提取及PCR擴增:清晨空腹采集外周血樣本后，立即-80 °C凍存。根據說明書采用Omega公司核酸純化試劑盒（SQ Blood DNA Kit Ⅱ)從上述外周血樣本中提取DNA保存。采用TRB擴增引物(深圳華大基因科技有限公司）建立PCR反應體系，通過多重PCR法和5′TACE PCR實現TRB CDR3區的半定量擴增。第1輪PCR采用針對CDR3的V區及J區兩端設計引物，引入共同序列，反應條件為95 ℃ 15 min, 94 ℃ 30 s × 15個循環, 60 ℃ 40 min, 72 ℃ 30 s, 94 ℃ 30 s × 10個循環，72 ℃10 min, 4 C保存。第2輪PCR使用相應的共同引物，以第1輪PCR產物為模板進行擴增，反應條件為95 ℃ 15 min, 94 ℃ 30 s × 15個循環, 60 ℃ 40 min, 72 ℃ 30 s, 94 ℃ 30 s × 10個循環, 72 ℃ 10 min, 4 C保存。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳純化并測定濃度后，使用新一代測序平臺Ilumina HiSeq2000 platform對TRBCDR3區測序，獲得長度為100個堿基對（bp)左右的CDR3核苷酸序列。
2.測序數據分析:原始數據處理測序獲得數據的分析采用Imonitor軟件[9]。分析過程中主要采取以下方法消除PCR和測序誤差：（1)篩選出帶有合適配對尾端的序列，沒有尾端或尾端小于50 bp的序列認為是符合條件序列，且要求PE1≥60 bp, PE2≥50 bp；(2)除去低質量的序列:整個序列中不能識別的堿基比例小于5%，平均堿基質量大于15, 若每個序列尾端的堿基質量低于10則予以刪除；(3)將配對尾端作為重疊群:每個含有配對尾端的序列的PE1和PE2應有至少10 bp的重疊部分，重疊部分的錯配數應小于2。V-D-J基因的識別采用首先公認的BLAST系統，并通過全序列比對法重新比對, 并米用M-mismatch extension model提高準確率。結果中未獲得V或J基因，或V-J序列方向沖突的序列予以刪除。
3.免疫組庫多樣性的計算:采用目前最常用的兩種描述免疫組庫大小和多樣性的指標評價TRB多樣性，即香農-威納指數（Shannon-Weiner index)和辛普森指數（Simpson Index)。Shanno-Weiner指數計算公式為：H=-∑(Pi)(log2Pi)；Simpson指數計算公式為:D=1-∑(Ni-N)2。
4.評價TRB受體庫相似性的方法:采用重疊距離（overlap distance)計算分析樣品間序列相似性，計算公式為：
| $ OverlapDistance\left( a,b \right)=1/\frac{\sum{_{j=1}^{k}{{\left\{ Ci\left( a \right)+Ci\left( b \right) \right\}}^{-1}}}}{\sum{\left\{ C\left( a \right)+C\left( b \right) \right\}}} $ |
其中k是表示a、b兩樣品有k種兩個樣品都有表達的克隆型，Ci(a)是第i種兩個樣品都有表達的克隆型在a樣品里面的表達量。
三 統計學處理
本研究統計分析及圖表呈現采用R語言。超表達克隆（hyper-expression clone, HEC)定義為克隆讀數占到整個序列庫0.1%以上的克隆。組間定量資料數據的比較使用Student’s t檢驗。P< 0.05時判定結果差異有統計學意義。
結果
一 深度測序結果
本研究共搜集8例H7N9患者外周血樣本、10例正常志愿者外周血樣本建立TRB免疫組庫。經過前述方法實現序列與生殖組基因比對以及誤差修正，Ⅰllumina HeSeq2000 platform測序平臺從每份標本獲得8 x106(6 × 106~14 × 106)CDR3序列，包括24 292(16 242~34 931)個唯一序列。
二 V-D-J取用模式在H7N9患者與正常人群的比較
TCR多樣性集中于CDR3區。CDR3區來源于V-D-J基因在原始T淋巴細胞發育過程中的重組，并伴有堿基的插入與刪除[10-11]，是決定抗原識別的特異性的關鍵因素。V-D-J基因的使用偏倚是整個組庫的重要特征，提示免疫組庫形成過程中的多樣性，并反映識別各種抗原的TCR的數量分布。眾多研究均表明某些疾病狀態下，尤其是感染和疫苗接種后，免疫系統V-D-J基因的分布具有特征性[12]。為探究H7N9患者V-D-J取用的特征性，首先比較患者和正常人TRBV、TRBD和TRBJ基因使用頻率(圖 1)，發現某些在正常人群中較為罕見的特殊TRBV序列在H7N9患者中占主導地位，如H4號患者的TRBV4-3、H1號患者的TRBV25-1，提示患者免疫系統處于激活狀態。但由于免疫系統在不同個體間的較大差異，每位患者高頻使用的V基因并不相同。
圖1
恢復期H7N9患者和健康人群TRB序列庫V-D-J基因使用情況
為確定以上變化，進一步使用統計學方法比較兩組之間不同TRBV基因的頻率差異，發現某些TRBV基因如TRBV30、TRBV27、TRBV18頻率在兩組間有顯著差異（圖 2)。此外，TRBV-TRBJ基因配對作為更準確反映CDR3識別特異性的關鍵特征，其使用頻率在正常人和對照組也存在顯著差異(圖 2)。
圖2
兩組TRBV基因頻率和TRBV-TRVJ基因配對頻率比較
比較不同組各個V基因), V-J基因配對使用頻率的差異?(Student’s
由此，我們提出通過TRBV基因和TRBV-TRBJ基因的使用情況，區分健康人和H7N9恢復期患者兩個不同人群。在此基礎上，使用主成分分析的方法為眾多的基因使用頻率指標降維。結果表明，通過主成分分析能夠成功區分兩組人群，從人群TRBV-TRBJ配對的頻率出發，其區分效率高于V基因頻率分析（圖 3)。同時，針對兩組人群TRBV基因及TRBV-TRBJ配對的線性判別分析也表現出良好的區分度（圖 3)。綜上，通過統計學方法能夠使用該特征較好區分H7N9恢復期患者和正常人群，表明TRBV-TRB基因配對模式在恢復期病人與正常人有顯者差別。
圖3
TRBV基因(a、b)及TRBV-TRBJ基因配對(c、d)使用頻率的主成分分析和線性判別分析
三 正常人群和患者人群中共有序列的分析
CDR3氨基酸序列是免疫組庫的功能單位，相較于V-D-J基因，其能更為精確地體現TCR與抗原結合的特異性。為探討TRB序列庫的相似性，首先分析了CDR3序列長度的分布[13-14]，發現CDR3長度在兩組間并無顯著差異。我們將患者和正常人兩兩比對，尋找每個配對樣本間共有序列的數量。發現在患者-正常人配對中，共有序列極其罕見，但是在患者-患者、正常人-正常人之間存在相當數量的共享序列，且在患者組內共有序列的頻率遠大于正常組內（圖 4a)。較大的組間差異和組內的大量共有序列說明在H7N9患者中TRB受體庫相似性增高，且這些共有序列在正常人中極其罕見。
圖4
TRB CDR3區序列相似度分析
a.共享CDR3序列頻率分布；b.患者與對照組間CDR3序列相似度
進一步采用了重疊距離衡量兩個樣本之間相似性, 發現患者組和正常組之間TRB序列庫CDR3序列的相似性很低，而組內樣本間的相似性較好（圖 4b), 可見此類共有序列可能是H7N9感染特異性的，在感染的免疫反應中扮演重要角色。
四 H7N9患者免疫組庫多樣性的分析
在兩組測序獲得的總CDR3克隆數相仿的情況下，多樣性指數在患者組明顯低于正常人群(Student’s t檢驗，P < 0. 05)(圖 5)。提示TRB庫多樣性的減少是H7N9患者免疫系統的重要特征，在感染恢復期，其免疫功能仍處于相對低下狀態。
圖5
H7N9恢復期患者與正常組間TRB庫多樣性比較
五 比較不同克隆表達水平分布在患者與正常對照間的差異
從以上研究結果出發，考慮多樣性的減少可能為TRB序列庫中某些克隆增加或減少引起，進而檢驗克隆頻率分布。將所有的克隆區分成5個不同表達水平組，包括HEC(>1%)、高表達克隆(0.01%~1%)、中表達克隆(0.001%~1%)、低表達克隆（ < 0. 001%但讀數大于1)和罕見克隆（讀數為1)。相比于正常人群，患者組中HEC和低表達克隆的數量明顯增高，而高表達克隆的數量則減少（圖 6)。這些結果表明，TCR庫在患者組中多樣性相對低下'是HEC增加而高表達克隆明顯減少所致'為了解患者TRB庫所有克隆的整體分布和偏移提供了重要線索。
圖6
不同表達水平的TRB克隆個數在兩組之間的比較
六 HEC序列分析
HEC的數量和累計頻率在患者組高于正常組'提示TRB序列庫在H7N9感染后產生了明顯偏斜，而這些HEC則很有可能與該種病毒感染相關(為探究患者人群中HEC的特征'進一步采用CLUSTAL W序列比對軟件將正常組和患者組中得到的HEC序列做全序列比對，得到以序列相似性為基礎的樹形圖(圖 7)。結果發現患者HEC盡管來自于不同個體，其序列相似性較高；而在對照組，超高表達序列之間相似度較低。因此，患者中這些HEC極有可能來自與H7N9病毒相關的效應T淋巴細胞。
圖7
超高表達TRB CDR3序列比對相似性樹形圖
討論
TCR與抗原肽的特異性結合是細胞免疫過程特異性的核心，因此感染后的TCR序列庫中包含致病微生物相關的重要線索。新一代測序使得在分子序列水平深入研究TCR序列庫成為可能，促進了對各種疾病狀態下TCR序列庫特征性變化的研究。本研究對8例H7N9病毒感染的存活患者恢復期外周血TCR進行深度測序，首次建立了人感染H7H9恢復期TCR數據庫，并將其與10例健康志愿者比較闡釋存活患者的細胞免疫特征性變化。
由于整體患者人數有限，加上該疾病的高死亡率以及患者隨訪困難等多種因素，樣本量受到了一定的限制。此外，本研究隊列標本取材自患者恢復期，然而結果顯示恢復期患者雖然感染已經清除，臨床表現和體征已經消失，各種實驗室指標也已恢復正常，但感染對其免疫組庫造成的影響仍持續存在，如患者TRBV-TRBJ基因的取用及多樣性仍異于正常人群，且含有H7N9特異性的TCR序列。在感染原清除后，細胞免疫應答進入收斂過程，即大多數抗原特異性CD8+ T細胞進入凋亡，以恢復免疫系統應對新的外界抗原刺激的靈活性[15-16]。同時，其余的T細胞將轉化為記憶T細胞建立對該種病原體的免疫記憶[17-19]。研究表明，在記憶性T細胞產生的過程中，T細胞數量相對減少，但仍保持效應T細胞的多樣性，保留對某些罕見抗原的反應能力[18]。目前對于病毒特異性T細胞克隆在感染恢復期的動態變化仍缺少足夠的認識，本研究對TRB序列的研究為感染后T細胞免疫的恢復和T細胞免疫記憶的進程提供了重要信息。
V-D-J基因的取用是免疫組庫最根本的特征之一，來源于淋巴細胞發育過程中的基因重組，是構成T細胞免疫多樣性的重要機制[20]。代表淋巴細胞受體多樣性的CDR3區由V基因后端、D基因和J基因起始端構成，由于D基因長度較短，且在重組過程中因堿基的插入和刪除損失較大，在最終的多態性中占非主導地位。因此，V基因以及V-J基因的配對是決定CDR3區序列和功能的主要因素。眾多研究表明，V基因和V-J基因的取用在人群中表現出疾病特異性[21-23]。本研究運用聚類分析、主成分分析和線性判別分析法，證明了TRBV基因頻率和TRBV-TRBJ配對的頻率分布在H7N9患者與對照組相異，通過分析可將患者與對照組區分。說明H7N9感染患者在出院后6個月，H7N9感染所導致的免疫組庫的特征仍存在，提示感染導致的特異性免疫組庫持續時間超過半年，且此時免疫記憶仍在持續形成。同時該結果也提示，TRBV基因和TRBV-TRBJ配對分析在區分患者人群、隨訪患者免疫狀態中有潛在的應用價值。
一直以來，免疫多樣性作為宏觀上描述免疫系統狀態的指標，被用于評價免疫系統的應變能力，其損害和多種疾病狀態密切相關[24-26]。感染性疾病病程中，隨著免疫反應的啟動，能與pMHC復合體特異性結合的原始T細胞大量擴增，導致免疫系統多樣性的減少，因此多樣性不僅可以反映免疫系統功能的失調，也可以反映感染狀態下免疫系統應答的強度。不僅如此，在衰老人群也觀察到免疫多樣性的減少，并被認為與流感病毒的易感性密切相關[27-29]。研究發現老年人群中免疫多樣性的低下可能是由于原始淋巴細胞的耗竭，導致機體中的淋巴細胞難以對遇到的抗原刺激產生高效應答[16]。此機制也被證明參與老年人對流感病毒的易感性[30]。因此，本研究觀察到的患者免疫多樣性的相對低下可能是由以上多種因素參與導致的。
如上所述，在免疫應答的過程中，抗原特異性T細胞的擴增以及效應性T細胞的產生是T細胞免疫應答中的關鍵一環。在病原體清除、感染得以控制后，效應性T細胞逐漸減少，免疫系統趨向于恢復。本研究觀察到HEC在患者人群中增高，證明患者的免疫組庫并未從感染中完全復原，這些HEC代表了免疫系統對H7N9病毒感染產生的特異性免疫應答。運用序列比對分析建立H7N9患者和正常個體HEC的序列樹形圖，發現部分患者HEC的序列間相似性高，可與大多數對照組HEC區分。這些研究結果證明，HEC作為感染后免疫應答的主導序列，其在不同個體間雖然不完全相同，但具有序列相似性，這些相似序列可能是H7N9感染的特征性序列。
綜上所述，本研究通過建立H7N9感染恢復期患者TCR序列庫，與正常人受體庫比較，首次揭示了人感染H7N9病毒后免疫組庫的特征性變化。我們發現trbv、trbj基因在兩種人群中有明顯差別，可據以識別H7N9感染患者；同時在患者中發現免疫組庫有偏斜，HEC增多且具有H7N9疾病特異性。這些結果對理解該疾病的免疫病理學特征，以及對患者在恢復期免疫功能的評價具有重要意義。
