引用本文： 劉海潮, 任娟, 李龍, 徐瑞娟, 曾群麗, 胡振紅. YC-1 對低氧誘導的大鼠肺動脈外膜成纖維細胞增殖及膠原合成的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(5): 504-508. doi: 10.7507/1671-6205.201804062 復制
低氧性肺動脈高壓是慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）、間質性肺疾病等眾多心肺疾病發生發展中的重要病理生理環節，而肺血管重構是低氧性肺動脈高壓形成的重要標志[1]，其發病機制目前尚不清楚。以往在低氧性肺血管重構機制的研究中，外膜成纖維細胞的作用往往被忽略，認為外膜只是一種支持組織，為中膜提供營養。而新近研究表明外膜成纖維細胞在調節血管功能中發揮著重要的作用[2-3]。血管外膜中的成纖維細胞是首先感受低氧刺激的細胞，是感受刺激并在此合成儲存和釋放調節血管壁功能的關鍵因子[4]。低氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α）作為人體組織細胞最主要的低氧應答調控因子，在很多缺氧性疾病中具有重要作用。HIF-1α 可能與低氧性肺動脈高壓發病機制密切有關，但目前其信號調控機制尚不清楚。3-（5'-羥基甲基-2'-呋喃基）-1-苯基吲哚［3-（5'-hydroxymethyl-2'-furyl）-1-benzylindazole，YC-1］為靶向 HIF-1α 抑制劑，可抑制低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖。本研究擬觀察 YC-1 對低氧誘導的大鼠肺動脈外膜成纖維細胞增殖及膠原生成的影響，以及可能的分子機制。
1 材料與方法
1.1 材料
健康雄性 Wistar 大鼠，體重（220±20）g（中國人民解放軍武漢總醫院實驗動物中心提供）。胰蛋白酶、MTT（美國 Sigma 公司），YC-1 粉末（瑞士 Alexis 公司），DMEM 培養基（GIBCO 公司）；3H-脯氨酸（中國原子能研究院同位素研究所）。TRIzol 試劑（美國 Invitrogen 公司），轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、β-肌動蛋白（β-actin）引物（上海博亞生物技術有限公司），脫氧核糖核苷酸（dNTP）、TaqDNA 聚合酶、AMV 反轉錄酶（Promega 公司），抗 HIF-1α 多克隆抗體（美國 Santa Cruz 公司）；辣根過氧化物酶標記羊抗兔 IgG 抗體（北京中山生物技術有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 成纖維細胞培養及鑒定
取 Wistar 大鼠斷頭處死，常規消毒后取出肺動脈，在解剖顯微鏡下剪去肺動脈外周組織，然后縱向剖開血管并平鋪于培養皿中，輕輕刮除內膜，仔細分離中膜和外膜。將分離后的外膜剪碎，均勻鋪置于培養皿底部，待組織塊稍干燥后，用含 20% 胎牛血清的 DMEM 液培養，放置于 5% CO2、37℃、95% 濕度的恒溫箱中培養。每 3 d 用 20% 胎牛血清的 DMEM 培養液換液 1 次。5～7 d 后細胞生長至 80%～90% 融合狀態時，用 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化，傳代。實驗選用 3～5 代細胞。
1.2.2 實驗分組
常氧組：5% CO2，21% O2，培養 24 h。低氧組：5% CO2，5% O2，培養 24 h。低氧+不同濃度 YC-1 組（0.01、0.05 和 0.1 mmol/L）：先低氧條件下培養 24 h，再加入不同濃度 YC-1 培養 24 h。
1.2.3 MTT 法檢測外膜成纖維細胞增殖
將消化下來的成纖維細胞密度調整到 1×104 個/ml，200 μl/孔接種于 96 孔板，置于 37℃，5% CO2 恒溫培養箱中孵育 24 h。吸去培養基以 PBS 100 μl/孔洗孔 2 次，繼續培養 24 h 后按實驗分組施予干預因素。每組均 6 孔。置于培養箱培養 24 h 后，加入 5 g/L MTT 溶液 20 μl/孔，放入 CO2 孵育箱培養 4 h，小心吸去培養液和 MTT，加入 DMSO 200 μl/孔，振蕩 10 min，使結晶充分溶解，在酶標儀上（波長 490 nm）測定各孔吸光度值。
1.2.4 成纖維細胞的膠原合成功能測定
以 3H-脯氨酸摻入率反映成纖維細胞膠原合成功能。取對數生長期成纖維細胞，0.25% 胰酶消化，用含 10% 胎牛血清的 DMEM 調整細胞懸液濃度為 2.5×104/ml，加入 96 孔培養板中，每孔加入 200 μl，靜置培養至細胞接近融合。棄上清，加入無血清 DMEM，繼續培養 24 h，使細胞維持生長靜止狀態。分別加入干預試劑。在最后干預藥物加入的同時加入 3H-脯氨酸 2 μCi/ml 和維生素 C 50 mg/L，12 h 后吸棄上清液，PBS 輕洗，再用 0.25% 胰蛋白酶消化細胞呈細胞懸液，多頭細胞收集器收集細胞至玻璃纖維濾紙上，烤干。將玻璃纖維濾紙置于閃爍計數管中，每管加入閃爍液 0.5 ml，液態閃爍計數儀測定放射性強度。
1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測 HIF-1α 蛋白表達
將成纖維細胞接種于培養皿中，按實驗分組施予不同干預因素予以培養 24 h。棄去培養皿中的培養基，用冷 PBS 溶液洗 2 次，加入適量細胞裂解液，收集細胞于 Eppendorf 管中，離心后收集上清液。考馬斯亮藍染色法（Bradford）測蛋白濃度，取相同量蛋白用于 10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至聚偏二氟乙烯膜，然后用 5% 脫脂奶粉封閉，37℃ 振搖 2 h 后 4℃ 過夜，第 2 d 洗膜 2 次后加入抗 HIF-1α 抗體稀釋液（1∶1 000），37℃ 振搖 2 h，洗膜 2 次，加入羊抗兔 HRP 抗體稀釋液 37℃ 振搖 1 h，同前法洗膜 4 次，加 ECL 熒光劑，壓片顯影。用 GENETools 軟件對結果進行分析。
1.2.6 逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測 TGF-β1 mRNA 表達
按上述分組培養 24 h 后，用試劑裂解細胞并提取細胞總 RNA，反轉錄合成 cDNA，以適量 cDNA 為模板進行聚合酶鏈反應擴增。以 β-actin 為內參照。TGF-β1 上游引物：5'-GTCATAGATTGCATTGTTGC-3'，下游引物：5'-AAGGAGACGGAATACAGGG-3'，產物 301 bp。β-actin 上游引物：5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'，下游引物：5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，產物 541 bp；循環條件：94℃、5 min 后，94℃ 變性 1 min，59℃ 退火 45 s，72℃ 延伸 1 min，30 個循環后再 72℃ 延伸 10 min。擴增產物于含溴化乙錠的 2% 瓊脂糖凝膠進行電泳。用凝膠成像分析系統（GENE GENIVS）攝像分析。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 19.0 統計軟件。所有實驗數據以均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用 t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 不同濃度 YC-1 對低氧誘導的大鼠肺動脈外膜成纖維細胞增殖的影響
低氧誘導下，外膜成纖維細胞 MTT 的吸光度值為 270.59±22.32，與常氧組（110.00±30.81）相比，差異有統計學意義（P<0.01）。低氧誘導后加入不同濃度（0.01 mmol/L、0.05 mmol/L、0.1 mmol/L）YC-1 作用 24 h，成纖維細胞 MTT 的吸光度值分別為 224.37±40.92、186.08±80.42、143.55±62.56，隨著 YC-1 刺激濃度的增高，成纖維細胞 MTT 的吸光度值呈遞減趨勢，且明顯低于低氧組（均P<0.01）。
2.2 不同濃度 YC-1 對低氧誘導的大鼠肺動脈外膜成纖維細胞膠原合成的影響
低氧誘導下，外膜成纖維細胞膠原的合成明顯增加，3H-脯氨酸摻入率為（650±22.3）cpm/2 000 細胞，與常氧組［（302±30.8）cpm/2 000 細胞］相比，差異有統計學意義（P<0.01）。低氧誘導后加入不同濃度（0.01 mmol/L、0.05 mmol/L、0.1 mmol/L）YC-1 作用 24 h，成纖維細胞3H-脯氨酸摻入率分別為（514.0±16.4）、（431.0±26.0）和（350.0±30.1）cpm/2 000 細胞，隨著 YC-1 刺激濃度的增高，成纖維細胞的 3H-脯氨酸摻入率呈遞減趨勢，明顯低于低氧組（均 P<0.01）。
2.3 不同濃度 YC-1 對低氧誘導的大鼠肺動脈外膜成纖維細胞 HIF-1α 蛋白表達的影響
蛋白免疫印跡結果顯示，成纖維細胞表達少量 HIF-1α，低氧刺激后 HIF-1α 表達明顯上調，較對照組升高 4.1 倍（P<0.01）。YC-1 呈劑量依賴性抑制由缺氧刺激的 HIF-1α 表達，其中 YC-1（0.05 mmol/L）組和 YC-1（0.1 mmol/L）組與低氧組相比，HIF-1α 表達分別抑制了 46% 和 65%（均P<0.01）。結果見圖 1。
圖1
不同濃度 YC-1 對低氧條件下 HIF-1α 蛋白表達的影響
a. 蛋白免疫印跡檢測像；b. 蛋白相對表達量。1：常氧組；2：低氧組；3～5：不同濃度 YC-1 組（0.01、0.05、0.1 mmol/L）。與常氧組比較，#
2.4 YC-1 對低氧條件下的 TGF-β1 mRNA 表達的影響
常氧組細胞僅有極少量 TGF-β1 mRNA 表達，經低氧刺激，TGF-β1 mRNA 表達明顯上調。YC-1 呈劑量依賴性抑制由低氧刺激的 TGF-β1 mRNA 表達，其中 YC-1（0.1 mmol/L）組與對照組相比抑制了 61%，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見圖 2。
圖2
不同濃度 YC-1 對低氧條件下 TGF-β1 mRNA 表達的影響
a. 逆轉錄-聚合酶鏈反應擴增產物凝膠電泳像；b. mRNA 相對表達量。1：常氧組；2：低氧組；3～5：不同濃度 YC-1 組（0.01、0.05、0.1 mmol/L）；M：Marker。與常氧組比較，#
3 討論
抑制低氧性肺血管重塑的形成是治療低氧性肺動脈高壓的關鍵。低氧性肺血管重塑是多種細胞參與、多種因素共同作用的結果，除了內膜增厚、中膜平滑肌細胞增殖肥大外，外膜成纖維細胞的活化、增殖、遷移在其中也扮演著重要角色[5-6]。以往在低氧性肺血管重構機制的研究中，外膜的作用往往被忽略。新近研究表明，血管外膜特別是其中的成纖維細胞在調節血管功能中發揮著重要的作用。低氧不僅能誘導肺動脈外膜成纖維細胞表型轉化及增殖，而且外膜中成纖維細胞的增殖反應較中層平滑肌細胞發生更早[7]，因此，外膜成纖維細胞可能是感受低氧的始動因素[8-9]。低氧環境中成纖維細胞在活性氧的誘導下可釋放大量能影響血管緊張度的介質，包括內皮素-1、血小板衍生因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子-2、前列腺素 H-2、熱休蛋白 90a、親環素等，促進血管重構。此外，缺氧能誘導外膜成纖維細胞釋放多種生長因子和細胞因子，如 TGF-β[10]、血管內皮生長因子[11]、成纖維細胞生長因子-2[12]等，其中 TGF-β1 是體內最強且最廣泛的促纖維化介質之一。研究表明，TGF-β 能誘導血管外膜中的成纖維細胞轉化為有合成分泌細胞外基質功能的成纖維細胞，及誘導成纖維細胞增殖與遷移[13-15]，從而促進肺動脈高壓中肺血管重構過程[16-17]。而抑制 TGF-β1 的上述作用可減輕血管重構的發生[18-19]。越來越多的證據表明，外膜成纖維細胞在血管重構中并不是“旁觀者”，如何抑制低氧環境下外膜成纖維細胞的異常活化可能是控制低氧性肺血管重構的關鍵問題。
本研究結果顯示，低氧可刺激外膜成纖維細胞增殖。脯氨酸是膠原蛋白合成的重要底物，故常規應用同位素標記的3H-脯氨酸作為示蹤劑來研究膠原代謝。我們發現低氧刺激后成纖維細胞3H-脯氨酸摻入率較常氧組明顯增加，提示低氧條件下外膜成纖維細胞膠原合成明顯增加，伴隨著細胞增殖的細胞外基質沉積導致外膜增厚是缺氧性肺動脈高壓血管壁重塑的主要特征。本研究結果進一步證實外膜成纖維細胞在血管重構中并不是“旁觀者”。
HIF-1α 是缺氧誘導下各種缺氧相關因子表達的關鍵轉錄因子[20]。HIF-1α 幾乎在人體及大鼠的所有器官均有表達，而低氧后肺組織 HIF-1α 表達明顯增加。低氧不僅能夠上調肺動脈平滑肌細胞內 HIF-1α 的表達[21]，而且明顯上調外膜 HIF-1α 以及 HIF-2α 的表達[22]。敲除 HIF-1α 的大鼠在低氧環境下血管重塑減輕且肺動脈高壓的發病幾率降低，提示 HIF-1α 參與了低氧誘導的血管重塑和肺動脈高壓的形成[23]，但其作用機制尚不清楚。有研究表明低氧時 HIF-1α 可能通過上調血管內皮生長因子、TGF-β1 等表達，在低氧性肺動脈高壓發病中起到重要作用[24-25]。
YC-1 是 HIF-1α 的特異性抑制劑，具有很好的保護血管平滑肌受損活性、抗血管新生及抗腫瘤活性[26]。本研究發現，低氧能夠促進 HIF-1α 和 TGF-β1 mRNA 的表達，加入不同濃度的 YC-1 干預后，YC-1 在抑制 HIF-1α 表達的同時也部分抑制了 TGF-β1 mRNA 的表達。同時，YC-1 呈濃度依賴方式抑制低氧條件下成纖維細胞增殖以及3H-脯氨酸摻入率。以上結果提示 YC-1 可抑制低氧條件下成纖維細胞的增殖以及膠原合成功能。由此推測，低氧條件下 YC-1 抑制成纖維細胞增殖及膠原合成的機制可能與 HIF-1α 和 TGF-β1 的下調有關。但 HIF-1α 與 TGF-β1 之間如何相互作用，以及是否通過信號通路相互作用仍未得到證實，有待于下一步深入探究。
低氧性肺動脈高壓是慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）、間質性肺疾病等眾多心肺疾病發生發展中的重要病理生理環節，而肺血管重構是低氧性肺動脈高壓形成的重要標志[1]，其發病機制目前尚不清楚。以往在低氧性肺血管重構機制的研究中，外膜成纖維細胞的作用往往被忽略，認為外膜只是一種支持組織，為中膜提供營養。而新近研究表明外膜成纖維細胞在調節血管功能中發揮著重要的作用[2-3]。血管外膜中的成纖維細胞是首先感受低氧刺激的細胞，是感受刺激并在此合成儲存和釋放調節血管壁功能的關鍵因子[4]。低氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α）作為人體組織細胞最主要的低氧應答調控因子，在很多缺氧性疾病中具有重要作用。HIF-1α 可能與低氧性肺動脈高壓發病機制密切有關，但目前其信號調控機制尚不清楚。3-（5'-羥基甲基-2'-呋喃基）-1-苯基吲哚［3-（5'-hydroxymethyl-2'-furyl）-1-benzylindazole，YC-1］為靶向 HIF-1α 抑制劑，可抑制低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖。本研究擬觀察 YC-1 對低氧誘導的大鼠肺動脈外膜成纖維細胞增殖及膠原生成的影響，以及可能的分子機制。
1 材料與方法
1.1 材料
健康雄性 Wistar 大鼠，體重（220±20）g（中國人民解放軍武漢總醫院實驗動物中心提供）。胰蛋白酶、MTT（美國 Sigma 公司），YC-1 粉末（瑞士 Alexis 公司），DMEM 培養基（GIBCO 公司）；3H-脯氨酸（中國原子能研究院同位素研究所）。TRIzol 試劑（美國 Invitrogen 公司），轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、β-肌動蛋白（β-actin）引物（上海博亞生物技術有限公司），脫氧核糖核苷酸（dNTP）、TaqDNA 聚合酶、AMV 反轉錄酶（Promega 公司），抗 HIF-1α 多克隆抗體（美國 Santa Cruz 公司）；辣根過氧化物酶標記羊抗兔 IgG 抗體（北京中山生物技術有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 成纖維細胞培養及鑒定
取 Wistar 大鼠斷頭處死，常規消毒后取出肺動脈，在解剖顯微鏡下剪去肺動脈外周組織，然后縱向剖開血管并平鋪于培養皿中，輕輕刮除內膜，仔細分離中膜和外膜。將分離后的外膜剪碎，均勻鋪置于培養皿底部，待組織塊稍干燥后，用含 20% 胎牛血清的 DMEM 液培養，放置于 5% CO2、37℃、95% 濕度的恒溫箱中培養。每 3 d 用 20% 胎牛血清的 DMEM 培養液換液 1 次。5～7 d 后細胞生長至 80%～90% 融合狀態時，用 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化，傳代。實驗選用 3～5 代細胞。
1.2.2 實驗分組
常氧組：5% CO2，21% O2，培養 24 h。低氧組：5% CO2，5% O2，培養 24 h。低氧+不同濃度 YC-1 組（0.01、0.05 和 0.1 mmol/L）：先低氧條件下培養 24 h，再加入不同濃度 YC-1 培養 24 h。
1.2.3 MTT 法檢測外膜成纖維細胞增殖
將消化下來的成纖維細胞密度調整到 1×104 個/ml，200 μl/孔接種于 96 孔板，置于 37℃，5% CO2 恒溫培養箱中孵育 24 h。吸去培養基以 PBS 100 μl/孔洗孔 2 次，繼續培養 24 h 后按實驗分組施予干預因素。每組均 6 孔。置于培養箱培養 24 h 后，加入 5 g/L MTT 溶液 20 μl/孔，放入 CO2 孵育箱培養 4 h，小心吸去培養液和 MTT，加入 DMSO 200 μl/孔，振蕩 10 min，使結晶充分溶解，在酶標儀上（波長 490 nm）測定各孔吸光度值。
1.2.4 成纖維細胞的膠原合成功能測定
以 3H-脯氨酸摻入率反映成纖維細胞膠原合成功能。取對數生長期成纖維細胞，0.25% 胰酶消化，用含 10% 胎牛血清的 DMEM 調整細胞懸液濃度為 2.5×104/ml，加入 96 孔培養板中，每孔加入 200 μl，靜置培養至細胞接近融合。棄上清，加入無血清 DMEM，繼續培養 24 h，使細胞維持生長靜止狀態。分別加入干預試劑。在最后干預藥物加入的同時加入 3H-脯氨酸 2 μCi/ml 和維生素 C 50 mg/L，12 h 后吸棄上清液，PBS 輕洗，再用 0.25% 胰蛋白酶消化細胞呈細胞懸液，多頭細胞收集器收集細胞至玻璃纖維濾紙上，烤干。將玻璃纖維濾紙置于閃爍計數管中，每管加入閃爍液 0.5 ml，液態閃爍計數儀測定放射性強度。
1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測 HIF-1α 蛋白表達
將成纖維細胞接種于培養皿中，按實驗分組施予不同干預因素予以培養 24 h。棄去培養皿中的培養基，用冷 PBS 溶液洗 2 次，加入適量細胞裂解液，收集細胞于 Eppendorf 管中，離心后收集上清液。考馬斯亮藍染色法（Bradford）測蛋白濃度，取相同量蛋白用于 10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至聚偏二氟乙烯膜，然后用 5% 脫脂奶粉封閉，37℃ 振搖 2 h 后 4℃ 過夜，第 2 d 洗膜 2 次后加入抗 HIF-1α 抗體稀釋液（1∶1 000），37℃ 振搖 2 h，洗膜 2 次，加入羊抗兔 HRP 抗體稀釋液 37℃ 振搖 1 h，同前法洗膜 4 次，加 ECL 熒光劑，壓片顯影。用 GENETools 軟件對結果進行分析。
1.2.6 逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測 TGF-β1 mRNA 表達
按上述分組培養 24 h 后，用試劑裂解細胞并提取細胞總 RNA，反轉錄合成 cDNA，以適量 cDNA 為模板進行聚合酶鏈反應擴增。以 β-actin 為內參照。TGF-β1 上游引物：5'-GTCATAGATTGCATTGTTGC-3'，下游引物：5'-AAGGAGACGGAATACAGGG-3'，產物 301 bp。β-actin 上游引物：5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'，下游引物：5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，產物 541 bp；循環條件：94℃、5 min 后，94℃ 變性 1 min，59℃ 退火 45 s，72℃ 延伸 1 min，30 個循環后再 72℃ 延伸 10 min。擴增產物于含溴化乙錠的 2% 瓊脂糖凝膠進行電泳。用凝膠成像分析系統（GENE GENIVS）攝像分析。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 19.0 統計軟件。所有實驗數據以均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用 t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 不同濃度 YC-1 對低氧誘導的大鼠肺動脈外膜成纖維細胞增殖的影響
低氧誘導下，外膜成纖維細胞 MTT 的吸光度值為 270.59±22.32，與常氧組（110.00±30.81）相比，差異有統計學意義（P<0.01）。低氧誘導后加入不同濃度（0.01 mmol/L、0.05 mmol/L、0.1 mmol/L）YC-1 作用 24 h，成纖維細胞 MTT 的吸光度值分別為 224.37±40.92、186.08±80.42、143.55±62.56，隨著 YC-1 刺激濃度的增高，成纖維細胞 MTT 的吸光度值呈遞減趨勢，且明顯低于低氧組（均P<0.01）。
2.2 不同濃度 YC-1 對低氧誘導的大鼠肺動脈外膜成纖維細胞膠原合成的影響
低氧誘導下，外膜成纖維細胞膠原的合成明顯增加，3H-脯氨酸摻入率為（650±22.3）cpm/2 000 細胞，與常氧組［（302±30.8）cpm/2 000 細胞］相比，差異有統計學意義（P<0.01）。低氧誘導后加入不同濃度（0.01 mmol/L、0.05 mmol/L、0.1 mmol/L）YC-1 作用 24 h，成纖維細胞3H-脯氨酸摻入率分別為（514.0±16.4）、（431.0±26.0）和（350.0±30.1）cpm/2 000 細胞，隨著 YC-1 刺激濃度的增高，成纖維細胞的 3H-脯氨酸摻入率呈遞減趨勢，明顯低于低氧組（均 P<0.01）。
2.3 不同濃度 YC-1 對低氧誘導的大鼠肺動脈外膜成纖維細胞 HIF-1α 蛋白表達的影響
蛋白免疫印跡結果顯示，成纖維細胞表達少量 HIF-1α，低氧刺激后 HIF-1α 表達明顯上調，較對照組升高 4.1 倍（P<0.01）。YC-1 呈劑量依賴性抑制由缺氧刺激的 HIF-1α 表達，其中 YC-1（0.05 mmol/L）組和 YC-1（0.1 mmol/L）組與低氧組相比，HIF-1α 表達分別抑制了 46% 和 65%（均P<0.01）。結果見圖 1。
圖1
不同濃度 YC-1 對低氧條件下 HIF-1α 蛋白表達的影響
a. 蛋白免疫印跡檢測像；b. 蛋白相對表達量。1：常氧組；2：低氧組；3～5：不同濃度 YC-1 組（0.01、0.05、0.1 mmol/L）。與常氧組比較，#
2.4 YC-1 對低氧條件下的 TGF-β1 mRNA 表達的影響
常氧組細胞僅有極少量 TGF-β1 mRNA 表達，經低氧刺激，TGF-β1 mRNA 表達明顯上調。YC-1 呈劑量依賴性抑制由低氧刺激的 TGF-β1 mRNA 表達，其中 YC-1（0.1 mmol/L）組與對照組相比抑制了 61%，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見圖 2。
圖2
不同濃度 YC-1 對低氧條件下 TGF-β1 mRNA 表達的影響
a. 逆轉錄-聚合酶鏈反應擴增產物凝膠電泳像；b. mRNA 相對表達量。1：常氧組；2：低氧組；3～5：不同濃度 YC-1 組（0.01、0.05、0.1 mmol/L）；M：Marker。與常氧組比較，#
3 討論
抑制低氧性肺血管重塑的形成是治療低氧性肺動脈高壓的關鍵。低氧性肺血管重塑是多種細胞參與、多種因素共同作用的結果，除了內膜增厚、中膜平滑肌細胞增殖肥大外，外膜成纖維細胞的活化、增殖、遷移在其中也扮演著重要角色[5-6]。以往在低氧性肺血管重構機制的研究中，外膜的作用往往被忽略。新近研究表明，血管外膜特別是其中的成纖維細胞在調節血管功能中發揮著重要的作用。低氧不僅能誘導肺動脈外膜成纖維細胞表型轉化及增殖，而且外膜中成纖維細胞的增殖反應較中層平滑肌細胞發生更早[7]，因此，外膜成纖維細胞可能是感受低氧的始動因素[8-9]。低氧環境中成纖維細胞在活性氧的誘導下可釋放大量能影響血管緊張度的介質，包括內皮素-1、血小板衍生因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子-2、前列腺素 H-2、熱休蛋白 90a、親環素等，促進血管重構。此外，缺氧能誘導外膜成纖維細胞釋放多種生長因子和細胞因子，如 TGF-β[10]、血管內皮生長因子[11]、成纖維細胞生長因子-2[12]等，其中 TGF-β1 是體內最強且最廣泛的促纖維化介質之一。研究表明，TGF-β 能誘導血管外膜中的成纖維細胞轉化為有合成分泌細胞外基質功能的成纖維細胞，及誘導成纖維細胞增殖與遷移[13-15]，從而促進肺動脈高壓中肺血管重構過程[16-17]。而抑制 TGF-β1 的上述作用可減輕血管重構的發生[18-19]。越來越多的證據表明，外膜成纖維細胞在血管重構中并不是“旁觀者”，如何抑制低氧環境下外膜成纖維細胞的異常活化可能是控制低氧性肺血管重構的關鍵問題。
本研究結果顯示，低氧可刺激外膜成纖維細胞增殖。脯氨酸是膠原蛋白合成的重要底物，故常規應用同位素標記的3H-脯氨酸作為示蹤劑來研究膠原代謝。我們發現低氧刺激后成纖維細胞3H-脯氨酸摻入率較常氧組明顯增加，提示低氧條件下外膜成纖維細胞膠原合成明顯增加，伴隨著細胞增殖的細胞外基質沉積導致外膜增厚是缺氧性肺動脈高壓血管壁重塑的主要特征。本研究結果進一步證實外膜成纖維細胞在血管重構中并不是“旁觀者”。
HIF-1α 是缺氧誘導下各種缺氧相關因子表達的關鍵轉錄因子[20]。HIF-1α 幾乎在人體及大鼠的所有器官均有表達，而低氧后肺組織 HIF-1α 表達明顯增加。低氧不僅能夠上調肺動脈平滑肌細胞內 HIF-1α 的表達[21]，而且明顯上調外膜 HIF-1α 以及 HIF-2α 的表達[22]。敲除 HIF-1α 的大鼠在低氧環境下血管重塑減輕且肺動脈高壓的發病幾率降低，提示 HIF-1α 參與了低氧誘導的血管重塑和肺動脈高壓的形成[23]，但其作用機制尚不清楚。有研究表明低氧時 HIF-1α 可能通過上調血管內皮生長因子、TGF-β1 等表達，在低氧性肺動脈高壓發病中起到重要作用[24-25]。
YC-1 是 HIF-1α 的特異性抑制劑，具有很好的保護血管平滑肌受損活性、抗血管新生及抗腫瘤活性[26]。本研究發現，低氧能夠促進 HIF-1α 和 TGF-β1 mRNA 的表達，加入不同濃度的 YC-1 干預后，YC-1 在抑制 HIF-1α 表達的同時也部分抑制了 TGF-β1 mRNA 的表達。同時，YC-1 呈濃度依賴方式抑制低氧條件下成纖維細胞增殖以及3H-脯氨酸摻入率。以上結果提示 YC-1 可抑制低氧條件下成纖維細胞的增殖以及膠原合成功能。由此推測，低氧條件下 YC-1 抑制成纖維細胞增殖及膠原合成的機制可能與 HIF-1α 和 TGF-β1 的下調有關。但 HIF-1α 與 TGF-β1 之間如何相互作用，以及是否通過信號通路相互作用仍未得到證實，有待于下一步深入探究。
