引用本文： 陳小菊, 周智, 余成秀, 陳永, 劉琴, 陳培. S100A8和S100A9在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細胞中的表達及促炎作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(11): 804-809. doi: 10.7507/1671-6205.202206051 復制
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，其發病率和致殘率均較高[1]。慢阻肺的發生發展與氣道和肺組織對煙霧和煙草等有害氣體、有害顆粒的慢性炎癥反應有關，其發病的核心機制是多種炎癥細胞及其產生的炎癥因子參與的慢性炎癥。其中，肺泡巨噬細胞（alveolar macrophage，AM）在慢阻肺氣道炎癥的發生發展過程中發揮了重要的作用[2]。S100蛋白家族是具有高度同源性的一組低分子鈣結合蛋白。S100A8和S100A9是S100蛋白家族中兩個重要成員，多以異源二聚體的形式存在而發揮其生物活性作用[3-4]。S100A8和S100A9不僅參與花生四烯酸代謝、骨髓細胞成熟、細胞遷移等生物學過程，還參與炎癥、腫瘤等多種生物學過程[5-7]。我們前期的實驗已經發現慢阻肺大鼠肺組織中S100A8 mRNA、S100A9 mRNA和S100A8/A9蛋白表達較正常對照組大鼠增強[8]，為進一步了解S100A8、S100A9在離體培養的慢阻肺大鼠AM中的表達及促炎作用，我們分離并培養了慢阻肺大鼠AM和正常大鼠AM，比較兩組大鼠AM中S100A8 mRNA、S100A9 mRNA和S100A8/A9蛋白的表達情況。并給予不同劑量的S100A8、S100A9處理大鼠AM 6 h和12 h，觀察大鼠AM上清液中炎癥介質水平。
1 材料與方法
1.1 材料
實驗動物：12只雄性無特定病原級Wistar大鼠，8周齡，體重190～210 g，購買于川北醫學院實驗動物中心［資質號：SCXK（川）2018-18］，于自然光照條件下統一喂養，均自由飲水和攝食。
主要試劑及儀器：紅梅牌香煙購自云南玉溪煙卷廠、內毒素購自Sigma公司，重組S100A8、S100A9蛋白購自北京義翹神州生物科技有限公司，大鼠白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8和腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）的酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司，鼠抗S100A8/A9單抗購自Abcam公司，S100A8和S100A9原位雜交檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 動物模型制備
大鼠飼養于川北醫學院實驗動物中心［資質號：SCXK（川）2018-18］，飼養1周后將其隨機分成慢阻肺組和正常對照組。慢阻肺大鼠模型的制備參照陳延偉等[9]的實驗方法，慢阻肺組大鼠被放入自制的有機玻璃煙熏箱內，每日兩次被動吸煙，每次30 min，每次給予10支紅梅牌香煙（焦油12 mg、煙堿1.1 mg、煙氣CO含量12.5 mg），共1個月。慢阻肺組大鼠在煙熏第1天和第14天時經氣管內注射內毒素（200 mg/kg）。
1.2.2 支氣管肺泡灌洗液和肺組織的收集
給予腹腔內注射3%戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉大鼠，暴露其氣管并結扎右肺，經第4、第5氣管軟骨之間插入外徑約1.8 mm的輸液管于氣管內，然后將4 mL預熱至37 ℃的生理鹽水注入左肺，2 min后回抽支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），重復5次，收集所有BALF。采用臺盼藍染色檢測BALF中細胞活力，瑞氏染色對細胞進行分類和計數，剩余BALF用于AM的培養。
1.2.3 大鼠肺組織標本的制備
取大鼠的部分右肺，將其置于4%的多聚甲醛中，固定24 h后進行石蠟包埋并切片，然后進行蘇木精–伊紅染色觀察大鼠肺組織病理形態。
1.2.4 AM的培養及處理
參照既往培養AM的方法[10]，用無菌單層的200目細胞篩過濾BALF并收集之，混勻BALF，然后于4 ℃、1500 r/min離心10 min，用PBS洗滌細胞沉淀2次，將含10%胎牛血清和青、鏈霉素各100 U/mL的高糖DMEM培養液加入細胞沉淀制成單細胞懸液。將AM單細胞懸液分別接種于12孔板和24孔板中，每孔500 μL，12孔板中預先放置無菌的被賴氨酸包被的蓋玻片，然后將其放入細胞培養箱中培養，2 h后取出細胞培養板并洗去未貼壁的細胞；然后將無血清的DMEM高糖培養基加入24孔板中，每孔500 μL，再依次在24孔板中分別加入5 ng、50 ng、500 ng的S100A8、S100A9。將含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基加入12孔板中，每孔1 mL；將所有細胞培養板放入培養箱中繼續培養。繼續培養6 h和12 h后，取出24孔板，收集細胞上清液，立即離心10 min（1500 r/min），收集離心后的細胞上清液，并保存于–80 ℃冰箱。24 h后取出12孔板，去掉上清液，用PBS洗滌細胞，然后加入1 mL 4%的多聚甲醛固定20 min，取出蓋玻片，將其自然風干，然后置于–20 ℃冰箱備用。
1.2.5 兩組大鼠AM上清液中細胞因子水平檢測
采用ELISA方法檢測經不同劑量S100A8、S100A9處理的AM上清液中IL-8、IL-6和TNF-α的含量，其操作按照試劑盒說明書進行。
1.2.6 兩組大鼠AM中S100A8/A9蛋白表達檢測
采用SABC法檢測兩組大鼠AM中S100A8/A9蛋白表達，按試劑盒的說明書進行操作，S100A8/A9單抗濃度為1∶200時效果最佳，DAB顯色后，采用蘇木素套染，棕黃色為陽性結果。在OLYMPUS DP70顯微鏡下觀察并采圖，每張細胞爬片隨機采圖5張，用圖像分析系統Image-Pro Plus 6.0檢測每張圖像的平均光密度值，計算平均值作為該標本AM中S100A8/A9蛋白表達含量。
1.2.7 兩組大鼠AM中S100A8、S100A9 mRNA的表達檢測
采用原位雜交方法檢測兩組大鼠AM中S100A8、S100A9 mRNA的表達，按試劑盒說明書進行操作，陽性結果呈棕黃色，S100A8、S100A9 mRNA的表達量判斷及計算同蛋白表達檢測。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件，呈正態分布的計量資料采用均數±標準差（
±s）表示。采用t檢驗進行兩組獨立樣本之間的比較；采用單因素方差分析進行多組樣本各組間總差異比較，兩組間差異比較采用q檢驗。檢驗水準設為α=0.05。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 兩組大鼠的肺組織病理形態學觀察
正常對照組大鼠氣道黏膜的柱狀上皮結構完整，纖毛排列十分整齊，肺泡結構正常且完整（圖1a）；慢阻肺組大鼠氣道黏膜纖毛柱狀上皮細胞部分變形、脫落，甚至壞死；支氣管黏膜下腺體增生，支氣管平滑肌細胞增生肥大；炎癥細胞浸潤各級支氣管管壁，多數支氣管管壁增厚，部分狹窄、甚至堵塞。肺泡壁以及肺泡間隔變薄，部分肺泡間隔斷裂；肺泡結構較紊亂，部分肺泡擴張，甚至可見肺泡破裂融合成肺大皰（圖1b和1c）。
圖1
大鼠肺組織病理像（蘇木精 –伊紅×200）
a. 正常對照組：氣道黏膜上皮細胞結構完整，纖毛排列整齊，肺泡結構正常完整；b. 慢阻肺組：氣道黏膜纖毛上皮細胞部分變形、脫落、壞死，黏膜下見大量炎癥細胞浸潤；c. 慢阻肺組：肺泡結構紊亂，肺泡間隔變薄、斷裂，肺泡壁變薄、破裂，部分肺泡融合。
2.2 兩組大鼠BLAF的細胞分類及計數
慢阻肺組大鼠BLAF中細胞總數、AM、中性粒細胞及淋巴細胞數量均高于正常對照組，差異有統計學意義（均P<0.05），其中細胞分類中AM數量升高最為明顯，結果見表1。
表1
兩組大鼠BALF中炎癥細胞數及細胞總數比較［×108/L，n=6，（
）］
2.3 S100A8、S100A9處理兩組大鼠AM后上清液中IL-6、IL-8、TNF-α含量變化
給予不同劑量的S100A8、S100A9處理慢阻肺大鼠AM，慢阻肺大鼠AM上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的含量均隨著S100A8、S100A9劑量增加而逐漸增加。各劑量組與0 ng組比較，差異均有統計學意義（均P<0.05）。各劑量組之間兩兩比較，差異也有統計學意義（均P<0.05），提示S100A8、S100A9呈劑量依賴性促進慢阻肺大鼠AM分泌IL-6、IL-8和TNF-α。結果見表2。
表2
不同劑量S100A8、S100A9對慢阻肺大鼠AM分泌IL-6、IL-8和TNF-α的影響［n=6，（
）］
給予一定劑量S100A8、S100A9處理慢阻肺大鼠AM 6 h和12 h比較，12 h后慢阻肺大鼠AM上清液中IL-6、IL-8和TNF-α含量較6 h明顯增加，差異有統計學意義（均P<0.05），提示在12 h之內，S100A8、S100A9呈時間依賴性促進慢阻肺大鼠AM分泌IL-6、IL-8和TNF-α。結果見表2。
相同劑量的S100A8、S100A9處理慢阻肺組和正常對照組大鼠AM相同時間比較，慢阻肺組大鼠AM上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的含量均高于正常對照組，差異有統計學意義（均P<0.05），提示S100A8、S100A9促進慢阻肺大鼠AM分泌IL-6、IL-8和TNF-α的作用明顯強于正常大鼠AM。結果見圖2。
圖2
不同劑量S100A8、S100A9處理兩組大鼠AM不同時間細胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的水平比較
a. S100A8處理兩組大鼠AM 6 h后細胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的水平比較；b. S100A8處理兩組大鼠AM 12 h細胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的水平比較；c. S100A9處理兩組大鼠AM 6 h后細胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的水平比較；d. S100A9處理兩組大鼠AM 12 h細胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的水平比較。
2.4 兩組大鼠AM中S100A8/A9蛋白表達
免疫組化結果顯示S100A8/A9蛋白主要表達在正常大鼠和慢阻肺大鼠AM細胞膜和細胞質中。進一步統計分析顯示，與正常對照組比較，慢阻肺組大鼠AM中S100A8/A9蛋白的表達明顯增強，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表3和圖3。
表3
兩組大鼠AM中S100A8/A9蛋白及S100A8、S100A9 mRNA 表達［n=6，（
）］
圖3
大鼠AM病理像（免疫組織化學×400）
a. 正常對照組：S100A8/A9在AM中表達相對較弱；b.慢阻肺組：S100A8/A9在AM中表達明顯增加。
2.5 兩組大鼠AM中S100A8、S100A9 mRNA表達
原位雜交結果顯示S100A8、S100A9 mRNA主要在大鼠AM細胞膜與細胞質中表達。進一步統計分析顯示，慢阻肺組大鼠AM中S100A8、S100A9 mRNA的表達量較正常對照組增強，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表3和圖4。
圖4
大鼠AM病理像（原位雜交×400）
a. 正常對照組：S100A8 mRNA在AM中表達相對較弱；b. 慢阻肺組：S100A8 mRNA在AM中表達明顯增加；c. 正常對照組：S100A9 mRNA在AM中表達相對較弱；d. 慢阻肺組：S100A9 mRNA在AM中表達明顯增加。
3 討論
本實驗研究發現慢阻肺組大鼠氣道黏膜纖毛柱狀上皮細胞部分變形、脫落，甚至壞死；支氣管黏膜下腺體增生，支氣管管壁平滑肌細胞增生肥大，多數支氣管管壁增厚，部分狹窄、甚至堵塞，炎癥細胞浸潤各級支氣管管壁。肺泡結構較紊亂，肺泡壁以及肺泡間隔變薄，甚至斷裂；部分肺泡擴張，甚至破裂融合成肺大皰，上述病理形態學表現符合慢阻肺的病理改變。我們前期的實驗經圖像分析系統檢測發現慢阻肺組大鼠肺氣腫已經形成[8]。說明本實驗采用的煙熏聯合氣管內注射內毒素方法可以成功建立慢阻肺大鼠模型。李曉丹等[11]采用同樣的方法對大鼠處理1個月，用肺功能檢測證實此方法可成功建立慢阻肺大鼠模型，這也與陳延偉等[9]和楊玲玲等[12]的研究結果一致。
本研究發現慢阻肺組大鼠BLAF中中性粒細胞、AM、淋巴細胞數量均明顯高于正常對照組，其中AM計數升高最明顯，說明AM是慢阻肺肺部炎癥的重要細胞。S100A8、S100A9是S100蛋白家族的主要成員，多以異源二聚體S100A8/A9形式存在[3-4]。既往研究發現S100A8/A9主要分布在單核細胞和中性粒細胞中[13]。本實驗慢阻肺組大鼠AM內S100A8、S100A9 mRNA和S100A8/A9蛋白表達均明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。這說明S100A8、S100A9不僅可以在大鼠AM中表達，而且煙熏加氣管內注射內毒素可誘導大鼠AM S100A8、S100A9 mRNA和S100A8/A9蛋白表達明顯增多，進一步從細胞層面提示S100A8、S100A9參與了慢阻肺的發生發展。本研究顯示給予不同劑量的S100A8、S100A9處理離體培養的慢阻肺大鼠AM不同時間，慢阻肺大鼠AM上清液中IL-8、IL-6和TNF-α的含量隨著S100A8、S100A9劑量和時間增加則逐漸增加，提示S100A8、S100A9呈劑量和時間依賴性促進慢阻肺大鼠AM分泌炎癥介質IL-8、IL-6和TNF-α增加。同時，在相同劑量的S100A8、S100A9作用大鼠AM相同時間時，慢阻肺組大鼠AM上清液中IL-8、IL-6和TNF-α的含量均高于正常對照組大鼠AM（P<0.05），說明S100A8、S100A9促進慢阻肺大鼠AM分泌IL-8、IL-6和TNF-α作用強于正常大鼠AM。既往研究發現S100A8/A9具有較強的趨化活性，不僅自身可以誘導大量巨噬細胞和白細胞向炎癥部位聚集，而且可以上調趨化因子CXCL1轉錄和表達，進一步黏附和趨化中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞至炎癥部位，同時S100A8/A9還可以促進炎癥細胞產生釋放大量炎癥介質，從而參與機體炎癥反應的調節[14-17]。
綜上所述，慢阻肺大鼠AM明顯增多，在慢阻肺大鼠AM中S100A8、S100A9表達則顯著增加，進而釋放入肺泡，而S100A8、S100A9可招募聚集更多的炎癥細胞至氣道和肺組織，釋放炎癥介質，導致氣道和肺組織的慢性炎癥。同時S100A8、S100A9還能促進慢阻肺大鼠AM直接分泌更多的炎癥因子IL-6、IL-8和TNF-α，進一步放大炎癥級聯反應，促進了慢阻肺氣道和肺組織炎癥的加重。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，其發病率和致殘率均較高[1]。慢阻肺的發生發展與氣道和肺組織對煙霧和煙草等有害氣體、有害顆粒的慢性炎癥反應有關，其發病的核心機制是多種炎癥細胞及其產生的炎癥因子參與的慢性炎癥。其中，肺泡巨噬細胞（alveolar macrophage，AM）在慢阻肺氣道炎癥的發生發展過程中發揮了重要的作用[2]。S100蛋白家族是具有高度同源性的一組低分子鈣結合蛋白。S100A8和S100A9是S100蛋白家族中兩個重要成員，多以異源二聚體的形式存在而發揮其生物活性作用[3-4]。S100A8和S100A9不僅參與花生四烯酸代謝、骨髓細胞成熟、細胞遷移等生物學過程，還參與炎癥、腫瘤等多種生物學過程[5-7]。我們前期的實驗已經發現慢阻肺大鼠肺組織中S100A8 mRNA、S100A9 mRNA和S100A8/A9蛋白表達較正常對照組大鼠增強[8]，為進一步了解S100A8、S100A9在離體培養的慢阻肺大鼠AM中的表達及促炎作用，我們分離并培養了慢阻肺大鼠AM和正常大鼠AM，比較兩組大鼠AM中S100A8 mRNA、S100A9 mRNA和S100A8/A9蛋白的表達情況。并給予不同劑量的S100A8、S100A9處理大鼠AM 6 h和12 h，觀察大鼠AM上清液中炎癥介質水平。
1 材料與方法
1.1 材料
實驗動物：12只雄性無特定病原級Wistar大鼠，8周齡，體重190～210 g，購買于川北醫學院實驗動物中心［資質號：SCXK（川）2018-18］，于自然光照條件下統一喂養，均自由飲水和攝食。
主要試劑及儀器：紅梅牌香煙購自云南玉溪煙卷廠、內毒素購自Sigma公司，重組S100A8、S100A9蛋白購自北京義翹神州生物科技有限公司，大鼠白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8和腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）的酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司，鼠抗S100A8/A9單抗購自Abcam公司，S100A8和S100A9原位雜交檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 動物模型制備
大鼠飼養于川北醫學院實驗動物中心［資質號：SCXK（川）2018-18］，飼養1周后將其隨機分成慢阻肺組和正常對照組。慢阻肺大鼠模型的制備參照陳延偉等[9]的實驗方法，慢阻肺組大鼠被放入自制的有機玻璃煙熏箱內，每日兩次被動吸煙，每次30 min，每次給予10支紅梅牌香煙（焦油12 mg、煙堿1.1 mg、煙氣CO含量12.5 mg），共1個月。慢阻肺組大鼠在煙熏第1天和第14天時經氣管內注射內毒素（200 mg/kg）。
1.2.2 支氣管肺泡灌洗液和肺組織的收集
給予腹腔內注射3%戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉大鼠，暴露其氣管并結扎右肺，經第4、第5氣管軟骨之間插入外徑約1.8 mm的輸液管于氣管內，然后將4 mL預熱至37 ℃的生理鹽水注入左肺，2 min后回抽支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），重復5次，收集所有BALF。采用臺盼藍染色檢測BALF中細胞活力，瑞氏染色對細胞進行分類和計數，剩余BALF用于AM的培養。
1.2.3 大鼠肺組織標本的制備
取大鼠的部分右肺，將其置于4%的多聚甲醛中，固定24 h后進行石蠟包埋并切片，然后進行蘇木精–伊紅染色觀察大鼠肺組織病理形態。
1.2.4 AM的培養及處理
參照既往培養AM的方法[10]，用無菌單層的200目細胞篩過濾BALF并收集之，混勻BALF，然后于4 ℃、1500 r/min離心10 min，用PBS洗滌細胞沉淀2次，將含10%胎牛血清和青、鏈霉素各100 U/mL的高糖DMEM培養液加入細胞沉淀制成單細胞懸液。將AM單細胞懸液分別接種于12孔板和24孔板中，每孔500 μL，12孔板中預先放置無菌的被賴氨酸包被的蓋玻片，然后將其放入細胞培養箱中培養，2 h后取出細胞培養板并洗去未貼壁的細胞；然后將無血清的DMEM高糖培養基加入24孔板中，每孔500 μL，再依次在24孔板中分別加入5 ng、50 ng、500 ng的S100A8、S100A9。將含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基加入12孔板中，每孔1 mL；將所有細胞培養板放入培養箱中繼續培養。繼續培養6 h和12 h后，取出24孔板，收集細胞上清液，立即離心10 min（1500 r/min），收集離心后的細胞上清液，并保存于–80 ℃冰箱。24 h后取出12孔板，去掉上清液，用PBS洗滌細胞，然后加入1 mL 4%的多聚甲醛固定20 min，取出蓋玻片，將其自然風干，然后置于–20 ℃冰箱備用。
1.2.5 兩組大鼠AM上清液中細胞因子水平檢測
采用ELISA方法檢測經不同劑量S100A8、S100A9處理的AM上清液中IL-8、IL-6和TNF-α的含量，其操作按照試劑盒說明書進行。
1.2.6 兩組大鼠AM中S100A8/A9蛋白表達檢測
采用SABC法檢測兩組大鼠AM中S100A8/A9蛋白表達，按試劑盒的說明書進行操作，S100A8/A9單抗濃度為1∶200時效果最佳，DAB顯色后，采用蘇木素套染，棕黃色為陽性結果。在OLYMPUS DP70顯微鏡下觀察并采圖，每張細胞爬片隨機采圖5張，用圖像分析系統Image-Pro Plus 6.0檢測每張圖像的平均光密度值，計算平均值作為該標本AM中S100A8/A9蛋白表達含量。
1.2.7 兩組大鼠AM中S100A8、S100A9 mRNA的表達檢測
采用原位雜交方法檢測兩組大鼠AM中S100A8、S100A9 mRNA的表達，按試劑盒說明書進行操作，陽性結果呈棕黃色，S100A8、S100A9 mRNA的表達量判斷及計算同蛋白表達檢測。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件，呈正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示。采用t檢驗進行兩組獨立樣本之間的比較；采用單因素方差分析進行多組樣本各組間總差異比較，兩組間差異比較采用q檢驗。檢驗水準設為α=0.05。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 兩組大鼠的肺組織病理形態學觀察
正常對照組大鼠氣道黏膜的柱狀上皮結構完整，纖毛排列十分整齊，肺泡結構正常且完整（圖1a）；慢阻肺組大鼠氣道黏膜纖毛柱狀上皮細胞部分變形、脫落，甚至壞死；支氣管黏膜下腺體增生，支氣管平滑肌細胞增生肥大；炎癥細胞浸潤各級支氣管管壁，多數支氣管管壁增厚，部分狹窄、甚至堵塞。肺泡壁以及肺泡間隔變薄，部分肺泡間隔斷裂；肺泡結構較紊亂，部分肺泡擴張，甚至可見肺泡破裂融合成肺大皰（圖1b和1c）。
圖1
大鼠肺組織病理像（蘇木精 –伊紅×200）
a. 正常對照組：氣道黏膜上皮細胞結構完整，纖毛排列整齊，肺泡結構正常完整；b. 慢阻肺組：氣道黏膜纖毛上皮細胞部分變形、脫落、壞死，黏膜下見大量炎癥細胞浸潤；c. 慢阻肺組：肺泡結構紊亂，肺泡間隔變薄、斷裂，肺泡壁變薄、破裂，部分肺泡融合。
2.2 兩組大鼠BLAF的細胞分類及計數
慢阻肺組大鼠BLAF中細胞總數、AM、中性粒細胞及淋巴細胞數量均高于正常對照組，差異有統計學意義（均P<0.05），其中細胞分類中AM數量升高最為明顯，結果見表1。
表1
兩組大鼠BALF中炎癥細胞數及細胞總數比較［×108/L，n=6，（）］
2.3 S100A8、S100A9處理兩組大鼠AM后上清液中IL-6、IL-8、TNF-α含量變化
給予不同劑量的S100A8、S100A9處理慢阻肺大鼠AM，慢阻肺大鼠AM上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的含量均隨著S100A8、S100A9劑量增加而逐漸增加。各劑量組與0 ng組比較，差異均有統計學意義（均P<0.05）。各劑量組之間兩兩比較，差異也有統計學意義（均P<0.05），提示S100A8、S100A9呈劑量依賴性促進慢阻肺大鼠AM分泌IL-6、IL-8和TNF-α。結果見表2。
表2
不同劑量S100A8、S100A9對慢阻肺大鼠AM分泌IL-6、IL-8和TNF-α的影響［n=6，（）］
給予一定劑量S100A8、S100A9處理慢阻肺大鼠AM 6 h和12 h比較，12 h后慢阻肺大鼠AM上清液中IL-6、IL-8和TNF-α含量較6 h明顯增加，差異有統計學意義（均P<0.05），提示在12 h之內，S100A8、S100A9呈時間依賴性促進慢阻肺大鼠AM分泌IL-6、IL-8和TNF-α。結果見表2。
相同劑量的S100A8、S100A9處理慢阻肺組和正常對照組大鼠AM相同時間比較，慢阻肺組大鼠AM上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的含量均高于正常對照組，差異有統計學意義（均P<0.05），提示S100A8、S100A9促進慢阻肺大鼠AM分泌IL-6、IL-8和TNF-α的作用明顯強于正常大鼠AM。結果見圖2。
圖2
不同劑量S100A8、S100A9處理兩組大鼠AM不同時間細胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的水平比較
a. S100A8處理兩組大鼠AM 6 h后細胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的水平比較；b. S100A8處理兩組大鼠AM 12 h細胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的水平比較；c. S100A9處理兩組大鼠AM 6 h后細胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的水平比較；d. S100A9處理兩組大鼠AM 12 h細胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的水平比較。
2.4 兩組大鼠AM中S100A8/A9蛋白表達
免疫組化結果顯示S100A8/A9蛋白主要表達在正常大鼠和慢阻肺大鼠AM細胞膜和細胞質中。進一步統計分析顯示，與正常對照組比較，慢阻肺組大鼠AM中S100A8/A9蛋白的表達明顯增強，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表3和圖3。
表3
兩組大鼠AM中S100A8/A9蛋白及S100A8、S100A9 mRNA 表達［n=6，（）］
圖3
大鼠AM病理像（免疫組織化學×400）
a. 正常對照組：S100A8/A9在AM中表達相對較弱；b.慢阻肺組：S100A8/A9在AM中表達明顯增加。
2.5 兩組大鼠AM中S100A8、S100A9 mRNA表達
原位雜交結果顯示S100A8、S100A9 mRNA主要在大鼠AM細胞膜與細胞質中表達。進一步統計分析顯示，慢阻肺組大鼠AM中S100A8、S100A9 mRNA的表達量較正常對照組增強，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表3和圖4。
圖4
大鼠AM病理像（原位雜交×400）
a. 正常對照組：S100A8 mRNA在AM中表達相對較弱；b. 慢阻肺組：S100A8 mRNA在AM中表達明顯增加；c. 正常對照組：S100A9 mRNA在AM中表達相對較弱；d. 慢阻肺組：S100A9 mRNA在AM中表達明顯增加。
3 討論
本實驗研究發現慢阻肺組大鼠氣道黏膜纖毛柱狀上皮細胞部分變形、脫落，甚至壞死；支氣管黏膜下腺體增生，支氣管管壁平滑肌細胞增生肥大，多數支氣管管壁增厚，部分狹窄、甚至堵塞，炎癥細胞浸潤各級支氣管管壁。肺泡結構較紊亂，肺泡壁以及肺泡間隔變薄，甚至斷裂；部分肺泡擴張，甚至破裂融合成肺大皰，上述病理形態學表現符合慢阻肺的病理改變。我們前期的實驗經圖像分析系統檢測發現慢阻肺組大鼠肺氣腫已經形成[8]。說明本實驗采用的煙熏聯合氣管內注射內毒素方法可以成功建立慢阻肺大鼠模型。李曉丹等[11]采用同樣的方法對大鼠處理1個月，用肺功能檢測證實此方法可成功建立慢阻肺大鼠模型，這也與陳延偉等[9]和楊玲玲等[12]的研究結果一致。
本研究發現慢阻肺組大鼠BLAF中中性粒細胞、AM、淋巴細胞數量均明顯高于正常對照組，其中AM計數升高最明顯，說明AM是慢阻肺肺部炎癥的重要細胞。S100A8、S100A9是S100蛋白家族的主要成員，多以異源二聚體S100A8/A9形式存在[3-4]。既往研究發現S100A8/A9主要分布在單核細胞和中性粒細胞中[13]。本實驗慢阻肺組大鼠AM內S100A8、S100A9 mRNA和S100A8/A9蛋白表達均明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。這說明S100A8、S100A9不僅可以在大鼠AM中表達，而且煙熏加氣管內注射內毒素可誘導大鼠AM S100A8、S100A9 mRNA和S100A8/A9蛋白表達明顯增多，進一步從細胞層面提示S100A8、S100A9參與了慢阻肺的發生發展。本研究顯示給予不同劑量的S100A8、S100A9處理離體培養的慢阻肺大鼠AM不同時間，慢阻肺大鼠AM上清液中IL-8、IL-6和TNF-α的含量隨著S100A8、S100A9劑量和時間增加則逐漸增加，提示S100A8、S100A9呈劑量和時間依賴性促進慢阻肺大鼠AM分泌炎癥介質IL-8、IL-6和TNF-α增加。同時，在相同劑量的S100A8、S100A9作用大鼠AM相同時間時，慢阻肺組大鼠AM上清液中IL-8、IL-6和TNF-α的含量均高于正常對照組大鼠AM（P<0.05），說明S100A8、S100A9促進慢阻肺大鼠AM分泌IL-8、IL-6和TNF-α作用強于正常大鼠AM。既往研究發現S100A8/A9具有較強的趨化活性，不僅自身可以誘導大量巨噬細胞和白細胞向炎癥部位聚集，而且可以上調趨化因子CXCL1轉錄和表達，進一步黏附和趨化中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞至炎癥部位，同時S100A8/A9還可以促進炎癥細胞產生釋放大量炎癥介質，從而參與機體炎癥反應的調節[14-17]。
綜上所述，慢阻肺大鼠AM明顯增多，在慢阻肺大鼠AM中S100A8、S100A9表達則顯著增加，進而釋放入肺泡，而S100A8、S100A9可招募聚集更多的炎癥細胞至氣道和肺組織，釋放炎癥介質，導致氣道和肺組織的慢性炎癥。同時S100A8、S100A9還能促進慢阻肺大鼠AM直接分泌更多的炎癥因子IL-6、IL-8和TNF-α，進一步放大炎癥級聯反應，促進了慢阻肺氣道和肺組織炎癥的加重。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
