大腦皮層發育畸形(Malformation of cortical development, MCD)是導致難治性癲癇的常見原因之一。隨著神經影像學、神經生理學、分子生物學、基因組學的發展, 國內外學者對MCD發病機制研究的不斷深入, 越來越多的證據表明大腦內Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)信號通道參與其中。TLR信號通道作為一種重要的炎性信號介導通道, 廣泛存在于機體各系統組織, 參與多種免疫炎性反應的發生、發展。最近的實驗研究表明, 存在于大腦組織中的TLR信號通道可能介導MCD的產生, 從而導致難治性癲癇。現就圍繞TLR信號通道與MCD關系作一綜述, 為MCD的信號通道研究提供依據
引用本文： 毛福群, 馬勛泰. Toll樣受體信號通道在大腦皮層發育畸形中的研究. 癲癇雜志, 2016, 2(3): 252-254. doi: 10.7507/2096-0247.20160047 復制
皮層發育畸形(Malformation of cortical development, MCD)是一類中樞神經系統結構異常發育性疾病，藥物、射線、遺傳、環境等任何影響胚胎期或出生后大腦神經元和膠質細胞的增殖、分化、遷移以及皮層組織的形成等原因導致的異常組織結構[1]。臨床常見的MCD包括局灶性皮質發育不良(Focal cortical dysplasia, FCD)、結節性硬化癥(Tuber sclerosis, TS)、側巨腦回癥、無腦回畸形、多小腦回、頭小畸形、神經節細胞膠質瘤(Ganglioglioma, GG)等，癥狀可表現為癲癇、精神發育遲滯、讀寫困難、精神分裂癥、孤獨癥等，病理組織以皮層結構層狀/柱狀紊亂、灰白質分界不清、灰質異位、異常神經元等為特征，影像學表現為腦回缺如/增寬、胼胝體發育不良、腦積水、皮質下條帶樣皮質異位等。隨著影像技術的進步，MCD在癲癇患者中的檢出率越來越高，且藥物治療不佳。MCD的分類至今沒有統一標準，按大腦皮層發育形成階段，Barkovich等定義MCD的分類總結見表 1 [2]。損害大腦皮層發育不同環節，可導致相同疾病。
表1
MCD分類
1 Toll樣受體簡介
1.1 Toll樣受體結構種類分布
Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)是一類模式識別受體，屬于跨膜蛋白，由富含亮氨酸重復序列組成的胞膜外區、跨膜區以及與白細胞介素1(Interleukin-1, IL-1)受體胞內區保守序列有高度同源性的胞漿區組成，廣泛存在于機體免疫器官和心、腦、肺、肝、腎等組織器官內，表達于免疫細胞、某些上皮細胞和成纖維細胞上，通過結合不同配體，發揮固有免疫作用。TLR配體來源有兩類：一是來自微生物，稱病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMP)，包括病毒、細菌肽聚糖或脂多糖(LPS)、磷壁酸(LTA)、DNA、RNA等；二是來自宿主細胞，常為胞內正常結構異位，如高遷移率族蛋白(High mobility group protein, HMGP)、骨髓相關蛋白8(Myeloid-related protein-8, MRP8)等。迄今為止在哺乳動物中至少發現了15種TLR，其中表達于人類的有TLR 1~10、TLR 14[3]。人類大腦組織中，TLRs同時表達于神經元和膠質細胞胞膜[4]。
1.2 Toll樣受體傳導途徑
根據接頭蛋白的不同，TLR信號傳導通路分為髓樣分化蛋白(MyD88)途徑和非依賴MyD88途徑。其中前者更為普遍，存在于除TLR3以外的所有TLR傳導通路中，TLR 4同時存在以上兩種傳導途徑。
1.2.1 MyD88途徑
內源性或外源性配體結合到TLR上形成復合體，通過同源性相互作用，招募接頭蛋白MyD88結合，引起復合體中IL-1R相關激酶4(Interleukin-1 receptor associ-ated kinase-4, IRAK4)磷酸化并由此激活IRAK1，使后者從復合體分離，進入胞漿與腫瘤壞死因子受體相關因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor-6, TRAF6)結合并使其活化，再序列激活核因子κB(Nuclear transcription factorκB, NF-κB)、NF-κB激酶(NF-κB-inducing kinase, NIK)、NIK抑制物，最終活化NF-κB通路。活化的NF-κB以二聚體形式進入細胞核，與相應的DNA位點結合，調控下游序列炎癥基因轉錄表達，引起IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF)等細胞因子的釋放，誘導協同刺激因子的表達，影響谷氨酸鹽受體、引發Ca2+超載、促進細胞凋亡、破壞血腦屏障(Blood brain barrier, BBB)等過程。此途徑還可激活促絲裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPKs)，產生轉錄激活因子蛋白1(Activation of transcription factor protein 1, AP1)，參與細胞增殖、分化及凋亡的調節[5, 6]。
1.2.2 非依賴MyD88途徑
存在于TLR3和TLR4傳導通路中，通過接頭蛋白TRIF結合TRAF6分子，導致一系列聯級反應，最終激活干擾素-β(Interferon-β, IFN-β)啟動子，調控下游基因表達，影響細胞生長、分化，調節免疫功能[7]。
生理狀態下，機體存在多種TLR調控機制，維持免疫反應的平衡。適度活化的信號通路可清除病原體，又防止其自身過度活化。正調控途徑包括酪氨酸激酶Btk，參與TLR2、TLR4、TLR9傳導途徑，增強下游基因表達，負調控途徑根據結合部位不同分為病原體來源、胞外、胞內、跨膜負調控因子，如sTLR4、ST2、RP105、Triad3A。
2 Toll樣受體和皮層發育畸形之間關系
在癲癇的病因學研究中，TLR信號通道因可引起炎性反應而導致癲癇。過去的動物試驗和臨床試驗都已證明了炎性反應在伴海馬硬化的顳葉癲癇中的作用，但最近的研究表明炎性反應的激活同樣見于MCD，由小膠質細胞和星型膠質細胞介導，其中后者起主要作用，同時激活IL-1、HMGP、TLR信號通道[8]。
在MCD幾種不同類型中，已檢測到不同種類的TLR蛋白改變。TLR2和TLR4可能是致MCD關聯性最強的分子。人類妊娠的21～40周是皮層腦回形成時間，最近, Prabowo等[9]在患TS的22～34周胎兒大腦病灶標本中發現，結節內巨細胞顯示出與TLR2和TLR4蛋白免疫激活，而結節旁正常的皮層細胞中卻未檢測到活性反應，提示TLR2和TLR4異常可于胚胎中后期參與了結節狀硬化復合體的形成。HMGP作為TLR的內源性配體，是一種廣泛存在細胞核的非組蛋白染色體結合蛋白，可因組織損傷、細胞凋亡或炎癥誘導轉移至細胞質中，從而與TLR2和TLR4結合產生下游效應。已有的實驗證實，在FCD以及TS復合體中，活化的星型膠質細胞內HMGP有明顯的核質異位，暗示HMGP的釋放可能直接干預了大腦正常發育過程，為TLR通道異常導致MCD形成的直接原因[10, 11]。另外有研究發現了一種體內TLR4自發突變體大鼠，有明顯大結節性皮質下異位和部分胼胝體發育不良[12]。研究者發現，TLR3表達于新生神經元和膠質細胞室周白質，可調節細胞增殖。當有白質損傷時，TLR3的表達模式可發生改變，從而影響未成熟大腦正常發育進程，包括病灶內細胞的生存、軸突的生長、皮層發育以及皮層和丘腦的聯系[13]。TLR8在神經系統內僅分布于生長過程中的錐體細胞和軸突纖維束，而軸突的生長和發展在圍產期尤其活躍。錐體細胞凋亡以及軸突生長抑制可能激活小膠質細胞或少突膠質細胞內TLR8，減少了與正常生長的少突膠質細胞營養聯系，導致本身受損的少突膠質細胞損害進一步加重，形成正反饋環，從而影響大腦正常神經元的形成，導致MCD[14]。
MCD的發生不僅見于TLR信號通路相關蛋白表達改變，也有證據顯示TLR在皮層發育過程的轉錄水平存在異常。大腦中幾種獨特的miRNA能通過影響離子通道、神經細胞遷移來控制神經膠質細胞的功能，這種在多水平控制基因和蛋白質可能是致MCD的原因。miRNA-34a、miRNA-132a、miRNA-184a、miRNA let-7b可誘導神經元死亡，miRNA-134a和癲癇耐藥有關[4]。miRNA-146a已被證明在調節TLR和IL-1信號轉導通路中起重要作用。在qPCR實驗中，GG和FCD2B與正常對照組相比，星型膠質細胞中miRNA-146a含量顯著增高，而且在MCD的標志性細胞——氣球樣細胞中也能檢測到miRNA-146a[8]。
3 小結與展望
近年來，MCD的信號通道研究成為熱點，國內外學者希望由此找到MCD發病機制的突破點，從而揭示MCD的形成原因。越來越多的相關實驗數據表明MCD的發生與TLR信號傳導通道存在相關性。研究證實，數種不同類型MCD中已檢測到不同種類的TLR蛋白表達改變，提示MCD的發生可能為TLR信號通路的某種共同中間產物的影響結果，或者整體調節信號通路的轉錄水平發生異常。目前尚無干預中間蛋白表達有關的實驗研究，如果能找到可能引起MCD的共同中間產物，藥物阻斷其表達，或者在基因水平找到可致MCD的TLR特異調控序列，并阻斷其轉錄，能否減少MCD發生，但同時是否會對機體其他系統免疫功能產生影響，結果尚不明確。仍有可能特定的MCD類型是由于特定的蛋白改變導致。和TLR相關的miRNA發生顯著改變與MCD有密切相關性，可能是通過直接影響神經干細胞的分化和遷移，還可能通過影響IRAK1、IRAK2以及TRAF6的表達而間接作用，但具體機制仍然不清楚。TLR信號通路的最終效應，是調控下游序列靶基因轉錄表達，引起炎性因子、TNF、IFN等細胞因子的釋放，TLR信號通道引起的炎癥反應也可能是MCD形成的直接原因。在皮層腦回形成時期，大腦組織中的炎性反應引發的鈣超載、細胞凋亡、BBB破壞等過程直接阻礙了正常神經元和/或膠質細胞的形成、遷移、皮層形成，從而導致永久性中樞神經系統結構改變。
其他有待回答的問題：①TLR4，被證明與多種MCD類型存在相關性，是否與其同時存在MyD88和非依賴MyD88兩種傳導途徑相關，當兩種路徑同時激活，可相互影響增大下游效應；②是否還存在尚未發現的其他TLR家族成員或配體，直接導致MCD發生；③與MCD發生的相關信號通道還有多種，包括Shh、mTOR、Reelin、TGF-β等，TLR信號通路是否和其他信號通路相互交聯共同影響導致MCD。對于這些問題的探索，將進一步加深對MCD及其相關TLR信號通路的了解，揭示MCD的發病機制，進一步為難治性癲癇的預防治療提供新思路。
皮層發育畸形(Malformation of cortical development, MCD)是一類中樞神經系統結構異常發育性疾病，藥物、射線、遺傳、環境等任何影響胚胎期或出生后大腦神經元和膠質細胞的增殖、分化、遷移以及皮層組織的形成等原因導致的異常組織結構[1]。臨床常見的MCD包括局灶性皮質發育不良(Focal cortical dysplasia, FCD)、結節性硬化癥(Tuber sclerosis, TS)、側巨腦回癥、無腦回畸形、多小腦回、頭小畸形、神經節細胞膠質瘤(Ganglioglioma, GG)等，癥狀可表現為癲癇、精神發育遲滯、讀寫困難、精神分裂癥、孤獨癥等，病理組織以皮層結構層狀/柱狀紊亂、灰白質分界不清、灰質異位、異常神經元等為特征，影像學表現為腦回缺如/增寬、胼胝體發育不良、腦積水、皮質下條帶樣皮質異位等。隨著影像技術的進步，MCD在癲癇患者中的檢出率越來越高，且藥物治療不佳。MCD的分類至今沒有統一標準，按大腦皮層發育形成階段，Barkovich等定義MCD的分類總結見表 1 [2]。損害大腦皮層發育不同環節，可導致相同疾病。
表1
MCD分類
1 Toll樣受體簡介
1.1 Toll樣受體結構種類分布
Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)是一類模式識別受體，屬于跨膜蛋白，由富含亮氨酸重復序列組成的胞膜外區、跨膜區以及與白細胞介素1(Interleukin-1, IL-1)受體胞內區保守序列有高度同源性的胞漿區組成，廣泛存在于機體免疫器官和心、腦、肺、肝、腎等組織器官內，表達于免疫細胞、某些上皮細胞和成纖維細胞上，通過結合不同配體，發揮固有免疫作用。TLR配體來源有兩類：一是來自微生物，稱病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMP)，包括病毒、細菌肽聚糖或脂多糖(LPS)、磷壁酸(LTA)、DNA、RNA等；二是來自宿主細胞，常為胞內正常結構異位，如高遷移率族蛋白(High mobility group protein, HMGP)、骨髓相關蛋白8(Myeloid-related protein-8, MRP8)等。迄今為止在哺乳動物中至少發現了15種TLR，其中表達于人類的有TLR 1~10、TLR 14[3]。人類大腦組織中，TLRs同時表達于神經元和膠質細胞胞膜[4]。
1.2 Toll樣受體傳導途徑
根據接頭蛋白的不同，TLR信號傳導通路分為髓樣分化蛋白(MyD88)途徑和非依賴MyD88途徑。其中前者更為普遍，存在于除TLR3以外的所有TLR傳導通路中，TLR 4同時存在以上兩種傳導途徑。
1.2.1 MyD88途徑
內源性或外源性配體結合到TLR上形成復合體，通過同源性相互作用，招募接頭蛋白MyD88結合，引起復合體中IL-1R相關激酶4(Interleukin-1 receptor associ-ated kinase-4, IRAK4)磷酸化并由此激活IRAK1，使后者從復合體分離，進入胞漿與腫瘤壞死因子受體相關因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor-6, TRAF6)結合并使其活化，再序列激活核因子κB(Nuclear transcription factorκB, NF-κB)、NF-κB激酶(NF-κB-inducing kinase, NIK)、NIK抑制物，最終活化NF-κB通路。活化的NF-κB以二聚體形式進入細胞核，與相應的DNA位點結合，調控下游序列炎癥基因轉錄表達，引起IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF)等細胞因子的釋放，誘導協同刺激因子的表達，影響谷氨酸鹽受體、引發Ca2+超載、促進細胞凋亡、破壞血腦屏障(Blood brain barrier, BBB)等過程。此途徑還可激活促絲裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPKs)，產生轉錄激活因子蛋白1(Activation of transcription factor protein 1, AP1)，參與細胞增殖、分化及凋亡的調節[5, 6]。
1.2.2 非依賴MyD88途徑
存在于TLR3和TLR4傳導通路中，通過接頭蛋白TRIF結合TRAF6分子，導致一系列聯級反應，最終激活干擾素-β(Interferon-β, IFN-β)啟動子，調控下游基因表達，影響細胞生長、分化，調節免疫功能[7]。
生理狀態下，機體存在多種TLR調控機制，維持免疫反應的平衡。適度活化的信號通路可清除病原體，又防止其自身過度活化。正調控途徑包括酪氨酸激酶Btk，參與TLR2、TLR4、TLR9傳導途徑，增強下游基因表達，負調控途徑根據結合部位不同分為病原體來源、胞外、胞內、跨膜負調控因子，如sTLR4、ST2、RP105、Triad3A。
2 Toll樣受體和皮層發育畸形之間關系
在癲癇的病因學研究中，TLR信號通道因可引起炎性反應而導致癲癇。過去的動物試驗和臨床試驗都已證明了炎性反應在伴海馬硬化的顳葉癲癇中的作用，但最近的研究表明炎性反應的激活同樣見于MCD，由小膠質細胞和星型膠質細胞介導，其中后者起主要作用，同時激活IL-1、HMGP、TLR信號通道[8]。
在MCD幾種不同類型中，已檢測到不同種類的TLR蛋白改變。TLR2和TLR4可能是致MCD關聯性最強的分子。人類妊娠的21～40周是皮層腦回形成時間，最近, Prabowo等[9]在患TS的22～34周胎兒大腦病灶標本中發現，結節內巨細胞顯示出與TLR2和TLR4蛋白免疫激活，而結節旁正常的皮層細胞中卻未檢測到活性反應，提示TLR2和TLR4異常可于胚胎中后期參與了結節狀硬化復合體的形成。HMGP作為TLR的內源性配體，是一種廣泛存在細胞核的非組蛋白染色體結合蛋白，可因組織損傷、細胞凋亡或炎癥誘導轉移至細胞質中，從而與TLR2和TLR4結合產生下游效應。已有的實驗證實，在FCD以及TS復合體中，活化的星型膠質細胞內HMGP有明顯的核質異位，暗示HMGP的釋放可能直接干預了大腦正常發育過程，為TLR通道異常導致MCD形成的直接原因[10, 11]。另外有研究發現了一種體內TLR4自發突變體大鼠，有明顯大結節性皮質下異位和部分胼胝體發育不良[12]。研究者發現，TLR3表達于新生神經元和膠質細胞室周白質，可調節細胞增殖。當有白質損傷時，TLR3的表達模式可發生改變，從而影響未成熟大腦正常發育進程，包括病灶內細胞的生存、軸突的生長、皮層發育以及皮層和丘腦的聯系[13]。TLR8在神經系統內僅分布于生長過程中的錐體細胞和軸突纖維束，而軸突的生長和發展在圍產期尤其活躍。錐體細胞凋亡以及軸突生長抑制可能激活小膠質細胞或少突膠質細胞內TLR8，減少了與正常生長的少突膠質細胞營養聯系，導致本身受損的少突膠質細胞損害進一步加重，形成正反饋環，從而影響大腦正常神經元的形成，導致MCD[14]。
MCD的發生不僅見于TLR信號通路相關蛋白表達改變，也有證據顯示TLR在皮層發育過程的轉錄水平存在異常。大腦中幾種獨特的miRNA能通過影響離子通道、神經細胞遷移來控制神經膠質細胞的功能，這種在多水平控制基因和蛋白質可能是致MCD的原因。miRNA-34a、miRNA-132a、miRNA-184a、miRNA let-7b可誘導神經元死亡，miRNA-134a和癲癇耐藥有關[4]。miRNA-146a已被證明在調節TLR和IL-1信號轉導通路中起重要作用。在qPCR實驗中，GG和FCD2B與正常對照組相比，星型膠質細胞中miRNA-146a含量顯著增高，而且在MCD的標志性細胞——氣球樣細胞中也能檢測到miRNA-146a[8]。
3 小結與展望
近年來，MCD的信號通道研究成為熱點，國內外學者希望由此找到MCD發病機制的突破點，從而揭示MCD的形成原因。越來越多的相關實驗數據表明MCD的發生與TLR信號傳導通道存在相關性。研究證實，數種不同類型MCD中已檢測到不同種類的TLR蛋白表達改變，提示MCD的發生可能為TLR信號通路的某種共同中間產物的影響結果，或者整體調節信號通路的轉錄水平發生異常。目前尚無干預中間蛋白表達有關的實驗研究，如果能找到可能引起MCD的共同中間產物，藥物阻斷其表達，或者在基因水平找到可致MCD的TLR特異調控序列，并阻斷其轉錄，能否減少MCD發生，但同時是否會對機體其他系統免疫功能產生影響，結果尚不明確。仍有可能特定的MCD類型是由于特定的蛋白改變導致。和TLR相關的miRNA發生顯著改變與MCD有密切相關性，可能是通過直接影響神經干細胞的分化和遷移，還可能通過影響IRAK1、IRAK2以及TRAF6的表達而間接作用，但具體機制仍然不清楚。TLR信號通路的最終效應，是調控下游序列靶基因轉錄表達，引起炎性因子、TNF、IFN等細胞因子的釋放，TLR信號通道引起的炎癥反應也可能是MCD形成的直接原因。在皮層腦回形成時期，大腦組織中的炎性反應引發的鈣超載、細胞凋亡、BBB破壞等過程直接阻礙了正常神經元和/或膠質細胞的形成、遷移、皮層形成，從而導致永久性中樞神經系統結構改變。
其他有待回答的問題：①TLR4，被證明與多種MCD類型存在相關性，是否與其同時存在MyD88和非依賴MyD88兩種傳導途徑相關，當兩種路徑同時激活，可相互影響增大下游效應；②是否還存在尚未發現的其他TLR家族成員或配體，直接導致MCD發生；③與MCD發生的相關信號通道還有多種，包括Shh、mTOR、Reelin、TGF-β等，TLR信號通路是否和其他信號通路相互交聯共同影響導致MCD。對于這些問題的探索，將進一步加深對MCD及其相關TLR信號通路的了解，揭示MCD的發病機制，進一步為難治性癲癇的預防治療提供新思路。
