引用本文： 智蘊濤, 陳曦騰, 李雁, 李筱榮, 張曉敏. 過繼轉移實驗性自身免疫性葡萄膜炎模型光相干斷層掃描與病變程度評分以及組織病理學評價的比較. 中華眼底病雜志, 2016, 32(3): 187-190. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.02.017 復制
過繼轉移實驗性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)模型小鼠眼底病變嚴重程度評價主要采用眼底炎癥評分和組織病理學評分。前者通過檢眼鏡進行二維觀察[1, 2]，不能精確評估如細胞浸潤、水腫以及視網膜結構損傷等病理組織改變；后者需要處死動物，需要的活體動物數量較大且不能縱向研究同一個體。光相干斷層掃描(OCT)可以提供實時、原位視網膜形態資料[3]。可實時監測EAU小鼠視網膜變化，檢查結果與眼底病變程度評分和病理組織學評價相一致[4, 5]。但目前對于T細胞過繼轉移小鼠EAU模型OCT評價以及其與眼底病變程度評分和病理組織檢查結果的一致性研究尚少。為此，本研究建立小鼠T細胞過繼轉移EAU模型，觀察探討OCT檢查結果與眼底病變程度評分、病理組織學評價的一致性。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康雌性C57BL/6小鼠64只，鼠齡6～8周，清潔級，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。實驗動物使用遵循國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。 感光細胞間維生素A類結合蛋白1-20多肽片段(序列GPTHL FQPSL VLDMA KVLLD)由上海生物工程股份有限公司合成；RPMI-1640培養基、胎牛血清、β巰基乙醇(美國ICN Biomedicals公司)；完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)；結核分支桿菌H37RA(美國Difco公司)。
隨機數字表法將小鼠隨機分為實驗組和對照組，分別為50、14只小鼠。T細胞過繼轉移EAU誘導，制備小鼠抗原特異性T細胞過繼轉移EAU模型[6]。對照組小鼠腹腔注射等體積磷酸鹽緩沖液。
過繼免疫后9 d開始，每3天觀察1次直至過繼免疫后60 d，實驗組和對照組各隨機選取5只小鼠行間接檢眼鏡聯合前置鏡檢查，觀察小鼠眼底炎癥情況。參照文獻[2]評分標準對炎癥反應程度進行評分。評分級別為1～4，級別處于二者之間，取平均值。總評分級別=(視網膜組織評分+視盤評分+視網膜血管評分)/3(表 1)。據此將病變程度分為發病初期、發病早期、高峰前期、高峰期、恢復期、末期，分別為過繼免疫后9、16、21、26、30、60 d；病變程度評分分別為0.5、 1.0、1.5～2.0、2.5～3.0、1.0～2.0分以及小于1.0分。
表1
EAU小鼠眼底病變程度評分標準
過繼免疫后9、11、16、21、25、30、35、40、50、60 d實驗組、對照組各隨機選取5只小鼠行OCT檢查。 小鼠腹腔注射劑量為77.0 mg/kg的氯胺酮和4.6 mg/kg 的甲苯噻嗪全身麻醉。散瞳后采用海德堡Spectralis OCT儀對視盤和病灶區橫截面分別進行掃描，以視盤為橫截面測量距視盤邊緣約1個視盤直徑(DD)的視網膜厚度(RT)，測量3次，取平均值。RT為內界膜到Bruch膜之間的距離(圖 1)。檢查時小鼠佩戴角膜接觸鏡,檢查過程中使用人工淚液保證小鼠角膜的水分和清晰度。觀察時在標準OCT鏡頭前加置+25 D鏡頭。OCT半定量評分參照Gadjanski等[4]評分系統并根據過繼轉移EAU模型小鼠主要以眼后節炎癥為主的特點，以玻璃體腔炎癥細胞的多少為標準對其進行了修訂(表 2,圖 2)。其中，極少量炎癥細胞：玻璃體腔無明顯炎癥細胞，僅有視盤以及局部病灶區可見；少量炎癥細胞：視網膜附近可見明顯炎癥細胞，未波及到玻璃體腔；中等量炎癥細胞：炎癥細胞波及到玻璃體腔；大量炎癥細胞：炎癥細胞波及到玻璃體腔且在視網膜附近形成團塊狀強反射。
圖1
RT測量示意圖。以視盤為中心，距離視盤邊緣(綠線)1 DD(黃線)視網膜內界膜到Bruch膜(紅色線之間)的距離
表2
OCT評分標準
圖2
OCT評分標準像。2A.0.0分，視網膜各層結構清晰。2B.0.5分，視網膜各層結構基本正常，玻璃體腔有極少量炎癥細胞(黃箭)。2C.1.0分，玻璃體腔有少量炎癥細胞(黃箭)。2D.2.0分，玻璃體腔有中等量炎癥細胞(黃箭)，視網膜結構紊亂(紅箭)。2E.3.0分，玻璃體腔有大量炎癥細胞(黃箭)，視網膜結構紊亂(紅箭)。GCL：神經節細胞層；IPL：內從狀層；INL：內核層；ONL：外核層；PRL：光感受器細胞層；RPE：視網膜色素上皮；CH：脈絡膜
過繼免疫后9、21、60 d，實驗組、對照組隨機選取2～3只小鼠處死，摘除眼球作石蠟病理切片。切片通過視盤平面，厚度4 μm，蘇木精-伊紅(HE)染色，參照文獻[7]標準進行病理分級(表 3)。光學顯微鏡觀察小鼠玻璃體炎癥情況及視網膜結構變化。
表3
組織學評分
采用Graph Pad Prism6統計學軟件進行統計分析處理。數據以均數±標準差(
2 結果
正常組小鼠眼底病變程度及OCT評分均為0.0分。 實驗組小鼠過繼免疫后9、11、16、21、26、30、60 d，眼底病變程度評分分別為0.0、0.5、1.0、1.5、2.5、2.0、0.5分；OCT評分分別為0.5、1.0、2.0、4.0分；30 d，玻璃體炎癥細胞減少，OCT信號恢復，OCT評分為3分；60 d，OCT評分為0.5分(圖 3)。相關性分析結果顯示，OCT評分和病變程度評分高度相關(r=0.9579，P＜0.000 1)(圖 4)。實驗組小鼠發病高峰期RT顯著增厚，約為基線的1.5倍；恢復期RT低于基線值(圖 5)。
圖3
過繼免疫后不同時間點OCT評分與眼底病變程度評分 圖 4 OCT評分與臨床評分的相關性分析，n=5 圖 5 實驗組小鼠過繼免疫后60 d RT變化，n=5 圖 6 小鼠視網膜組織光學顯微鏡像。6A.正常組小鼠，視網膜組織結構清晰。6B～6D.分別為實驗組小鼠發病初期、高峰前期、末期。發病初期視網膜結構基本正常，玻璃體腔極少量細胞浸潤(紅箭)；高峰前期，視網膜結構紊亂，玻璃體腔大量炎癥細胞，視網膜皺褶(黃箭)；恢復期視網膜滲出減少，PRL變薄(藍箭) HE 標尺：200 μm
光學顯微鏡觀察，對照組小鼠視網膜各層結構清晰(圖 6A)。實驗組小鼠發病初期，玻璃體腔有極少量炎癥細胞浸潤，視網膜結構相對正常(圖 6B)；高峰前期，視網膜水腫，玻璃體腔炎癥細胞及視網膜結構紊亂(圖 6C)；末期，可見極少量玻璃體腔炎癥細胞，視網膜萎縮變薄(圖 6D)。
3 討論
過繼轉移免疫誘導建立的葡萄膜炎模型以慢性、復發性為特點[8, 9]；C57BL/6小鼠是應用最為廣泛的小鼠品系之一，大量轉基因以及基因敲除小鼠均選用此小鼠進行研究[10, 11]。因此，本研究選用C57BL/6小鼠并采用T細胞過繼轉移建立EAU模型。
與文獻報道結果[12]一致，本研究也發現EAU模型小鼠視網膜炎癥開始集中于視盤以及周邊視網膜區域。因此，本研究采用了主要依據血管炎嚴重程度進行分級的評分系統[2]。
Gadjanski 等[4]首次報道了大鼠EAU模型的OCT表現，并同時提出大鼠EAU模型半定量OCT評分系統,認為該評分系統較眼底病變程度評分系統更敏感，且能動態監測視網膜形態學改變，建議EAU眼底病變程度評分應將OCT評分作為監測指標。但是，由于受當時技術條件限制，不能清楚辨別視網膜各 層。于是，Harimoto等[13]對OCT觀察到的玻璃體改變、視盤擴大、血管受累和視網膜結構改變這4項指標進行了細致量化，重新建立了評分標準，可以更加準確反映葡萄膜炎的嚴重程度。但該評分標準過于繁瑣，不易進行快速評估，應用受到限制。由于Gadjanski等[4]OCT評分系統主要是基于大鼠急性EAU模型制定。該模型發病特點為急性、眼前后節均有炎癥，病程較短且視網膜損傷嚴重。因此，本研究根據過繼轉移EAU模型小鼠葡萄膜炎主要以眼后節炎癥為主的特點，以玻璃體腔炎癥細胞的多少為分級標準對其進行了修訂。結果顯示，OCT評分與眼底病變程度評分呈線性相關，兩者評分一致性良好。
既往文獻報道，OCT能直接觀察活體特征，掃描損傷的確切位置[14]。本研究結果顯示，不同病程OCT檢查結果與病理組織學改變一致。此為后續實驗提供了有利條件，可以根據OCT檢查結果對同一只眼的疾病不同階段進行分析。另外，隨病程進展，RT逐漸增厚，與病理組織檢查結果亦高度一致。因此，RT可作為EAU小鼠炎癥的觀察指標。
過繼轉移實驗性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)模型小鼠眼底病變嚴重程度評價主要采用眼底炎癥評分和組織病理學評分。前者通過檢眼鏡進行二維觀察[1, 2]，不能精確評估如細胞浸潤、水腫以及視網膜結構損傷等病理組織改變；后者需要處死動物，需要的活體動物數量較大且不能縱向研究同一個體。光相干斷層掃描(OCT)可以提供實時、原位視網膜形態資料[3]。可實時監測EAU小鼠視網膜變化，檢查結果與眼底病變程度評分和病理組織學評價相一致[4, 5]。但目前對于T細胞過繼轉移小鼠EAU模型OCT評價以及其與眼底病變程度評分和病理組織檢查結果的一致性研究尚少。為此，本研究建立小鼠T細胞過繼轉移EAU模型，觀察探討OCT檢查結果與眼底病變程度評分、病理組織學評價的一致性。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康雌性C57BL/6小鼠64只，鼠齡6～8周，清潔級，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。實驗動物使用遵循國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。 感光細胞間維生素A類結合蛋白1-20多肽片段(序列GPTHL FQPSL VLDMA KVLLD)由上海生物工程股份有限公司合成；RPMI-1640培養基、胎牛血清、β巰基乙醇(美國ICN Biomedicals公司)；完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)；結核分支桿菌H37RA(美國Difco公司)。
隨機數字表法將小鼠隨機分為實驗組和對照組，分別為50、14只小鼠。T細胞過繼轉移EAU誘導，制備小鼠抗原特異性T細胞過繼轉移EAU模型[6]。對照組小鼠腹腔注射等體積磷酸鹽緩沖液。
過繼免疫后9 d開始，每3天觀察1次直至過繼免疫后60 d，實驗組和對照組各隨機選取5只小鼠行間接檢眼鏡聯合前置鏡檢查，觀察小鼠眼底炎癥情況。參照文獻[2]評分標準對炎癥反應程度進行評分。評分級別為1～4，級別處于二者之間，取平均值。總評分級別=(視網膜組織評分+視盤評分+視網膜血管評分)/3(表 1)。據此將病變程度分為發病初期、發病早期、高峰前期、高峰期、恢復期、末期，分別為過繼免疫后9、16、21、26、30、60 d；病變程度評分分別為0.5、 1.0、1.5～2.0、2.5～3.0、1.0～2.0分以及小于1.0分。
表1
EAU小鼠眼底病變程度評分標準
過繼免疫后9、11、16、21、25、30、35、40、50、60 d實驗組、對照組各隨機選取5只小鼠行OCT檢查。 小鼠腹腔注射劑量為77.0 mg/kg的氯胺酮和4.6 mg/kg 的甲苯噻嗪全身麻醉。散瞳后采用海德堡Spectralis OCT儀對視盤和病灶區橫截面分別進行掃描，以視盤為橫截面測量距視盤邊緣約1個視盤直徑(DD)的視網膜厚度(RT)，測量3次，取平均值。RT為內界膜到Bruch膜之間的距離(圖 1)。檢查時小鼠佩戴角膜接觸鏡,檢查過程中使用人工淚液保證小鼠角膜的水分和清晰度。觀察時在標準OCT鏡頭前加置+25 D鏡頭。OCT半定量評分參照Gadjanski等[4]評分系統并根據過繼轉移EAU模型小鼠主要以眼后節炎癥為主的特點，以玻璃體腔炎癥細胞的多少為標準對其進行了修訂(表 2,圖 2)。其中，極少量炎癥細胞：玻璃體腔無明顯炎癥細胞，僅有視盤以及局部病灶區可見；少量炎癥細胞：視網膜附近可見明顯炎癥細胞，未波及到玻璃體腔；中等量炎癥細胞：炎癥細胞波及到玻璃體腔；大量炎癥細胞：炎癥細胞波及到玻璃體腔且在視網膜附近形成團塊狀強反射。
圖1
RT測量示意圖。以視盤為中心，距離視盤邊緣(綠線)1 DD(黃線)視網膜內界膜到Bruch膜(紅色線之間)的距離
表2
OCT評分標準
圖2
OCT評分標準像。2A.0.0分，視網膜各層結構清晰。2B.0.5分，視網膜各層結構基本正常，玻璃體腔有極少量炎癥細胞(黃箭)。2C.1.0分，玻璃體腔有少量炎癥細胞(黃箭)。2D.2.0分，玻璃體腔有中等量炎癥細胞(黃箭)，視網膜結構紊亂(紅箭)。2E.3.0分，玻璃體腔有大量炎癥細胞(黃箭)，視網膜結構紊亂(紅箭)。GCL：神經節細胞層；IPL：內從狀層；INL：內核層；ONL：外核層；PRL：光感受器細胞層；RPE：視網膜色素上皮；CH：脈絡膜
過繼免疫后9、21、60 d，實驗組、對照組隨機選取2～3只小鼠處死，摘除眼球作石蠟病理切片。切片通過視盤平面，厚度4 μm，蘇木精-伊紅(HE)染色，參照文獻[7]標準進行病理分級(表 3)。光學顯微鏡觀察小鼠玻璃體炎癥情況及視網膜結構變化。
表3
組織學評分
采用Graph Pad Prism6統計學軟件進行統計分析處理。數據以均數±標準差(
2 結果
正常組小鼠眼底病變程度及OCT評分均為0.0分。 實驗組小鼠過繼免疫后9、11、16、21、26、30、60 d，眼底病變程度評分分別為0.0、0.5、1.0、1.5、2.5、2.0、0.5分；OCT評分分別為0.5、1.0、2.0、4.0分；30 d，玻璃體炎癥細胞減少，OCT信號恢復，OCT評分為3分；60 d，OCT評分為0.5分(圖 3)。相關性分析結果顯示，OCT評分和病變程度評分高度相關(r=0.9579，P＜0.000 1)(圖 4)。實驗組小鼠發病高峰期RT顯著增厚，約為基線的1.5倍；恢復期RT低于基線值(圖 5)。
圖3
過繼免疫后不同時間點OCT評分與眼底病變程度評分 圖 4 OCT評分與臨床評分的相關性分析，n=5 圖 5 實驗組小鼠過繼免疫后60 d RT變化，n=5 圖 6 小鼠視網膜組織光學顯微鏡像。6A.正常組小鼠，視網膜組織結構清晰。6B～6D.分別為實驗組小鼠發病初期、高峰前期、末期。發病初期視網膜結構基本正常，玻璃體腔極少量細胞浸潤(紅箭)；高峰前期，視網膜結構紊亂，玻璃體腔大量炎癥細胞，視網膜皺褶(黃箭)；恢復期視網膜滲出減少，PRL變薄(藍箭) HE 標尺：200 μm
光學顯微鏡觀察，對照組小鼠視網膜各層結構清晰(圖 6A)。實驗組小鼠發病初期，玻璃體腔有極少量炎癥細胞浸潤，視網膜結構相對正常(圖 6B)；高峰前期，視網膜水腫，玻璃體腔炎癥細胞及視網膜結構紊亂(圖 6C)；末期，可見極少量玻璃體腔炎癥細胞，視網膜萎縮變薄(圖 6D)。
3 討論
過繼轉移免疫誘導建立的葡萄膜炎模型以慢性、復發性為特點[8, 9]；C57BL/6小鼠是應用最為廣泛的小鼠品系之一，大量轉基因以及基因敲除小鼠均選用此小鼠進行研究[10, 11]。因此，本研究選用C57BL/6小鼠并采用T細胞過繼轉移建立EAU模型。
與文獻報道結果[12]一致，本研究也發現EAU模型小鼠視網膜炎癥開始集中于視盤以及周邊視網膜區域。因此，本研究采用了主要依據血管炎嚴重程度進行分級的評分系統[2]。
Gadjanski 等[4]首次報道了大鼠EAU模型的OCT表現，并同時提出大鼠EAU模型半定量OCT評分系統,認為該評分系統較眼底病變程度評分系統更敏感，且能動態監測視網膜形態學改變，建議EAU眼底病變程度評分應將OCT評分作為監測指標。但是，由于受當時技術條件限制，不能清楚辨別視網膜各 層。于是，Harimoto等[13]對OCT觀察到的玻璃體改變、視盤擴大、血管受累和視網膜結構改變這4項指標進行了細致量化，重新建立了評分標準，可以更加準確反映葡萄膜炎的嚴重程度。但該評分標準過于繁瑣，不易進行快速評估，應用受到限制。由于Gadjanski等[4]OCT評分系統主要是基于大鼠急性EAU模型制定。該模型發病特點為急性、眼前后節均有炎癥，病程較短且視網膜損傷嚴重。因此，本研究根據過繼轉移EAU模型小鼠葡萄膜炎主要以眼后節炎癥為主的特點，以玻璃體腔炎癥細胞的多少為分級標準對其進行了修訂。結果顯示，OCT評分與眼底病變程度評分呈線性相關，兩者評分一致性良好。
既往文獻報道，OCT能直接觀察活體特征，掃描損傷的確切位置[14]。本研究結果顯示，不同病程OCT檢查結果與病理組織學改變一致。此為后續實驗提供了有利條件，可以根據OCT檢查結果對同一只眼的疾病不同階段進行分析。另外，隨病程進展，RT逐漸增厚，與病理組織檢查結果亦高度一致。因此，RT可作為EAU小鼠炎癥的觀察指標。
